Mikrofokus-Röntgen-CT (microCT) Bildgebung von Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida) und Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)
6. August 2019
Hier werden Protokolle zur Durchführung von Mikrofokus-Röntgentomographie (MicroCT) von drei marinen Wirbellosen-Tieren ausführlich erläutert. In dieser Studie werden Schritte wie Probenfixierung, Färbung, Montage, Scannen, Bildrekonstruktion und Datenanalysen beschrieben. Vorschläge, wie das Protokoll für verschiedene Samples angepasst werden kann, werden ebenfalls bereitgestellt.
Micro CT wurde aufgrund ihrer Vielfalt in der Morphologie nicht weit verbreitet auf wirbellose Meerestiere angewendet. Unsere Methode ermöglicht eine einfache Montage von Proben in jedem Winkel, der für seine Morphologie geeignet ist. Es kann mit gängigen Materialien wie Wasser, Ton und Röhren durchgeführt werden, und gegebenenfalls proben mit einer Vielzahl von Formen, von einem langen Wurm bis zu einer runden Kugel.
Demonstriert wird das Verfahren von Akiteru Maeno, einem Techniker am National Institute of Genetics, Japan. Zu Beginn 0,5% Agarose vorbereiten, indem Sie 500 Milligramm Agarose in 100 Milliliter destilliertes Wasser in einem 250-Milliliter-Konuskolben auflösen und den Kolben in einer Mikrowelle mit einer Leistung von 800 Watt auflösen, um etwa ein bis drei Minuten zu erhitzen. Kühlen Sie den Kolben bei Raumtemperatur ab.
Um große Proben zu montieren, die nicht in eine 1000-Mikroliter-Mikropipette-Blauspitze passen, wie A.equina, legen Sie zuerst die gebeizte Probe in eine 60-Millimeter-Schale mit destilliertem Wasser, um übermäßige Färbungslösung von der Oberfläche abzuwaschen. In einem 50-Milliliter-Rohr, vorsichtig gießen Fünf Milliliter 0,5%Agarose ohne Blasen zu machen. Legen Sie die Röhre auf Eis, um die Agarose zu härten.
Dann 20 Milliliter 0,5%Agarose in die Röhre geben, auf Eis legen, bis die Agarose zu härten beginnt, und zangen Sie Zangen, um die Probe in die Agarose zu platzieren. Passen Sie die Position der Probe so an, dass ihre Körperachse vertikal ist. Die Agarose auf Eis härten.
Legen Sie Ton auf die microCT-Montagebühne und stellen Sie das 50-Milliliter-Rohr auf den Ton. Um kleine Proben, die in eine 1000-Mikroliter-Mikropipette-Blauspitze wie Harmothoe sp. und X.japonica passen, zu montieren, dekantieren Sie die gebeizte Probe in eine 60-Millimeter-Schale ohne Zange.
Mit Ringpinzette die Proben vorsichtig in eine weitere 60-Millimeter-Schale mit destilliertem Wasser zu übertragen, um übermäßige Färbelösung von der Oberfläche abzuwaschen. Als nächstes 100 Mikroliter 0,5%Agarose in eine 1000-Mikroliter-Mikropipette-Blauspitze aufstellen und auf Eis legen, um zu härten. Beim Umgang mit Harmothoe sp.
1000 Mikroliter 0,5%Agarose in den Agarose-Stecker in der Spitze geben. Verwenden Sie eine Ringpinzette, um Harmothoe sp. von der 60-Millimeter-Schale sanft in die Agaroselösung in der Spitze zu übertragen.
Mit einer Petiolatenadel oder einer Präzisionspinzette die Position und Ausrichtung der Harmothoe sp. so einstellen, dass die Chaetae nicht unnatürlich gebogen werden. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen vorhanden sind, und legen Sie dann die Spitze auf Eis, um die Agarose zu härten.
Wenn Sie zerbrechliche Proben wie X.japonica behandeln, verwenden Sie eine Mikropipette, um 1000 Mikroliter destilliertes Wasser mit dem gehärteten Agarose-Stecker in die blaue Spitze einzutragen. Positionieren Sie die X.Japonica im destillierten Wasser so, dass sie zwischen den Wänden der Spitze stabil ist. Für kleinere Proben kann eine 200-Mikroliter-Mikropipette-Gelbspitze verwendet werden.
In diesem Fall verwenden Sie 30 Mikroliter Agarose für den Stecker, und fügen Sie 200 Mikroliter Agarose oder destilliertes Wasser hinzu. Als nächstes schneiden Sie die Spitze von einer neuen, 1000-Mikroliter-Mikropipette-Blauspitze ab und stecken Sie die Spitze der gesteckten Spitze in die neue Spitze. Legen Sie Ton auf die microCT-Montagebühne und stellen Sie die Spitzen mit der Probe innen auf den Ton.
Schalten Sie den Röntgenstrahl sofort nach der Montage der Proben bei 80 Kilovolt und 100 Mikroamps ein. Bewegen Sie beim Beobachten des Röntgenübertragungsbildes die Bühne so, dass die gesamte Probe durch Anklicken der X- und Z-Achsentasten und durch manuelles Anpassen des Y-Achsenknopfes auf der Montagebühne sichtbar ist. Passen Sie die Kontrastbedingungen des Bildes so an, dass die inneren Strukturen beobachtet werden können.
Passen Sie die Ausrichtung der Probe an, indem Sie den Winkel des Rohres im Ton ändern. Drehen Sie die Bühne um 90 Grad, indem Sie die Rotationsachse auf 90 setzen und auf die Schaltfläche Relative Bewegung klicken. Führen Sie das gleiche Manöver viermal durch, um eine vollständige Drehung durchzuführen.
Schalten Sie den Röntgenstrahl jedes Mal, wenn die Probentür geöffnet wird, manuell aus, es sei denn, das System schaltet ihn automatisch aus. Klicken Sie nun auf die Z-Achsen-Taste und passen Sie den y-Achsenknopf manuell an, um die Montagestufe so zu bewegen, dass sich die Probe in der Mitte der Ansicht befindet. Drehen Sie die Bühne um 90 Grad und stellen Sie die Probe erneut in die Mitte ein.
Drehen Sie die Bühne noch dreimal um 90 Grad, und passen Sie sie nach Bedarf an, um sicherzustellen, dass sich die Probe aus allen Richtungen in der Mitte der Ansicht befindet. Klicken Sie als Nächstes auf die X-Achsen-Schaltfläche, um die Bühne entlang der x-Achse in Richtung der Röntgenstrahlquelle zu bewegen, um die Probe zu vergrößern, und passen Sie sie nach Bedarf an, sodass sie nur in die Ansicht passt. Drehen Sie die Bühne und passen Sie nach Bedarf an, um sicherzustellen, dass das Beispiel aus allen Richtungen in die Ansicht passt.
Passen Sie die Scanbedingungen an, und starten Sie dann mit dem Scannen. In diesem Experiment wurde die MikroCT-Bildgebung an Actinia equina, Harmothoe sp. und Xenoturbella japonica nach der Färbung mit 25%Lugols Lösung durchgeführt.
Die Färbung verbesserte erfolgreich den Kontrast der inneren Strukturen in allen Proben und ermöglichte Beobachtungen von inneren Weichteilen. Dieses Verfahren ist auch bei äußeren Schäden auf empfindliche Proben anwendbar, wie die X.japonica-Probe mit stark beschädigter Epidermis zeigt. Für Harmothoe sp wurde ein einziger hochauflösender Datensatz eines ganzen Exemplars rekonstruiert.
und X.japonica aus mehreren Scans, die an verschiedenen, aber überlappenden Teilen der Probe durchgeführt wurden. Stellen Sie sicher, dass Sie die Probe in der Röhre oder Spitze einstellen und das Rohr oder die Spitze in das microCT einkleben, damit es sich während des Scannens nicht bewegt. Die aus diesem Verfahren gewonnenen Daten können für 3D-Bildrekonstruktionen verwendet werden, so dass der Forscher sowohl die interne als auch die externe Morphologie der Probe vollständig verstehen kann.
Alle microCT-Systeme verwenden Röntgenstrahlen, aber die Besonderheiten können von System zu System unterschiedlich sein, also stellen Sie bitte sicher, dass Sie die Anweisungen jedes Systems genau befolgen.
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Übersicht
In diesem Artikel werden Protokolle für die Mikrofokus-Röntgen-Computertomographie (Micro-CT) zur Abbildung mariner Wirbelloser beschrieben. Es werden die Probenvorbereitung, einschließlich Fixierung, Färbung und Montage, sowie das Scannen und die Datenanalyse behandelt.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Meeresbiologie
- Abbildende Verfahren
Hintergrund
- Die Mikro-CT hat aufgrund der morphologischen Vielfalt begrenzte Anwendung bei marinen Wirbellosen.
- Die Methode ermöglicht eine flexible Probenaufnahme.
- Gängige Materialien können für die Probenvorbereitung verwendet werden.
- Präsentation durch Akiteru Maeno vom Nationalen Institut für Genetik, Japan.
Zweck der Studie
- Eine detaillierte Anleitung für die Mikro-CT-Bildgebung von marinen Wirbellosen bereitzustellen.
- Die Untersuchung unterschiedlicher Morphologien zu erleichtern.
- Die Zugänglichkeit von Bildgebungstechniken für verschiedene Probengeometrien zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Herstellung von 0,5 % Agarose zur Probeneinbettung.
- Fixierung und Färbung der Proben.
- Montage der Proben in geeigneten Winkeln zur Bildaufnahme.
- Scanning- und Bildrekonstruktionsverfahren.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Abbildung verschiedener mariner wirbelloser Morphologien.
- Nachgewiesene Flexibilität bei der Probenvorbereitung und -montage.
- Bereitstellung von Richtlinien zur Anpassung von Protokollen für unterschiedliche Proben.
- Verbessertes Verständnis der Anwendungen der Mikro-CT in der Meeresbiologie.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll ermöglicht eine effektive Bildgebung verschiedener mariner Wirbelloser.
- Gängige Materialien machen die Methode für Forscher zugänglich.
- Zukünftige Anwendungen könnten sich auf andere biologische Proben ausdehnen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Mittels zerstörungsfreier Mikro-CT-Bildgebung ist eine detaillierte dreidimensionale Visualisierung interner Strukturen in komplexen biologischen Proben ohne Schnitttechnik möglich, was der Zielvalidierung und der mechnismusbezogenen Risikominderung in der frühen Entdeckungsphase dient. Das Protokoll begegnet den Herausforderungen, die durch die morphologische Vielfalt mariner Wirbelloser entstehen, und bietet einen flexiblen, reproduzierbaren Ansatz für die Entwicklung von Assays und phänotypische Screening-Workflows. Durch standardisierte Montage- und Färbemethoden unter Verwendung leicht zugänglicher Materialien wird das Vorhersagevertrauen in präklinischen Modellen erhöht und die translationale Abstimmung von Biomarkern über verschiedene krankheitsrelevante Systeme hinweg unterstützt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch zerstörungsfreie 3D-Bildgebung der inneren Anatomie und weichen Gewebestrukturen.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung, indem wiederholte Bildgebung derselben Probe strukturelle Veränderungen über die Zeit verfolgen lässt.
- Prädiktiver Wert: Steigert die Zielgenauigkeit, indem hochauflösende strukturelle Daten bereitgestellt werden, um die Beteiligung von Signalwegen und funktionelle Relevanz zu klären.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Screening-Verfahren vor, indem die Probendurchgängigkeit erhalten bleibt und eine konsistente Orientierung ermöglicht wird.
- Operativer Wert: Fördert die Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch standardisierte Agarose-Einbettungs- und Montageverfahren.
- Skalierbarkeit: Erleichtert die Wiederverwendung der Plattform für verschiedene Probentypen, von langgestreckten Würmern bis hin zu kugelförmigen Organismen, mithilfe anpassungsfähiger Montagetechniken.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationaler Zusammenhang: Unterstützt die Analyse krankheitsrelevanter Systeme durch langzeitige Bildgebung von Proben zur Überwachung struktureller Phänotypen.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Liefert quantitative strukturelle Messgrößen, die dabei helfen, phänotypische Beobachtungen mit der Modulation von Zielstrukturen zu korrelieren.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Erzeugt zuverlässige 3D-Datensätze, die Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch unterstützen, indem sie die Uneindeutigkeit bei der anatomischen Interpretation verringern.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode lässt sich in frühe Entdeckungsworkflows integrieren, indem sie eine schonende strukturelle Beurteilung vor funktionellen Assays ermöglicht und so hypothesengetriebene Zielvalidierung und die Identifizierung von Wirkstoffkandidaten unterstützt.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch die Aufdeckung der inneren Morphologie, ohne den nativen Zustand zu stören.
- Screening: Stellt die Bereitschaft von Assays sicher, indem reproduzierbare Probenaufbereitung die Orientierung erhält und Vorbereitungsartefakte minimiert.
- Analysen: Liefert quantitative 3D-morphometrische Ergebnisse, die vergleichende Analysen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem strukturelle Basiswerte für die Korrelation von Biomarkern in Krankheitsmodellen bereitgestellt werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Bildgebungskapazität, die aufgrund ihrer Anpassungsfähigkeit an unterschiedliche Morphologien in mehreren Projekten und Modellsystemen anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem mechanistische Unschärfen durch direkte Visualisierung interner Strukturen verringert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert Standardisierung und Skalierbarkeit durch einfache Montageprotokolle unter Verwendung von Wasser, Lehm und Röhrchen.
- Strategischer Wert: Verbessert die Go/No-Go-Entscheidungsfindung, indem zuverlässige strukturelle Daten bereitgestellt werden, die die Risiken bei der Zielstrukturauswahl verringern.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung durch klare, reproduzierbare anatomische Datensätze, die die fachübergreifende Bewertung unterstützen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Histologie und bildgebenden Verfahren, um die Färbung und den Kontrast zur Visualisierung weicher Gewebe zu optimieren.
- Hängt von dem Zugang zu Mikro-CT-Systemen mit einstellbarer Spannung und Stromstärke (z. B. 80 kV, 100 µA) sowie flexiblen Probenträgern ab.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg bei Färbeprotokollen (z. B. 25 %ige Lugolsche Lösung), Einbettung und Scanparametern voraus, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Erfordert Anpassungen bei empfindlichen oder beschädigten Proben, wie am Beispiel von Xenoturbella japonica durch Wassereinsatz in den Pipettenspitzen gezeigt.
- Beinhaltet praktische Einschränkungen hinsichtlich Probengröße und -dichte, die Anpassungen in der Agarosekonzentration und den Scanparametern zur optimalen Durchdringung und Kontrastierung notwendig machen.
