Aussaat und Implantation von einem biosynthetischen Tissue-Engineering trachealen Transplantat in einem Mausmodell

Klinische Anwendungen von gewebetechnischen Luftröhren wurden aufgrund von Transplantatstenose und verzögerter Epithelisierung eingeschränkt. Ein Mausmodell des orthotopischen Trachealersatzes ermöglicht die Untersuchung der zellulären Mechanismen, die die Regeneration vorantreiben. Langsegmentdefekte der Atemwege können über das hinausgehen, was aktuelle Therapien heilen können.

Die gewebegefertigte Luftröhre bietet das Potenzial, ein Ersatzorgan für diese Bedingungen zu schaffen. Dieses Modell kann auf Tiere mit transgenen und Linienverfolgungseigenschaften angewendet werden. Wir können dann die Wirtsfaktoren modulieren, die zur Transplantatregeneration beitragen.

Eine der wichtigsten Herausforderungen bei der Herstellung der Gerüste wird die Messung und Bestimmung sein, dass die Elektrospinnparameter jedes Mal gleich sind. Jedes Mal, wenn Sie ein Gerüst herstellen, müssen Sie den Abstand von Spitze zu Kollektor, die Luftfeuchtigkeit und die Temperatur messen, um sicherzustellen, dass die Gerüste jedes Mal gleich sind. Entscheidend für den Erfolg dieses Modells ist die Verfeinerung der mikrochirurgischen Techniken und die Aufrechterhaltung der richtigen Anästhesieebene, um eine spontane Beatmung während des gesamten Verfahrens zu ermöglichen.

Da die Wirtstsrache einen Innendurchmesser von rund einem Millimeter hat, sind Transplantat und nativegewebehandhabung und Nahtplatzierung wichtig und am besten visuell demonstriert. Beginnen Sie mit der Auflösung von acht Gewichtsprozent Polyethylenterephthalat oder PET in Hexafluorisopropanol und erhitzen Sie die resultierende Lösung auf 60 Grad Celsius. Während die Lösung erwärmt wird, lösen Sie drei Gewichtsprozent Polyurethan oder PU in Hexafluoroisopropanol auf und kombinieren Sie die Lösungen, sobald die PET-Lösung abgekühlt ist.

Laden Sie eine 60-Milliliter-Spritze mit einer 20-Spur-Stumpfspitzennadel mit dem Polymergemisch. Verwenden Sie die Spritze und ein Hochspannungs-GLEICHstrom-Netzteil auf positive 14 Kilovolt auf der Nadel, eine weitere Hochspannungs-Gleichstrom-Stromversorgung auf minus drei Kilovolt, eine Durchflussrate von fünf Millilitern pro Stunde und einen 20-Zentimeter-Spitzen-substrat-Abstand zum Elektrospin des Polymers auf einen Edelstahlstab mit einem Durchmesser von einem Millimeter, der mit 350 Rotationen pro Minute gedreht wird. Weiter Elektrospinnen, bis eine 300-Mikrometer Gerüstwanddicke erreicht ist.

Dann schieben Sie das Gerüst von der Stange, legen Sie das Gerüst über Nacht unter Vakuum, um restlicheLösungsmittel zu entfernen, und sterilisieren Sie das Gerüst mit einer ultravioletten Lichtdosis von 350 Millijoule pro Zentimeter quadratisch für etwa 15 Minuten. Entfernen Sie unter sterilen Bedingungen die Haut von den Hinterbeinen einer sechs bis acht Wochen alten, weiblichen, C57-Black/6 Maus mit feiner Schere und Mikro-Adson-Zange, und verwenden Sie Dumont Nummer fünf Zangen und Dumont Nummer 5/45 Zangen, um die Faszien und die Sehnen zu entfernen. Trennen Sie die Knochen, damit jeder von ihnen an beiden Enden geschnitten werden kann, und verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze, die mit einer 25-Spur-Nadel ausgestattet ist, um das Knochenmark in eine Petrischale mit 30 Milliliter RPMI-Medium zu spülen.

Wenn alle Knochen gespült wurden, filtern Sie das Knochenmark durch ein 70-Mikrometer Nylon-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Konikonrohr und übertragen Sie das Rohr in einen Biosicherheitsschrank. Fügen Sie die gefilterte mononukleäre Zelllösung vorsichtig an der Seite eines 15-Milliliter-Rohrs mit fünf Millilitern Polysucrose und Natriumdiatrizoat hinzu, ohne die Schichten zu mischen, und trennen Sie das Plasma von den weißen und roten Blutkörperchen durch Dichtegradiententrennung. Am Ende der Zentrifugation die mittlere klare Schicht, die aus den mononukleären Knochenmarkzellen besteht, zu sammeln und die mononukleären Knochenmarkzellen im PBS-Verhältnis durch Zentrifugation eins zu eins zu waschen.

Setzen Sie das Pellet in fünf Milliliter PBS für eine zweite Wäsche wieder auf, gefolgt von einer Resuspension in 10 Milliliter frisches RPMI-Medium zum Zählen. Dann sammeln Sie die Zellen mit einer zusätzlichen Zentrifugation, und verdünnen Sie die Zellen auf ein mal 10 bis die sieben Zellen pro fünf Mikroliter frischer RPMI-Konzentration. Vor dem Aussäen des Gerüstes das Polymer bei Bedarf auf eine Länge von fünf Millimetern schneiden und das Gerüst fünf Minuten lang mit fünf Mikrolitern RPMI-Medium befeuchten.

Am Ende der Inkubation das überschüssige Medium entfernen und das Gerüstlumen mit fünf Mikrolitern der mononukleären Zelllösung des Knochenmarks 10 Minuten beladen. Legen Sie dann eine 21-Spur-Nadel durch das Lumen des Gerüsts und legen Sie das Transplantat über Nacht in einem 37-Grad-Celsius-Inkubator in einem Milliliter RPMI-Medium. Nach der Induktion der Vollnarkose, bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenstich im Empfängertier, und tragen Salbe auf die Augen des Tieres.

Schneiden Sie das Haar auf der chirurgischen Stelle vom Kinn bis zu den Claviken, und legen Sie das Tier auf einem chirurgischen Pad in einer dorsalen Liegeposition. Mit aseptischer Technik desinfizieren Sie die operationsische Stelle mit einem sequenziellen Povidon-Jod, 70% Ethanol, Povidon-Jod-Wischserie, und bewegen Sie die Maus unter einem Sezieren Mikroskop mit dem Kopf bei 12 Uhr. Verwenden Sie feine Schere und Mikro-Adson Zange, um einen Mittellinienschnitt von den Clavuinus zum Hyoidknochen zu machen, und verwenden Sie Dumont Nummer fünf und Nummer sieben feine Zangen und einen sterilen Wattestäbchen, um die Faszie zu reinigen, bevor Sie einen selbsterhaltenden Colibri-Retraktor in den Schnitt einfügen.

Verwenden Sie die Zange, um die Riemenmuskeln zu öffnen, um die Schilddrüsenknorpel, Cricoid Knorpel, und Luftröhre, und stumpf trennen Sie die Luftröhre von den wiederkehrenden Kehlkopfnerven parallel auf beiden Seiten des Gewebes laufen, gefolgt von umfangren Trennung der Luftröhre von der Speiseröhre. Mit einer 20-Spur-Nadel und chirurgischen Marker, Färben Sie den vorderen Teil der Luftröhre. Machen Sie einen Schnitt unterhalb des dritten Trachealknorpelrings mit einer Vannas-Tubingen-Federschere und einem Paar Dumont-Nummer sieben feiner Zangen, um einen Drei-Ring-Abschnitt der Luftröhre wiederherzustellen.

Halten Sie die Luftröhre mit den feinen gekrümmten Zangen, verwenden Sie eine sterile 9-0 Nylon Naht, um das distale Ende der Luftröhre zum Brustbein zu sichern, um eine temporäre Tracheostomie zu erstellen, und verwenden Sie die 20-Spur-Nadel und chirurgischen Marker, um den vorderen Teil des Transplantats zu färben. Um das Transplantat zu implantieren, verwenden Sie eine 9-0 sterile Nylonnaht, Dumont Nummer sieben feine Zangen und einen Nadelhalter, um die proximal-posterior, proximal-lateral und proximal-anterior Stiche einzufügen, und drehen Sie das Tier um 180 Grad. Wenn die Maus in Position ist, lassen Sie die temporäre Tracheostomie los und machen Sie einen seitlichen Schnitt fünf Millimeter vom vorderen Teil des Transplantats entfernt, um die distale Anastomose zu erleichtern.

Um die distale Anastomose zu vervollständigen, legen Sie die Nähte in ähnlicher Weise wie die proximale Anastomose, und nähern Sie die Transplantatposition und die Riemenmuskulatur wieder an. Schließen Sie dann den Schnitt mit 9-0 sterilen Nylonnähten in einem Laufmuster, und legen Sie das Tier allein in einen Erholungskäfig, der auf einem Heizkissen mit Überwachung bis zur vollständigen Genesung platziert ist. Zwei Wochen nach der Implantation können einige Basalepithelzellen durch Basalzellkeratin fünf und 14 Färbungen in gewebetechnischen Trachealtransplantatgewebeabschnitten beobachtet werden.

Basalzellen werden auch sieben Tage nach der Implantation auf der luminalen Oberfläche des Transplantats nachgewiesen. Nach der Explantation und histologischen Analyse wurde die Transplantatstenose als Hauptfaktor bei transplantatimplantierten Mäusen identifiziert, die Anzeichen von Atemnot und Stridor aufwiesen. Beachten Sie, dass das Teleskopieren des Transplantats und der nativen Luftröhre ein häufiges Ergebnis der chirurgischen Technik ist.

Die Färbung für F4/80 zeigt Wirtsmakrophagen innerhalb der stenotischen Region des Transplantats in Verbindung mit dem Vorhandensein der Basalepithelzellen. Vermeiden Sie manipulationder Kehlkopfnerven und stellen Sie sicher, dass die proximalen und distalen Nähte vorhanden sind, um eine luftdichte Abdichtung an der Anastomose zu ermöglichen. Da sich dieses Protokoll mit mononukleären Knochenmarkzellen befasst, die von Mäusen auf Biosicherheitsstufe 1 stammen, ist es wichtig, geeignete persönliche Schutzausrüstung enden zu lassen, um eine Kontamination zu vermeiden.