Name: In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Körperwandmuskeln (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Lernen Sie zwei Methoden zur Immobilisierung von C. elegans für in vivo Calcium-Imaging in Körperwandmuskeln. Dieses Protokoll erleichtert die Untersuchung von Calcium-Homöostase und Anregungs-Kontraktions-Kopplung.

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Die Autoren danken Dr. Alexander Gottschalk für ZX1659, den RCaMP und Channelrhodopsin mit Wurmstamm, Dr. Hongkyun Kim für den Slo-1(eg142) Wurmstamm und das National Bioresource Project for the sca-1(tm5339) Wurmstamm.

1. Mikroskop-Setup
<ol><li>Verwenden Sie ein zusammengesetztes Mikroskop mit Fluoreszenzfähigkeiten. Für diese Studie wurden Daten auf einem aufrechten Mikroskop(Materialtabelle) gesammelt, das zur Anregung mit LEDs ausgestattet war.</li>
	<li>Um Fluoreszenzänderungen in den Körperwandmuskeln richtig zu visualisieren, verwenden Sie ein zielweises hohe Vergrößerung.<ol>
<li>Für sezierte Präparate verwenden Sie ein 60x NA 1.0 Wasserimmerziel (Materialtabelle).</li>
		<li>Für Präparate mit Nanoperlen verwenden Sie ein 60x NA 1.4 Öl Immersion objektiv (Tabelle der Materialien). Diese Vergrößerung sorgt für eine ausreichende Auflösung der Muskeln auf den Kamerasensor.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwenden Sie eine hochempfindliche Kamera, die am Mikroskop befestigt ist, um Bilder mit einer hohen Bildrate zu erfassen, um schnelle Veränderungen des Kalziumspiegels zu verfolgen. Für diese Studie, Bild mit einem sCMOS-System (Tabelle der Materialien) in der Lage, Vollbild-Bildgebung bei 100 Hz, wie Anstiegszeiten für die Ca2+ Signale können so schnell wie Dutzende von Millisekunden sein.</li>
	<li>Steuerung der Kameraaufnahme und LED-Fluoreszenzanregung mit einer Micro-Manager-Software, die in ImageJ10 gemäß den Anweisungen des Herstellers läuft (Materialtabelle).</li>
	<li>Verwenden Sie ein Open-Source-E-Mail-Plugin, das ein externes Open-Source-Mikrocontroller-Board (Tabelle der Materialien )verbindet, um die externen Timing-Impulse zu verwalten, um die Fluoreszenzerregung zu steuern. HINWEIS: Digitale Outs sind von den digitalen Pins 8 bis 13 verfügbar, die die Ausgangsbits 0 bis 5 bereitstellen. Diese können als Basiswerte von 1, 10, 100 usw. adressiert werden. Die Einstellungen für serielle Ports sind in Tabelle 1 angegeben und auf der Micro-Manager-Website (Materialtabelle )verfügbar. Firmware für das Mikrocontroller-Board ist ebenfalls auf dieser Website verfügbar.</li>
	<li>Um die Timing-Logik zu steuern, aktivieren Sie das Micromanager-Erfassungsprotokoll in der Software gemäß den Anweisungen des Herstellers (Tabelle der Materialien). HINWEIS: Dies initiiert gleichzeitig eine voreingestellte Kamerarahmendauer und die Anzahl der zu aktivierenden Frames sowie den logischen Verschluss und die voreingestellte Gelbe LED für die Fluoreszenzerregung. In diesem Fall wird der gelbe LED-Vollzustandsschalter über den Mikrocontroller-Bit 1-Ausgang durch Pin 9 gesteuert. Die Kamera rahmen TTL (Rückplatte aus 3 Stecker) löst einen Stimulator aus. Dies genau mal die Aktivierung der Blaulicht-LED zur Aktivierung von Channelrhodopsin zu einem festgelegten Zeitpunkt nach Aktivierung der Bildsequenz.</li>
	<li>Um Channelrhodopsin mit blauem Licht zu stimulieren und RCaMP-Änderungen aufzuzeichnen, verwenden Sie zwei LEDs. Aktivieren Sie Channelrhodopsin mit einer LED mit einer Spitzenemissionswellenlänge von 470 nm und einem Bandpassfilter (455 bis 490 nm) und erregen Sie RCaMP mit einer LED mit einer Peak-Emissionswellenlänge von 594 nm und einem Bandpassfilter (570 bis 600 nm).</li>
	<li>Um kanalrhodopsin gleichzeitig zu aktivieren und Veränderungen der RCaMP-Fluoreszenzwerte zu erfassen, beleuchten Sie beide LEDs und übertragen Sie das Licht mit einem dichroitischen Strahlkombinator auf denselben optischen Pfad.</li>
	<li>Steuern Sie das Timing der LED-Beleuchtung mit Festkörperschaltern(Materialtabelle), die durch TTL-Signale gesteuert werden (maximale Einschaltzeit, 1 ms, Abschaltzeit 0,3 ms: 0 bis 90 % Einschalt- und Ausschaltzeit von < 100 s).</li>
	<li>Stellen Sie die LED-Intensität mit den stromgesteuerten linearen Netzteilen mit geringem Rauschen ein (Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Um das genaue Timing der Blaulicht-LED zu gewährleisten, aktivieren Sie sie direkt per TTL-Impuls vom Stimulator aus an das Festkörperrelais. Programmieren Sie das Blaulichtstimulationsprotokoll in einen Stimulator (Tabelle der Materialien), der als präziser Timer vom Beginn der Bildaufnahme bis zur blauen LED-Beleuchtung fungiert. Schalten Sie in diesem Experiment die Blaulichtstimulation nach 2 s nur rCaMP-Fluoreszenz ein und verwenden Sie einen Zug von 5, 2 ms Blaulichtimpulsen mit 50 ms Interpulsintervallen, um Channelrhodopsin zu aktivieren. HINWEIS: Die Verzögerung vor blaulichten Impulsen, die Dauer der Blaulichtimpulse, die Zeit zwischen den Impulsen und die Anzahl der Impulse im Zug können an dieser Stelle eingestellt werden und sollten die spezifischen Parameter von experimentellem Interesse widerspiegeln.</li>
</ol>2. C. elegans Probenvorbereitung und Datenerfassung
<ol><li>Um präsynaptische Neuronen optisch zu stimulieren, erhalten Tiere, die Kanalrhodopsin in exzitatorischen cholinergen Neuronen exprimieren, angetrieben mit der Unc-17-Promotorregion, und RCaMP, ausgedrückt in allen Körperwandmuskeln, die mit dem Myo-3-Promotor angetrieben werden Region2. HINWEIS: Es wird nur die Verwendung von Tieren mit integrierten Transgenen und robusten Fluoreszenzgehalten empfohlen, da die variable Expression in den entsprechenden Zelltypen die Zuverlässigkeit der Datenerfassung beeinträchtigen kann.</li>
	<li>Machen Sie einen Arbeitsbestand vonAll-Trans-Retinal durch Verdünnung der Netzhautpulver ( Tabelle derMaterialien) in Ethanol, um eine endgültige Konzentration von 100 mM zu schaffen und lagern bei -20 °C. Dieser Arbeitsbestand wird für etwa ein Jahr stabil bleiben.</li>
	<li>Erstellen Sie einen Bestand von OP50 E. coli, der in LB-Medien angebaut wird, ergänzt durchAll-Trans-Retinal aus dem Arbeitsbestand in Schritt 2.2, bei einer Endkonzentration von 80 m. Das für den OP50+Retinal-Bestand verwendete Volumen hängt von der Anzahl der für das Experiment erforderlichen Platten ab.</li>
	<li>Samennematoden-Wachstumsmedienplatten (NGM) mit ca. 300 l op50+retinalen Vorrat und lassen Platten bei Raumtemperatur im Dunkeln über Nacht trocknen.</li>
	<li>Wachsen C. elegans Stämme bis zum gewünschten Alter im Dunkeln auf OP50 + retinale NGM Platten bei 20 °C. Verwenden Sie für dieses Experiment erwachsene Würmer.<ol>
<li>Für das Experiment mit der sezierten Zubereitung, verwenden Sie nur gravid erwachsene Würmer als Durchführung der Sezieren an jüngeren, kleineren Tieren ist extrem anspruchsvoll. Lassen Sie die Tiere für eine effektive Kanalrhodopsin-Aktivierung mindestens 3 Tage auf den OP50-Retinalen Platten.</li>
	</ol></li>
	<li>Wenn Sie das sezierte Präparat8,11 (Abbildung 1A) verwenden, führen Sie Sezierungen bei schwachem Licht durch.<ol>
<li>Legen Sie die Tiere in eine Sezierensteller mit einer silikonbeschichteten Deckslipbasis, die mit einer 1 mM Ca2+ extrazellulären Lösung bestehend aus 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 10 mM Glukose, 5 mM Saccharose und 15 mM HEPES (pH 7.3) gefüllt ist. , -340 Osm).</li>
		<li>Kleben Sie Tiere mit dem flüssigen topischen Hautkleber mit blauer Färbung entlang der Dorsalseite des Wurms und machen Sie einen seitlichen Cuticle-Schnitt entlang der Leim-Wurm-Schnittstelle mit Glasnadeln.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Mundpipette, um die innere Eingeweide aus der Wurmhöhle zu löschen.</li>
		<li>Kleben Sie die Nagelhautklappe des Tieres herunter, um die ventralen medialen Körperwandmuskeln für die Bildgebung freizulegen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bei Verwendung des Nanoperlenpräparats (Abbildung 1B)<ol>
<li>Machen Sie eine geschmolzene 5% Agarose-Lösung mit ddH2O bis zu einem Endvolumen von 100 ml.</li>
		<li>Mit einer Pasteur-Pipette einen Tropfen geschmolzener Agarose-Lösung auf eine Glasrutsche legen und sofort eine zweite Glasrutsche über die Oberseite legen, senkrecht zur ersten, mit sanftem Druck, um ein gleichmäßiges Agarose-Pad zu schaffen. Entfernen Sie die obere Folie vor der Verwendung.</li>
		<li>Fügen Sie etwa 4 L Polystyrol-Nanoperlen (Tabelle der Materialien) in die Mitte des Agarose-Pads.</li>
		<li>Wählen Sie bei schwachem Licht 4-6 C. Elegane in die Nanobead-Lösung, um sicherzustellen, dass die Tiere nicht übereinander liegen, und legen Sie vorsichtig einen Deckelschlappen auf die Oberseite.</li>
	</ol></li>
	<li>Legen Sie die vorbereitete Rutsche oder Sezierschale auf das Mikroskop, und finden und konzentrieren Sie sich auf einen Wurm mit 10-facher Vergrößerung und trüber heller Feldbeleuchtung.</li>
	<li>Wechseln Sie zu 60x Vergrößerung und RCaMP Fluoreszenzerregung, um einen ventromedialen Körperwandmuskel zu identifizieren, der vor der Vulva und in der richtigen Fokalebene ist. HINWEIS: Muskeln, die der Vulva voranstehen, werden ausgewählt, da sie Muskeln reflektieren, die häufig in elektrophysiologischen Experimenten stimuliert werden.</li>
	<li>Ändern Sie den Bildweg vom Okular zur Kamera, indem Sie den Umschalter herausziehen und innerhalb der Datenerfassungssoftware (Tabelle der Materialien )auf Live klicken. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Stimulationsweg für blaues Licht an dieser Stelle ausgeschaltet ist, um sicherzustellen, dass das Channelrhodopsin vor der Aufnahme von Bildern nicht aktiviert wird.</li>
	<li>Fokussieren Sie das Bild innerhalb der Datenerfassungssoftware mit dem Mikroskop Feinfokus.</li>
	<li>Sobald der Muskel klar im Fokus ist, schalten Sie das Live-Bild aus, indem Sie auf die Live-Taste klicken.</li>
	<li>Klicken Sie auf die ROI-Schaltfläche in der Datenerfassungssoftware, und erstellen Sie eine Box um den Muskel, auf den sie fokussiert sind.</li>
	<li>Schalten Sie am Stimulator den zuvor in Schritt 1.10 programmierten Blaulichtstimulationsweg ein.</li>
	<li>Klicken Sie in der Bildverarbeitungssoftware auf Übernehmen, um das Bild über die CMOS-Kamera zu erfassen. Stellen Sie dazu die Belichtungszeit mit 1.000 Frames und 2x Binning auf 10 s ein.</li>
</ol>3. Datenanalyse
<ol><li>Öffnen Sie die Datendatei in der Bildverarbeitungssoftware (Tabelle der Materialien) und skizzieren Sie mit dem Polygon-Toolden Interessensmuskel. Das ist der ROI.</li>
	<li>Gehen Sie zu Bild | Stapel | Plotten Sie das Z-Achsenprofil und exportieren Sie die resultierenden Datenpunkte in die Tabellenkalkulationssoftware (Tabelle der Materialien). Diese Funktion zeichnet den Mittelwert der ROI-Auswahl im Vergleich zum Zeitpunkt.</li>
	<li>Verschieben Sie den Mitdemkraft-ROI des Muskels, der mit dem Polygon-Werkzeug außerhalb des Tieres erstellt wurde, um eine Fluoreszenzmessung im Hintergrund mithilfe der in 3.2 beschriebenen Schritte zu erhalten. Exportieren Sie die resultierenden Daten in die Tabellenarbeitsmappe.</li>
	<li>Subtrahieren Sie in der Tabellenarbeitsmappe die Hintergrundfluoreszenzwerte von den Muskelfluoreszenzwerten zu jedem Zeitpunkt. Dadurch wird das im Hintergrund subtrahierte Fluoreszenzsignal zur Verfügung.</li>
	<li>Durchschnitt der im Hintergrund subtrahierten Fluoreszenz für die ersten 2 s Datenpunkte. Dadurch wird die Basisfluoreszenzmessung F.</li>
	<li>Verwenden Sie die Basisfluoreszenzmessung, um den normalisierten Fluoreszenzpegel zu jedem Zeitpunkt zu berechnen. Verwenden Sie dazu die Gleichung (F/F)+1. F steht für (F(t)-F), wobei F(t) die Fluoreszenzmessung zu einem bestimmten Zeitpunkt und F der Basiswert ist. Die +1 wird als y-Achsenversatz hinzugefügt.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.6 für jedes gesammelte Muskelbild. Die Verwendung einzelner oder mehrerer Muskelzellen pro Bild liegt im Ermessen des Forschers. Das n des Experiments kann durch durchführung einer Leistungsanalyse bestimmt werden.</li>
	<li>Verwenden Sie die verarbeiteten Daten aus den Schritten 3.2-3.6, um eine Spur der Fluoreszenzwerte in der Graphik-Software gemäß den Anweisungen des Herstellers (Tabelle der Materialien) zu erstellen.</li>
	<li>Messen Sie anhand dieser Spur die Kinetik des Kalziumtransienten, wie z. B. Anstieg auf Spitzenzeit und halbzerfallszeit, mit den Indizierungswerkzeugen gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

GECIs sind ein leistungsfähiges Werkzeug in c. elegans Neurobiologie. Frühere Arbeiten haben Kalzium-Bildgebungstechniken verwendet, um eine Vielzahl von Funktionen in Neuronen und Muskelzellen zu untersuchen, einschließlich sensorischer und Verhaltensreaktionen, mit verschiedenen Methoden der Stimulation. Einige Studien haben chemische Reize verwendet, um Kalziumtransienten in sensorischen ASH-Neuronen22,23 auszulösen oder Kalziumwellen in den Rachenmus...

Dieses Papier stellt Methoden zur In-vivo-Calcium-Bildgebung von C. elegans Körperwandmuskeln mit optogenetischer neuronaler Stimulation vor. Die Kombination eines muskelexprimierten genetisch kodierten Kalziumindikators (GECI) mit blauem Licht löste eine neuronale Depolarisation aus und bietet ein System, um die evozierten postsynaptischen Calciumtransienten klar zu beobachten. Dies vermeidet den Einsatz elektrischer Stimulation, was eine nicht-invasive Analyse von Mutanten ermöglicht, die die postsynaptische Kalziumdynamik beeinflussen.
Single-Fluorophor-GECIs, wie GCaMP, verwenden ein einzelnes fluoreszierendes Proteinmolekül, das mit der M13-Domäne der Myosin-Lichtkettenkinase an seinem N-Terminal-Ende und Calmodulin (CaM) am C-Terminus verschmolzen wird. Bei der Kalziumbindung erfährt die CaM-Domäne, die eine hohe Affinität zu Kalzium aufweist, eine Konformationsänderung, die eine nachfolgende Konformationsänderung im fluoreszierenden Protein zur Folge hat, was zu einer Erhöhung der Fluoreszenzintensität1führt. GCaMP Fluoreszenz ist bei 488 nm angeregt, so dass es ungeeignet ist, in Verbindung mit Channelrhodopsin verwendet zu werden, das eine ähnliche Anregungswellenlänge von 473 nm hat. Um Kalziummessungen mit der Stimulation des Kanalrhodopsins zu koppeln, muss daher das grüne fluoreszierende Protein von GCaMP durch ein rotes fluoreszierendes Protein, mRuby (RCaMP), ersetzt werden. Die Verwendung des muskelausgedrückten RCaMP in Kombination mit der cholinergen motorischen Neuronenexpression von Channelrhodopsin ermöglicht Studien an der neuromuskulären Schnittstelle des Wurms (NMJ) bei gleichzeitiger Anwendung von Optogenetik und funktioneller Bildgebung innerhalb desselben Tieres. 2.
Der Einsatz von Channelrhodopsin umgeht die Notwendigkeit der elektrischen Stimulation, um die neuromuskulären Knoten von C. eleganszu depolarisieren, die nur in sezierten Präparaten erreicht werden können, wodurch diese Technik sowohl einfacher zu verwenden als auch präziser zu machen ist. wenn bestimmte Gewebe gezielt werden. Zum Beispiel, Channelrhodopsin wurde zuvor in C. elegans verwendet, um bestimmte Neuronen reversibel zu aktivieren, was entweder zu einer robusten Aktivierung der exzitatorischen oder hemmenden Neuronen3,4. Der Einsatz einer lichtstimulierten Depolarisation umgeht auch das Problem der neuronalen Schäden durch die direkte elektrische Stimulation. Dies bietet die Möglichkeit, die Auswirkungen vieler verschiedener Stimulationsprotokolle, einschließlich anhaltender und wiederholter Stimulationen, auf die postsynaptische Kalziumdynamik4zu untersuchen.
Die transparenzliche Natur von C. elegans macht es ideal für die fluoreszierende bildgebende funktionelle Analyse. Jedoch, bei der Stimulierung der exzitatorischen Acetylcholin-Neuronen an der NMJ, Tiere werden erwartet, mit einer sofortigen Muskelkontraktion reagieren4, so dass die Immobilisierung der Würmer entscheidend bei der Visualisierung diskreter Kalziumveränderungen. Traditionell werden pharmakologische Wirkstoffe verwendet, um die Tiere zu lähmen. Ein solches Medikament verwendet wird, ist Levamisol, ein cholinerge Acetylcholin-Rezeptor-Agonist5,6,7. Da Levamisol zur anhaltenden Aktivierung eines Subtyps von exzitatorischen Muskelrezeptoren führt, ist dieses Reagenz für die Untersuchung der Muskelkalziumdynamik ungeeignet. Die Wirkung von Levamisol induziert eine postsynaptische Depolarisation, erhöht das zytosolische Kalzium und schließt Beobachtungen nach präsynaptischer Stimulation aus. Um die Verwendung von lähmenden Medikamenten zu vermeiden, untersuchten wir zwei alternative Methoden, um C. elegansimmobilisieren. Die Tiere wurden entweder verklebt und dann aufgeschnitten, um die Körperwandmuskeln freizulegen, ähnlich der bestehenden C. elegans NMJ Elektrophysiologie-Methode8, oder Nanoperlen wurden verwendet, um intakte Tiere immobilisieren9. Beide Verfahren ermöglichten reproduzierbare Messungen der ruhenden und evozierten Muskelkalziumtransienten, die leicht quantifizierbar waren.
Die Methoden in diesem Papier können verwendet werden, um die grundlegenden zytosolischen Kalziumspiegel und Transienten in postsynaptischen Körperwandmuskelzellen in C. eleganszu messen. Beispiele für Daten, die die beiden verschiedenen Immobilisierungstechniken verwenden, werden genannt. Beide Techniken nutzen die Optogenetik, um die Muskelzellen ohne elektrische Stimulation zu depolarisieren. Diese Beispiele zeigen die Machbarkeit dieser Methode bei der Bewertung von Mutationen, die die postsynaptische Kalziumbehandlung in den Würmern beeinflussen, und weisen auf die Vor- und Nachteile der beiden Immobilisierungsansätze hin.

<table><tbody><tr><td>all-trans retinal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2500</td><td>Notwendig für die Anregung des Kanals Rhodopsin</td></tr><tr><td>Amber LED</td><td></td><td></td><td>RCaMP Beleuchtung</td></tr><tr><td>Arduino UNO</td><td>Mouser</td><td>782-A000066</td><td>Steuert die Fluoreszenzbeleuchtung</td></tr><tr><td>Blaue LED-Kanalrhodopsinbeleuchtung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BX51WI Mikroskop Olympus</td><td></td><td></td><td>Festes Verbundmikroskop</td></tr><tr><td>Stromgesteuertes, rauscharmes lineares Netzteil</td><td>Ametek</td><td>Sorenson</td><td>Steuert die LED-Intensität</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>Wavemetrics</td><td>Wavemetrics.com</td><td>Grafiksoftware</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>imagej.nih.gov</td><td>Bildverarbeitungssoftware</td></tr><tr><td>LUMFLN 60x Wasser NA 1.4</td><td>Olympus</td><td></td><td>Wasserimmersionsobjektiv für Präparierung für Präparierung</td></tr><tr><td>Master-8 Stimulator</td><td>A.M.P.I</td><td></td><td>Master-Timer für Bildaufnahme und LED-Beleuchtung</td></tr><tr><td>Micro-Manager</td><td></td><td>micro-manager.org</td><td>Steuert Kameraerfassung und LED-Anregung</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Tabellenkalkulationssoftware</td></tr><tr><td>pco.edge 4.2 CMOS-Kamera</td><td>pco.</td><td>4.2</td><td>Hochgeschwindigkeitskamera</td></tr><tr><td>PlanApo N 60x Öl NA 1.4</td><td>Olympus</td><td></td><td>Öl-Immersionsobjektiv für die Herstellung von Nanokügelchen</td></tr><tr><td>Polybead-Mikrosphären</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>00876-15</td> Für Halbleiterschalter zur <td>Immobilisierung</td></tr><tr><td></td><td>von Schnecken Sensata</td><td>Technologies Crydom CMX100D6</td><td>Steuert das Timing der LED-Beleuchtung</td></tr><tr><td>Transgener Stamm, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]</td><td>Richmond Lab</td><td>SY1627</td><td>Exzitatorisches neuronales Channelrhodopsin und Körperwandmuskel RCaMP exprimierende Wurmlinie mit SERCA-mutiertem Allel</td></tr><tr><td>Transgener Stamm, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]</td><td>Richmond Lab</td><td></td><td>Exzitatorisches neuronales Kanalrhodopsin und Körperwandmuskel RCaMP, das eine Wurmlinie mit Kalzium-aktiviertem BK-Kaliumkanal-mutiertem Allel exprimiert</td></tr><tr><td>Transgener Stamm, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]</td><td>Gottschalk Lab</td><td>ZX1659</td><td>Exzitatorisches neuronales Kanalrhodopsin und Körperwandmuskel RCaMP exprimierende Wurmlinie</td></tr></tbody></table>

in vivo calcium imaging in c. elegans körperwandmuskeln

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

Der Modellorganismus C. elegans bietet ein ausgezeichnetes System zur Durchführung von In-vivo-Calcium-Bildgebung. Sein transparenter Körper und seine genetische Manipulierbarkeit ermöglichen die gezielte Expression genetisch kodierter Kalziumsensoren. Dieses Protokoll skizziert den Einsatz dieser Sensoren für die In-vivo-Bildgebung der Kalziumdynamik in Zielzellen, insbesondere der Körperwandmuskulatur der Würmer. Durch die Verwendung der Ko-Expression von präsynaptischem Kanalrhodopsin kann die Stimulation der Acetylcholin-Freisetzung aus exzitatorischen motorischen Neuronen mit blauen Lichtimpulsen induziert werden, was zu einer Muskeldepolarisation und reproduzierbaren Veränderungen des zytoplasmatischen Kalziums führt. Ebenen. Zwei Schneckenimmobilisierungstechniken werden mit unterschiedlichen Schwierigkeitsgraden besprochen. Der Vergleich dieser Techniken zeigt, dass beide Ansätze die Physiologie der neuromuskulären Kreuzung erhalten und die reproduzierbare Quantifizierung von Kalziumtransienten ermöglichen. Durch die Kombination von Optogenetik und funktioneller Kalziumbildgebung können Veränderungen der postsynaptischen Kalziumhandhabung und Homöostase in einer Vielzahl mutierter Hintergründe bewertet werden. Die vorgestellten Daten validieren sowohl Immobilisierungstechniken als auch untersucht speziell die Rolle des C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase und des calciumaktivierten BK Kaliumkanals in der Körperwandmuskel-Calciumregulation.

Diese Technik bewertete Veränderungen bei Mutanten, von denen angenommen wird, dass sie die Kalziumhandhabung oder Muskeldepolarisation beeinflussen. Die Grundfluoreszenzspiegel und fluoreszierenden Transienten wurden visualisiert und ruhende zytosolische Kalzium- und Calciumkinetik innerhalb des Muskels wurden ausgewertet. Es ist wichtig, dass die Tiere mindestens drei Tage lang auf All-Trans-Retina angebaut wurden, um die erfolgreiche Integration der Netzhaut zu gewährleisten und so ans...

Diese Methode bietet eine Möglichkeit, Optogenetik und genetisch kodierte Kalziumsensoren zu koppeln, um die zytosolischen Kalziumspiegel und Veränderungen in evozierten Kalziumtransienten in den Körperwandmuskeln des Modellorganismus C. elegansabzubilden.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Körperwandmuskeln

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Dieses Protokoll bietet zwei Methoden, um C.Elegans zu mobilisieren, um in vivo Kalzium-Bildgebung der Körperwandmuskeln durchzuführen. Diese Methode kann helfen, Fragen im Zusammenhang mit Kalziumhomöostase und Kalziumhandhabung zu beantworten, und eine zugängliche Synapse in genetisch beweglichen Organismen. Diese Technik kann ein besseres Verständnis der Mechanismen zur Regulierung der Muskelkalziumhomöostase bieten und kann daher wichtig sein, um Bedingungen oder molekulare Wege zu identifizieren, die die Anregungskontraktion sondieren, die durch die Fehlregulation des Kalziumkreislaufs beeinflusst werden.Diese Methoden können Einblicke in Forschungsbereiche geben, einschließlich, aber nicht auch, Neurobiologie, Entwicklungsbiologie und Zellbiologie. Diese Techniken könnten angepasst werden, um eine Vielzahl von Zelltypen und C.elegans, andere verwandte Nematoden sowie Filsafatlarven zu untersuchen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, damit der Experimentator die Seziertechnik verstehen und Kalziumtransienten von richtig immobilisierten Tieren genau einschätzen kann.Beginnen Sie mit der Einrichtung des Mikroskops für die Fluoreszenz-Bildgebung. Verwenden

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Video stellt die Konzepte hinter der Kalziumbildgebung vor und enthält ein Beispielprotokoll für die Zeitrafferbildgebung von Würmern, die in geformten Agarose-Vertiefungen enthalten sind.

Calcium Imaging: Eine Methode zur Visualisierung der neuronalen Aktivität in lebenden C. elegans

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Kalzium-Bildgebung in einzelnen Neuronen von sich benehmenden Caenorhabditis elegans unter Verwendung genetisch kodierter fluoreszierender Reporterproteine. Es werden die Schritte beschrieben, die bei der Abbildung der Wurmbewegung und der Messung der Reporterfluoreszenzverhältnisse von Neuronen erforderlich sind, um den intrazellulären Kalziumspiegel mit der neuronalen Aktivität und Verhaltensänderungen während der Eiablage zu korrelieren.

Calcium-Bildgebung in einzelnen Neuronen zur Regulierung des Eiablageverhaltens bei Caenorhabditis elegans

Quelle: Doser, R., et al. Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Kalziumumgangs in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Dieses Video zeigt in vivo die Bildgebung des subzellulären Kalziumflusses in den ventralen Nervenstrangneuronen von transgenen Caenorhabditis elegans-Stämmen. Es werden zwei unterschiedliche Kalziumindikatoren verwendet: ein zytoplasmatischer Indikator in einem Stamm und ein mitochondrialer Indikator in einem anderen. Neuronen werden unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet, um...

Bildgebung der subzellulären Kalziumdynamik in Neuronen von Caenorhabditis elegans

Mit seinem kleinen transparenten Körper, gut dokumentierte Neuroanatomie und einer Vielzahl von zugänglicher genetischen Techniken und...

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

Die Abbildung von Verhalten und neuronaler Aktivität über lange Zeitskalen ohne Immobilisierung des Tieres ist eine Voraussetzung, um Verhalten zu verstehen. Die mikrofluidische Kammerbildgebung (AMI) von Agarose kann verwendet werden, um die neuronale Aktivität und das Verhalten für alle Lebensstadien von Caenorhabditis elegans abzubilden.

Agarose Mikrokammern für Langzeit Calcium Imaging von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz von genetisch codierte Ca2 + Reporter Datensatzänderungen in neuronale Aktivität im Verhalten Caenorhabditis Elegans Würmer.

Ratiometrischen Kalzium Imaging einzelner Neuronen im Verhalten Caenorhabditis Elegans

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Bild Kalzium signalisieren in den Populationen der einzelnen Zelltypen bei der murinen neuromuskulären Synapse.

Ex-Vivo Bildgebung von zellspezifische Kalzium Signalisierung an den dreigliedrigen Synapse der Maus Membran

Hier wird ein System zur Kalziumbildgebung bei frei verhaltender Caenorhabditis elegans mit gut kontrollierter , nicht lokalisierter Vibration berichtet. Dieses System ermöglicht es den Forschern, nicht lokalisierte Schwingungen mit gut kontrollierten Eigenschaften bei nanoskaliger Verschiebung hervorzurufen und Kalziumströme während der Reaktionen von C. elegans auf die Schwingungen zu quantifizieren.

Kalziumbildgebung bei frei verhaltender Caenorhabditis elegans mit gut kontrollierter, nicht lokalisierter Schwingung

Dendritische Stacheln sind wichtige zelluläre Merkmale des Nervensystems. Hier werden bildgebende Verfahren zur Beurteilung der Struktur und Funktion von dendritischen Dornen in C. elegans beschrieben. Diese Ansätze unterstützen die Entwicklung von mutierten Screens für Gene, die die Form oder Funktion der dendritischen Wirbelsäule definieren.

Bildgebung dendritischer Dornen bei Caenorhabditis elegans

Die aktuellen Methoden beschreiben einen nicht-ratiometrischen Ansatz für die hochauflösende, subkompartimentelle Kalziumbildgebung in vivo in Caenorhabditis elegans unter Verwendung leicht verfügbarer genetisch kodierter Kalziumindikatoren.

Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Calcium-Handlings in vivo

Hier stellen wir Protokolle und Werkzeuge zur Visualisierung von Kalzium während der Befruchtung und der frühen Embryogenese unter Verwendung eines genetisch kodierten Kalziumreporters vor, der in der Keimbahn des Modellfadenwurms C . elegans exprimiert wird.

In vivo Visualisierung von Calciumtransienten während der Befruchtung und frühen Entwicklung bei C. elegans

Lernen Sie zwei Methoden zur Immobilisierung von C. elegans für in vivo Calcium-Imaging in Körperwandmuskeln. Dieses Protokoll erleichtert die Untersuchung von Calcium-Homöostase und Anregungs-Kontraktions-Kopplung.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Körperwandmuskeln

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