Name: Eine zuverlässige und reproduzierbare kritische Größe segmentale femoralen defekt-Modell bei Ratten mit einer benutzerdefinierten Fixateur externe stabilisiert (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Lernen Sie ein reproduzierbares Modell für segmentale Femurdefekte bei Ratten mit externer Fixateur-Stabilisierung kennen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Knochenheilung und regenerativen Therapien in vivo.

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Diese Arbeit wurde von einem NIH Ausrüstung Grant 1S10OD023676-01 mit zusätzlicher Unterstützung durch die University of Wisconsin Abteilungen für Orthopädie und Rehabilitation und School of Medicine und öffentliche Gesundheit unterstützt. Wir möchten die UW Carbone Cancer Center unterstützt Grant P30 CA014520 und Verwendung von deren Small Animal Imaging Facility sowie NIH Ausbildung Grant 5T35OD011078-08 für die Unterstützung von H. Martin anerkennen. Wir danken auch Michael und Mary Sue Shannon für ihre Unterstützung der Muskel-Skelett-Regeneration-Partnerschaft.

Die Ratten, die in dieser Studie verwendeten erhalten tägliche Pflege nach der AVMA Richtlinien für die Euthanasie von Tieren: 2013 Ausgabe16. Die institutionelle Animal Care und Use Committee der University of Wisconsin-Madison überprüft und genehmigt dieses experimentelle Protokoll vor Projektbeginn.
(1) Tiere
<ol><li>Verwenden Sie die outbred Sprague-Dawley männliche Ratten mit einem Gewicht von ca. 350 g.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Knochen morphogenetische Protein-2 (RhBMP-2) getränkten Schwamm Gerüste
Hinweis: Gerüst Vorbereitung sollte nur vor der Implantation in das Femur auftreten (siehe Schritt 6.14).
<ol><li>Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Nutzung eines etablierten RhBMP-2 Knochen-Transplantat-Kit mit einem Kollagen Schwamm, lyophilisierter RhBMP-2 und steriles Wasser zur Rekonstitution17. Aufrechterhaltung der Sterilität, rekonstruieren Sie die RhBMP-2 mit sterilem Wasser zu einer Konzentration von 1,5 mg/mL.</li>
	<li>Mit steriler Schere und einem sterilen Lineal, trimmen Sie RhBMP-2 getränkt Kollagen Schwamm Umformen eine 5 x 3 mm x 3 mm defekt angepasst.</li>
	<li>Mit einer Spritze, die RhBMP-2-Lösung gleichmäßig verteilen Sie über das Kollagen Schwamm damit es absorbiert wird.</li>
</ol>3. Vorbereitung des benutzerdefinierten Fixateur externe Gerät
Hinweis: Für die vollständige Auflistung der Abmessungen siehe Abbildung 1A .
<ol><li>Schneiden Aluminium Blech Lager (Typ 6061, 0,088" Dicke) auf zwei Stücke (1,4" x 6") mit einer Stichsäge oder einem anderen geeigneten Werkzeug.</li>
	<li>Einteiler in die Fräsmaschine zu montieren und mit einer 1/8" 90°-Punkt Hartmetall Bohrer Mühle, cut vier 'V'-Rillen (0,035" tief) in Längsrichtung. Lassen Sie das andere Stück frei von Kürzungen.</li>
	<li>Einzelne Platten von 0.3" Breite der beiden Stücke (Abbildung 1 b). Messen Sie und Bohren Sie der Schraubenlöcher für 4-40 Gewinde. Tippen Sie auf Platte mit 'V'-Grooves mit 4-40 Gewinde. Bohren Sie die Platte ohne Rillen für eine #4 Schraube Körper Bohrer.</li>
	<li>Schleifen Sie beide Stücke um Ecken abrunden und reduzieren das Gewicht (Abbildung 1).</li>
	<li>Schrauben Sie Stücke zusammen mit 4-40, 18-8 Edelstahl-Taste Kopf Kopfschrauben (0,25"), so dass Nuten bündig mit der einfachen Platte (Abbildung 1 sind)</li>
</ol>(4) Narkose Verfahren und Analgesie
<ol><li>Anästhesie zu induzieren, indem man die Ratte in Induktion Kammer 4 L O2/min mit 4 % Isofluran zu liefern. Achtung: Wissenschaftliches Personal müssen nicht einatmen betäubende Gas und richtige Kapuze und Belüftung im Labor.</li>
	<li>Entfernen Sie die Ratte aus der Kammer zu, nachdem die Ratte aufrichtenden Reflex verliert, befestigen Sie einen Nase Kegel und auf die Erhaltungsdosis von Anästhesie durch die Nase (O2 Fördermenge um ca. 2-3 L/min und 0,8 % Isofluran).</li>
	<li>Platzieren Sie die Ratte auf das Heizkissen oder unter das wärmende Licht, um Unterkühlung zu verhindern.</li>
	<li>Bestätigen Sie die ausreichende Tiefe der Narkose durch Einklemmen der Zehs oder palpebrale Reflex-Tests.</li>
	<li>Augen zu verhindern Austrocknung der Hornhaut zuweisen Sie Schmierung.</li>
	<li>Eine subkutane Injektion von extended-Release Buprenorphin (1 mg/kg) auf den Stamm/Dorsum der Ratte, weit weg von der Operationsstelle Analgesie für bis zu 3 Tage nach der Operation zu liefern.</li>
</ol>(5) aseptischen Vorbereitung und antibiotische Schutzausrüstungen
<ol><li>Gegend um Hinterbein mit der 13th Rippe, der Fuß, der dorsalen Mittellinie und der ventralen Mittellinie als Margen zu rasieren.</li>
	<li>Scrub rasiert-Bereich mit steriler 2 x 2 Gaze getränkt mit 10 % Povidon-Jod gefolgt von 70 % EtOH (4 mal jeweils abwechselnd).</li>
	<li>Eine intramuskuläre Injektion von Cefazolin (20 mg/kg) in der operativen Quadrizeps zu verwalten.</li>
	<li>Verwalten von Enrofloxacin (0,25 mg/ml) im Trinkwasser für 7 Tage postoperativ um weiterhin Antibiotika geschützt.</li>
	<li>Stellen Sie Ratten auf Medizinalfutter (z. B. Uniprim) für die Dauer der Studie Pin Infektionen zu verhindern.</li>
	<li>Gelten Sie doppelte antibiotische Salbe für die Haut-polige Schnittstelle einmal täglich für 3 Tage postoperativ. Hinweis: Vermeiden Sie jeder Fixateur externe Pin oder Klemmen Sie lösen, die zu die Entwicklung einer Infektion beitragen können.</li>
</ol>(6) chirurgischen Eingriff
Hinweis: Stellen Sie eine konzertierte Anstrengungen zur Aufrechterhaltung eines sterilen Bereich und Arbeitsbereich und sterilen Technik während der Ganzheit des Falles zu folgen.
<ol><li>Erweitern Sie rasierte Bein durch gefenstert, klar klebrigen drapieren und Deckel op Bank in sterilen Tüchern um einen sterilen Bereich zu erstellen.</li>
	<li>Ertasten der Femur und verwenden Sie eine #15 Klinge erstelle ich einen anterolateralen Einschnitt durch die Haut, die Verlängerung von der Patella auf den Trochanter Major am proximalen Femur.</li>
	<li>Vorsichtig einschneiden der seitliche Bein-Faszie entlang der intermuscular Septum, trennen den Vastus Lateralis Muskel des Quadrizeps anterior aus dem Oberschenkel nach hinten bis die laterale Femur ausgesetzt ist. Bewahren Sie die Entführer gluteal sehnen Einfügung auf den Trochanter Major.</li>
	<li>Führen Sie eine sorgfältige, atraumatische umlaufende Weichgewebe Dissektion und setzen Sie das Femur in seiner Mitte Diaphyse, beginnend auf der Mantelfläche. Um dies zu tun, verwenden Sie eine #15 Klinge sanft den Muskel vom darunter liegenden Knochen verringern, indem die Klinge gegen die Kontur der Knochenoberfläche parallel zu halten. Verwenden Sie einen periostalen Aufzug zu heben den Muskel von den freiliegenden Knochen, wie es zerlegt ist und fahren um die femoral Welle bis ca. 7-10 mm zentrale Diaphyse des Weichgewebes auf allen Seiten zur Vorbereitung der Ostectomy behoben wurde. Hinweis: Vermeiden Sie Verletzungen an den medialen femoralen neurovaskuläre Bündel.</li>
	<li>Fügen Sie vier 1,0 mm Kirschner (k) Kabel: 2 proximalen und distalen im Femur senkrecht in den seitlichen Oberschenkelknochen, 2 gerichtet gerade Lateral, Medial. Stellen Sie sicher, dass alle Pins beide Cortex (Bicortical) für ausreichende Stabilität (Abb. 2A) engagieren.</li>
	<li>Beginnen Sie mit der distalen-die meisten Pin zunächst nur auf der Ebene der seitlichen Epicondylus. Ort Jig bündig mit der lateralen distalen Femur und fügen Sie einen 1,0 Gewindespitze k-Draht.</li>
	<li>Beibehaltung der Position von der Schablone auf den Knochen, identifizieren Sie, wo die meisten proximalen Knochen anhand der Schablone Löcher die Eingabe der Pin wird. Sobald die Position bestimmt wird, einzuschneiden Sie sorgfältig Parallel zu den Fasern der gluteal Sehnen nach Bedarf erstelle ich eine kleine Lücke im Gewebe des proximalen Pins zu durchfahren, damit Minimierung iatrogener Schäden an der Sehne. Bohren Sie einen 1,0 mm ohne Gewinde k-Draht in diese Lücke wieder sicherstellen, dass der Stift greift beide Cortex (Abb. 2 b).</li>
	<li>Halten Sie die Gigue Position in Kontakt mit dem Knochen zu und Bohren Sie zwei 1,0 mm Gewinde k-Drähte, auf beiden Seiten des Standortes zukünftige defekt. Sicherzustellen Sie, dass Pins führen beide Cortex (Abbildung 2).</li>
	<li>Legen Sie den Fixateur externe bar Level 1 cm über der Haut und festschrauben Sie, sperren die Bar im Ort. Schneiden Sie die überschüssige Pin-Längen (Abb. 2D).</li>
	<li>Bereiten Sie für die Ostectomy (mangels Schöpfung) indem man einen kleinen, gebogenen Retraktor um die vorderen und hinteren Oberschenkel zum Schutz der umgebenden Weichgewebe, Muskel und neurovaskuläre Bündel. Unter Verwendung einer ~ 5 mm sagittale oszillierenden Sägeblatt, einen 5 mm segmentale defekt durch die Mitte Diaphyse sehr vorsichtig zu schaffen. Gelten Sie eine leichte, gleichmäßige Druckverteilung mit der Säge zu vermeiden unnötigen Bruch (Abb. 2E).</li>
	<li>Kleine Mengen von Bewässerung (Raumtemperatur 0,9 % sterile normale Kochsalzlösung (NS)) je nach Bedarf während der Erstellung Fehler um thermische Nekrose des Knochens zu vermeiden gilt.</li>
	<li>Spülen Sie die Wunde mit 10 mL NS nach dem Erstellen des Mangels.</li>
	<li>Verabreichen Sie 0,1 mL ein Bupivacain 0,25 % mit Adrenalin (1: 200, 000) an die Wunde als Analgetikum und Vasokonstriktor.</li>
	<li>Legen Sie das Gerüst (5 x 3 x 3 mm) von Kollagen Schwamm oder RhBMP-2 getränkten Schwamm (aus Schritt2) in den defekt. Jedes Gerüst sollte entsprechend dimensioniert sein, um die Länge und Umfang des Mangels, helfen den Schwamm in Position bleiben zu überspannen. Hinweis: an dieser Stelle mRNA-komplexe können vorbereitet und gespritzt wie in Schritten 7.1-7.3 unten beschrieben, wenn die Biolumineszenz Bildgebung durchführen.</li>
	<li>Schließen Sie die Muskel-Ebene mit dem einfachen unterbrochene Muster mit 4: 0 resorbierbaren Naht. Schließen Sie die Hautschicht mit einem laufenden Subcuticular Muster mit 4: 0 resorbierbaren Naht und Haut kleben, um die überstehenden Stifte Lücken zu schließen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Ratte aus die Bugnase, noch auf das Heizkissen und überwachen Sie kontinuierlich bis die Ratte in der Lage, konsequent eine aufrechte Körperhaltung beizubehalten. An dieser Stelle legen Sie in einem sauberen Käfig zu erholen.</li>
</ol>7. Vorbereitung der komplexiert mRNA und Biolumineszenz Bildgebung
Hinweis: Transfektion mit mRNA-komplexe sollte während der Operation 1 Tag vor der Lumineszenz Bildgebung durchgeführt werden. Verwenden Sie sterile Techniken im Umgang mit mRNA.
<ol><li>Mischung 10 µL der mRNA Kodierung für Gaussia Luciferase (Lager Konzentration von 1 µg/µL) mit 30 µL des Lipid-transfecting Agenten.</li>
	<li>Ermöglichen Sie die mRNA-Lipid-komplexe zu bilden durch Inkubation für mindestens 5 min bei Raumtemperatur. Die Lipid-transfecting Agent wird die mRNA-Moleküle kondensieren, sie zu stabilisieren und Transfektion Effizienzsteigerung. Hinweis: Wenn die komplexe nicht sofort verwendet werden, speichern Sie sie im Eis für maximal 1 h.</li>
	<li>Mit einer 20 µL Pipette mit gefilterten Tipps ausgestattet, die Hälfte des Volumens der mRNA-komplexe an den proximalen und distalen Enden des Mangels, bzw. Spritzen.</li>
	<li>Betäuben Sie am nächsten Tag, 3 min vor Bildgebung, die Ratte mit inhalativen Isofluran wie zuvor im Schritt 4.1 beschrieben.</li>
	<li>Positionieren Sie die Ratte in eine in-Vivo imaging-Kammer mit einem Prüfkopf liefert Wartung Isofluran (0,8 % Isofluran, O2 Fördermenge von ca. 2-3 L/min) ausgestattet.</li>
	<li>Coelenterazine Nukleinsäuretablette in Kochsalzlösung in einer Dosis von 4 mg/kg Körpergewicht in der Nähe des Mangels zu injizieren.</li>
	<li>Biolumineszenz-Bilder mit dem in-Vivo imaging-System (IVIS) laut des Herstellers Anweisungen18zu erwerben.</li>
</ol>(8) Imaging-Protokoll
<ol><li>Betäuben Sie nach der Kalibrierung der schlichten radiologischen Maschine, ein x-ray System19Ratte mit inhalativen Isofluran wie zuvor beschrieben (siehe Schritt 4.1) zu und positionieren Sie die Ratte in einem Prüfkopf mit inhalativen Isofluran (0,8 % Isofluran, O2 Fördermenge von ca. 2-3 L/min) für eine Anteroposterior (AP) Femur Röntgenbild.<ol>
<li>Während die Ratte sternalen liegen wird, voraus die chirurgische Megalosauridae nach vorne beugen in der Hüfte und Gelenk zu ersticken. Das Knie Gelenk um ca. 90° Flex. Kleben Sie die Pfote plantaren Seite nach unten, in der Nähe der Körperwand. Positionieren Sie die Tibia nach vorne aus dem Oberschenkelknochen, die Möglichkeit der Überlagerung der Knochen zu beseitigen. Um leichtes Entführung der Hüfte zu bieten, legen Sie einen transluzenten Schwamm (ca. 15 mm dick) in der Leistengegend. Dann erhalten Sie ein anterior-posterioren (Cranio-caudale) Bild des Oberschenkelknochens.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wiederholen Sie diese AP Femur radiologischen Ansicht sofort nach der Operation, 4 und 12 Wochen. Verwenden Sie Band und Gaze, um des Tieres Extremität für Qualität und konsequente Imaging angemessen zu positionieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Ratte aus der Bugnase und überwachen Sie kontinuierlich bis die Ratte in der Lage, konsequent eine aufrechte Körperhaltung beizubehalten. Platzieren Sie anschließend zurück in den Käfig.</li>
</ol>9. histologischen Verfahren
<ol><li>Ratten in einer Kammer mit inhalativen CO2 gemäß AVMA ethischen Standards16einschläfern.</li>
	<li>Nach Euthanasie rasieren die Megalosauridae, entfernen Sie die Haut von der operative Extremität und Machtkonfiguration Femur an der Hüfte. Entfernen Sie vorsichtig alle Weichteile aus dem operativen Oberschenkelknochen (einschließlich alle Muskeln, Sehnen und Bänder). Lassen Sie nur eine dünne Schicht der Muskulatur rund um die defekt-Website, um die heilende Region vor versehentlicher Beschädigung während der Präparation zu schützen.</li>
	<li>Legen Sie das Femur in 10 % Neutral gepufferte Formalin bei Zimmertemperatur ca. 3-4 Tage für Fixierung ermöglichen. Halten Sie ein 15:1 Formalin Gewebe-Volumen-Verhältnis. Wechseln Sie die Lösung einmal auf halbem Weg durch die Fixierung Prozess.</li>
	<li>Entkalken Sie das Femur in eine 15 % Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) pH 6,5 Säurelösung für 3-4 Wochen. Sammeln Sie serielle Röntgenaufnahmen um Entkalkung Endpunkt zu bestimmen.</li>
	<li>Halbieren Sie den Oberschenkelknochen längs mit einem Schnitt von anterior Posterior in der Mitte sagittale Ebene. Gewebe für standard Paraffin einbetten und Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung einreichen.</li>
	<li>H & E Folien zu einem Pathologen zur histologischen Beurteilung zu senden.</li>
</ol>

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Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder Vorteile. Es wurden keine Leistungen erhalten direkt oder indirekt von den Autoren dieses Artikels.

Kleiner Tiermodelle der orthopädischen Verletzungen wie komplette Knochenbrüchen ermöglichen Forschung, die die Mechanismen der Osteogenesis und Beurteilung des therapeutischen Potenzials von Biomaterialien20untersucht. Diese Studie stellt eine Ratte segmentale defekt Modell stabilisiert durch eine benutzerdefinierte Fixateur externe, die eine Labor und biomedizinische Technik Team für weitere Studien der tragenden osteosynthetischen Knochen Reparatur leicht reproduzieren kann.
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Orthopädische Unfallchirurgie konzentriert sich auf die Behandlung von einer Vielzahl von komplexen Frakturen. Kritischen Diaphysen segmentale Knochen, die Mängel schwierig nachweislich, klinisch durch die verminderte Regenerationsfähigkeit der umliegenden Muskeln und Knochenhaut sowie das Scheitern der Behandlung lokalisiert Angiogenese1. Moderne Behandlungstechniken beinhalten operative Fixierung mit Knochentransplantation, verzögert Knochentransplantation (Masquelet), Knochen-Beförderung, Fusion oder Amputation2,3,4. Bei den meisten Patienten, die ambulante Funktion erhalten nach ihrem Trauma mit gut funktionierenden distalen Gliedmaßen, ist Limb Salvage eindeutig eine bessere Behandlung Option5. Diese Bergung Behandlungen erfordern oft inszenierten chirurgische Eingriffe über eine lange Behandlungsdauer. Einige Autoren haben vorgeschlagen, dass externe Fixation verglichen mit der Fläche Osteosynthese für diese Anwendungen durch die verminderte Gewebeschädigung während der Implantation, verringerte implantiert und erhöhte postoperative Einstellbarkeit der überlegen ist der Fixateur6. Allerdings ist eine prospektive, randomisierte, kontrollierte Studie derzeit im Gange zur Klärung dieser Kontroverse der interne vs. externe Fixation in schweren offenen Frakturen der Tibia-7. Leider bestehen wesentliche Komplikation und Fehlerraten mit entweder Behandlung ausgewählt,8,9. Mit beiden Behandlungsmethode, in Bezug auf die segmentale Knochenschwund muss der Chirurg mit segmentale Diaphysen Mängel, die bedeutende Herausforderungen zu kämpfen. Korrekturen der segmentalen Mängel müssen Knochen Stabilisierung maximieren und gleichzeitig verbessern die knochenbildenden Prozess10,11.
Aufgrund der klinischen Bedeutung, doch das geringere Volumen der kritischen Größe Diaphysen segmentale Mängel ist eine effektive und reproduzierbare Tiermodell notwendig, Forschungsteams Behandlungstechniken und letztlich bessere klinische Ergebnisse zu ermöglichen. Forscher müssen in Vivo physiologischen heilenden Mechanismen in einem Säugetier Tiermodell studieren. Zwar gibt es solche Modelle der Fixateur externe bereits12,13,14,15hoffen wir ermöglichen eine zuverlässigere Methode für Pseudarthrosen in den unbehandelten Tieren und Verringerung der Kosten durch die Wahl der erschwingliche Fixateur Materialien und Gliederung eine einfache chirurgische Protokoll für die einfache Anwendung auf zukünftige Studien. Das primäre Ziel dieses Protokolls ist es, eine zuverlässige und reproduzierbare Modell eines kritischen Diaphysen Mangels an Ratten zu etablieren. Das Verfahren wurde durch Beurteilung der Stabilisierung und Knochenheilung in Ratte Oberschenkelknochen über 12 Wochen ausgewertet. Die sekundären Ziele enthalten: ein Modell als kosteneffektiv wie möglich, chirurgisches Vorgehen und Stabilisierung zu vereinfachen und sicherzustellen ethische Betreuung der Tiere machen. Die Autoren und Forschungsteam durchgeführt Vorversuchen mit einer Reihe von verschiedenen Biomaterialien und potenzielle regenerative Therapien zur Verbesserung der Heilung in dieser segmentalen defekt.

<table><tbody><tr><td>0,9 % sterile Kochsalzlösung</td><td>Baxter</td><td>2F7124</td><td>Zur Spülung von Wunden und zur Rehydrierung</td></tr><tr><td>10 % Jod/Povidon</td><td>Carefusion</td><td>1215016</td><td>Zur Vorbereitung der Haut</td></tr><tr><td>10 % Neutral Buffered Formalin</td><td>VWR</td><td>89370094</td><td>Wird als Fixiermittel verwendet</td></tr><tr><td>1 mm Kirschnerdraht ohne Gewinde</td><td>DePuy Synthes</td><td>VW1003.15</td><td>Sterilisiert, wird für den am weitesten entfernten Stift</td></tr> <tr><td>verwendet1mm Gewinde Kirschnerdraht</td><td>DePuy Synthes</td><td>VW1005.15</td><td>Sterilisiert, verwendet für die 3 distalsten Stiftschlitze</td></tr><tr><td>2x2</td><td>Gaze Covidien</td><td>4006130</td><td>Sterilisiert, zur Vorbereitung der Haut und zur Aufnahme von Blut</td></tr><tr><td>4-0 Vicryl Naht</td><td>Ethicon</td><td>4015304</td><td>Wird verwendet, um Muskel- und Hautschichten</td></tr><tr><td>zu schließen 4-40 x 0,25", 18-8 Edelstahl-Knopfkopfschrauben</td><td>Generischer</td><td></td><td>externer Fixateur Baugruppe</td></tr><tr><td>4200 Akku-Treiber</td><td>Stryker</td><td>OR-S-4200</td><td>Zum Bohren von Kirschner-Drähten</td></tr><tr><td>4x4</td><td>Gaze Covidien</td><td>1219158</td><td>Sterilisiert, zur Aufnahme von Blut</td></tr><tr><td>70 % Ethanol</td><td></td><td></td><td>Zur Vorbereitung der Haut</td></tr><tr><td>Baytril</td><td>Bayer Healthcare LLC, Division Tiergesundheit</td><td>312.10010.3</td><td>Dem Wasser als Antibiotikum</td></tr><tr><td>zugesetzt Cefazolin</td><td>Hikma Pharmazeutika</td><td>8917156</td><td>Präoperatives Antibiotikum</td></tr><tr><td>CleanCap Gaussia Luciferase mRNA (5moU)</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>L-7205</td><td>Modifizierte mRNA, die für Gaussia Luciferase kodiert, während des Gebrauchs auf Eis bleiben</td></tr><tr><td>Coelenterazin native</td><td>NanoLight Technology</td><td>303</td><td>Substrat für Guassia Luciferase, zur Beurteilung der Luziferase-Aktivität in vivo</td></tr><tr><td>Doppelte antibiotische Salbe</td><td>Johnson & Johnson Consumer Inc</td><td>8975432</td><td>Wird postoperativ als Wundversorgung an Pin-Stellen angewendet</td></tr><tr><td>Dual Cut Microblade</td><td>Stryker</td><td>5400-003-410</td><td>Wird verwendet, um einen 5-mm-Defekt im Oberschenkelknochen zu erzeugen</td></tr><tr><td>Ethylendiamin-Tetraessigsäure (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td>Wird verwendet, um Knochen zu entkalken, um sich auf die Histologie</td></tr> vorzubereiten <tr><td>Buprenorphin</td><td>ZooPharm</td><td></td> mit verlängerter Freisetzung <td>Wird als 3-Tage-Schmerzlinderung</td></tr><tr><td>verwendet Fenestiert Abdecktücher</td><td>3M</td><td>1204025</td><td>Wird verwendet, um ein steriles Feld zu etablieren</td></tr><tr><td>Handstückkabel für TPS</td><td>Stryker</td><td>OR-S-5100-4N</td><td>Wird verwendet, um einen 5-mm-Defekt im Oberschenkelknochen zu erzeugen</td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>K& H Haustierprodukte</td><td>121239</td><td>Aufrechterhaltung der Körpertemperatur der Ratte</td></tr><tr><td>Sechskantschraubendreher</td><td>Wiha</td><td>263/1/16 " X 50</td><td>Externe Fixateurverschraubung</td></tr><tr><td>Induktionskammer</td><td>Generische</td><td></td><td>Anästhesie für Ratten</td></tr><tr><td>Infuse Kollagenschwamm mit rekombinantem menschlichem Knochen Morphogenes Protein-2</td><td>Medtronic</td><td>7510200</td><td>Klinisch relevante Behandlung als Positivkontrolle</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Clipper</td><td>10250</td><td>Anästhesie für Ratten</td></tr><tr><td>IVIS</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>Biolumineszenz-Bildgebungsmodalität</td></tr><tr><td>Jig</td><td>Custom</td><td></td><td>Wird verwendet, um bikortikale Stifte zu platzieren</td></tr><tr><td>Lipofectamine MessengerMAX</td><td>Fisher Scientific</td> LMRNA003 <td>mRNA-Komplexbildner, das die mRNA-Abgabe ermöglicht</td><td></td></tr><tr><td>Sensorcain-MPF (Bupivican (0,25%) und Epinephrin (1:200.000))</td><td>APP Pharmaceuticals, LLC</td><td>NDC 63323-468-37</td><td>Angewendet auf die Operationsstelle zur Schmerzlinderung und Vasokonstriktion</td></tr><tr><td>Steriles Wasser</td><td>Hospira</td><td>8904653</td><td>Wird als Lösungsmittel für Cefazolin-Pulver verwendet</td></tr><tr><td>Externe Fixateurplatten aus Titan</td><td>Kundenspezifisch</td><td></td><td>Hergestellt im Haus mit Titanschrott und Fräsmaschine</td></tr><tr><td>Total Performance System (TPS) Konsole</td><td>Stryker</td><td>OR-S-5100-1</td><td>Wird verwendet, um einen 5-mm-Defekt im Oberschenkelknochen</td></tr><tr><td>zu erzeugen TPS MicroSaggital Saw Stryker</td><td></td><td>OR-S-5100-34</td><td>Wird verwendet, um einen 5-mm-Defekt im Oberschenkelknochen zu erzeugen</td></tr><tr><td>Ultrafokus Faxitron mit DXA</td><td>Faxitron</td><td></td><td>Hochauflösende Röntgenbildgebungsmodalität</td></tr><tr><td>Uniprim Rattendiät</td><td>Envigo</td><td>TD.06596</td><td>Medizinische Rattendiät</td></tr><tr><td>Universal-Handschalter für TPS</td><td>Stryker</td><td>OR-S-5100-9</td><td>Wird verwendet, um 5 mm zu erstellen Defekt im Oberschenkelknochen</td></tr><tr><td>Vetbond Tissue Adhesive</td><td>3M</td><td>1469</td><td>Hautverschluss</td></tr></tbody></table>

eine zuverlässige und reproduzierbare kritische größe segmentale femoralen defekt-modell bei ratten mit einer benutzerdefinierten fixateur externe stabilisiert

A Reliable and Reproducible Critical-Sized Segmental Femoral Defect Model in Rats Stabilized with a Custom External Fixator

Orthopädische Forschung stützt sich stark auf Tiermodelle Mechanismen der Knochenheilung in Vivo zu untersuchen als auch die neue Behandlungstechniken zu untersuchen. Kritische Größe segmentale Mängel sind anspruchsvoll, um klinisch zu behandeln, und Forschungsanstrengungen könnten davon profitieren, eine zuverlässige, ambulante kleine Tiermodell eine segmentale femoralen Mangels. In dieser Studie präsentieren wir eine optimierte chirurgische Protokoll für die konsequente und reproduzierbare Schaffung eines kritischen Diaphysen Mangels 5 mm in eine Ratte Femur mit einem Fixateur externe stabilisiert. Die Diaphysen Ostectomy erfolgte mittels eine benutzerdefinierte Schablone 4 Kirschner Drähte Bicortically, platzieren die waren mit einem angepassten Fixateur externe stabilisiert. Eine oszillierende Knochensäge wurde verwendet, um den Defekt zu erstellen. Entweder ein Kollagen Schwamm allein oder eine Kollagen Schwamm RhBMP-2 in den Defekt implantiert wurde, und die Knochenheilung wurde über 12 Wochen mit Röntgenaufnahmen überwacht. Nach 12 Wochen Ratten wurden geopfert und histologischen Untersuchung erfolgte über die ausgeschnittenen Kontrolle und Oberschenkelknochen behandelt. Knochendefekten mit nur Kollagen Schwamm führte Pseudarthrose, während RhBMP-2 Behandlung die Bildung einer periostalen gefühllos und neue Knochenaufbau ergab. Tiere wieder gut nach der Implantation und externe Fixierung erwies sich als erfolgreich bei der Stabilisierung der femoralen Mängel über 12 Wochen. Dieses optimierte chirurgische Modell könnte leicht angewendet werden, um die Knochenheilung zu untersuchen und testen neue orthopädischen Biomaterialien und regenerative Therapien in Vivo.

Operationen wurden in ca. einer Stunde durch einen Operateur mit Hilfe eines Assistenten durchgeführt. Nach chirurgischen Optimierung Intra- und postoperative Komplikationen wurden stark minimiert und der Jig Apparatur gewährleistet einheitliche Größe (5 x 3 x 3 mm) und Lokalisierung von femoralen Mängel verwenden. Ratten wurden ambulante unmittelbar folgenden Erholung aus der Narkose und schien nicht zu einer veränderten Verhaltensmuster haben; Ihr Gang war nicht Schmerzkur, und sie ersc...

In Vivo Säugetier-Modelle der kritischen Größe Knochendefekte sind essentiell für Forscher heilenden Mechanismen und orthopädische Therapien. Hier stellen wir ein Protokoll für die Erstellung von reproduzierbaren, segmentale, femoralen Mängel bei Ratten mit Fixateur externe stabilisiert.

Eine zuverlässige und reproduzierbare kritische Größe segmentale femoralen defekt-Modell bei Ratten mit einer benutzerdefinierten Fixateur externe stabilisiert

Orthopedic research relies heavily on animal models to study mechanisms of bone healing in vivo as well as investigate the new treatment techniques. ...

Dieses chirurgische Protokoll verwendet ein konsistentes und reproduzierbares extern fixiertes segmentales Defektmodell, um die Heilungsmechanismen von Knochen und den Einsatz potenzieller regenerativer Therapien zu bewerten. Wir haben eine anspruchsvolle Operation zur Erstellung und Stabilisierung eines segmentalen Knochendefektmodells gestrafft, das zugänglich und kostengünstig ist und gleichzeitig für Längsheilungsstudien geeignet bleibt. Diese Technik ist besonders für die Behandlung von traumatischen diaphysischen Knochendefekten in kritischer Größe übertragbar, die von der Stabilisierung mit externer Fixierung profitieren können, obwohl das Modell weiterer Untersuchungen bedarf.Um eine Fraktur beim Bohren der Stifte zu verhindern, verwenden Sie hohe Drehungen pro Minute und einen niedrigen Druck, um den seitlichen Kortex zu durchstechen, und verringern Sie dann die Drehungen pro Minute, um voranzukommen. Nach der Vorbereitung des Gerüstes aus einem Knochen morphogenetischeprotein Rohr Knochen Transplantat-Kit, nach den Anweisungen des Herstellers, verwenden Sie sterile Schere und ein steriles Lineal, um den Kollagenschwamm zu trimmen, um einen fünf mal drei mal drei Millimeter Defekt zu passen. Verwenden Sie dann eine Spritze, um die knochenmorphogenetische Protein-2-Lösung gleichmäßig über die Oberfläche des Schwamms zu verteilen, bis das gesamte Volumen der Lösung absorbiert wird.Als nächstes rasieren Sie den Bereich um das Hinterbein einer anästhesierten Ratte mit der 13. Rippe, Hinterpfote und dorsalen und ventralen Mittellinien als Ränder, gefolgt von vier sequenziellen abwechselnden Peelings der exponierten Haut mit steriler Gaze, die in 10% Povidon-Jod und 70% Ethanol eingeweicht sind. Um den Oberschenkeldefekt zu induzieren, verlängern Sie das rasierte Bein durch einen fenestrated klaren klebrigen Drap und bedecken Sie die chirurgische Bank in sterilen Handtüchern, um ein steriles Feld zu schaffen. Palpate den Oberschenkelknochen und verwenden Sie eine Reihe 15 Klinge, um einen anterolateralen Schnitt durch die Haut zu schaffen, der sich von der Patella bis zum größeren Trochanter am proximalen Oberschenkelknochen erstreckt.Sorgfältig die seitliche Beinfaszie entlang des intermuskulären Septums einschneiden, um den Vastus lateralis Muskel der Quadrizeps nach hinten von den Sehnen zu trennen, bis der seitliche Oberschenkelknochen freigelegt ist. Halten Sie eine Skalpellklinge der Zahl 15 parallel zur Kontur der Knochenoberfläche, schneiden Sie den Muskel sanft vom darunter liegenden Knochen weg, um eine sorgfältige, atraumatische umlaufende Weichteilsektion durchzuführen, und beginnen Sie auf der seitlichen Oberfläche, setzen Sie den Oberschenkelknochen bei seiner mittleren Diaphyse aus. Verwenden Sie einen Periosteal-Aufzug, um den Muskel vom exponierten Knochen weg zu heben, während er seziert wird, und fahren Sie um den Oberschenkelschacht herum, bis sieben bis zehn Milliliter der zentralen Diaphyse von Weichgewebe auf allen Seiten gelöscht wurden.Als nächstes legen Sie einen Stift nur auf der Ebene des seitlichen Epicondyl, gefolgt von der Platzierung eines Jig bündig auf den seitlichen distalen Oberschenkelknochen, und legen Sie eine ein Millimeter Gewindespitze Kirschner Draht. Als nächstes, die Beibehaltung der Position der Jig auf dem Knochen, identifizieren, wo der proximale Pin wird den Knochen auf der Grundlage der Jig-Löcher eingeben. Sorgfältig eisern Sie parallel zu den Fasern der Gesäßsehne, wenn dies erforderlich ist, um eine kleine Lücke im Gewebe zu schaffen, damit der proximale Stift durchgehen kann, wodurch iatrogene Schäden an der Sehne minimiert werden.Bohren Sie einen ein Millimeter langen, nicht gefädelten k-Draht in den Spalt, und vergleichen Sie die Höhe des gebohrten Stifts mit dem losen Stift, um zu bestätigen, dass der Stift beide Kortiken eingreift. Halten Sie die Position des Jigs in Kontakt mit dem Knochen und bohren Sie zwei ein Millimeter Gewinde-K-Drähte, eine auf beiden Seiten der zukünftigen Defektstelle, um sicherzustellen, dass die Stifte beide Kortiken eingreifen, und legen Sie die externe Fixatorstange Ebene einen Zentimeter über der Haut. Schrauben Sie fest, verriegeln Sie die Leiste an Ort und Stelle, und klemmen Sie die überschüssigen Stiftlängen.Legen Sie einen kleinen gekrümmten Retraktor um den vorderen und hinteren Oberschenkelknochen, um das umgebende Weichgewebe, den Muskel und das neurovaskuläre Bündel zu schützen, und verwenden Sie ein etwa fünf Millimeter sagittal oszillierendes Sägeblatt und Licht, sogar Druck, um sehr vorsichtig einen segmentalen Defekt von fünf Millimetern durch die Mitteldiaphyse zu erzeugen. Spülen Sie die Wunde mit 10 Millilitern von 0,9% normaler Kochchen nach der Entstehung des Defekts, und verabreichen Sie 0,1 Milliliter 0,25%bupivacaine mit Epinephrin auf die Wunde als analgetische und vasokonstriktor. Setzen Sie das knochenmorphogenetische Protein-2 getränkte Schwammgerüst in den Defekt, und verwenden Sie eine 4-0 resorbierbare Naht in der einfachen unterbrochenen Muster, um die Muskelebene zu schließen.Schließen Sie dann die Hautschicht mit einer 4-0 resorbierbaren Naht in einem laufenden subcuticularen Muster, dann Hautkleber, um alle Lücken um die hervorstehenden Stifte zu schließen, und erhalten Sie ein anterior-posterior Radiobild des Oberschenkelknochens sofort, und vier und 12 Wochen nach der Operation. Negative Kontrolldefekte, die nur einen Kollagenschwamm enthalten, zeigen keine Hinweise auf eine Überbrückung der Osteogenese zwischen den proximalen und distalen Knochenrändern. Eine kleine Menge neuer Knochenumbauten kann direkt neben der geschnittenen Oberschenkelrand gesehen werden, während der Defekt selbst einen Mangel an knöchernem Material, das Vorhandensein von Knorpel und einige Resthämatome zeigt.Defekte, die Knochen morphogenetische Protein-2 getränkten Schwamm zeigen eine signifikante Knochenheilung bereits vier Wochen nach der Operation, wie durch die radiopaque kalolösen Überbrückung über den Defekt belegt. Nach 12 Wochen hat sich während des gesamten Defekts eine signifikante neue Mineralablagerung gebildet. Signifikante neue Periostealknochen können in der kalkulierenden Ausdehnung von der geschnittenen Oberschenkelmurkante beobachtet werden und die Spitzen von gewebten und lamellaren Knochen haben sich während des defekten entwickelt.Außerdem ist eine Knorpelablagerung nicht zu sehen. Die Bildgebung über das In Vivo Imaging System nach der Entfernung des externen Fixators ermöglicht die Visualisierung der biolumineszierenden transfizierten Zellen innerhalb des Defekts. Zum Beispiel, Zellen in der medullären Höhle leuchten nach der Transfektion mit komplexen mRNA-Codierung für Gaußsia luziferase, und könnte verwendet werden, um biologische Veränderungen in der Expression eines Gens oder Proteins von Interesse während des Heilungsprozesses zu messen.Die Pinplatzierung ist wichtig, um eine stabile, dauerhafte externe Fixierung zu gewährleisten. Die Stifte sollten direkt senkrecht zum Oberschenkelknochen und parallel zueinander sein, um Bruch und Infektion zu minimieren. Mit diesem Modell können biologische Mechanismen, wie z. B. spezifische Proteinausdrücke, überwacht werden, um die Heilung besser zu verstehen, und verschiedene Gerüstbiomaterialien oder Therapien können auch auf therapeutische Wirksamkeit getestet werden.Wir hoffen, dass diese Technik es zukünftigen Forschern ermöglichen wird, die orthopädische Heilung effizienter und effektiver mit externer Fixierung zu untersuchen, damit ihre Ergebnisse in verbesserte klinische Erfolge übersetzt werden können. Vermeiden Sie das Einatmen von Anästhetikum, tragen Sie die richtige persönliche Schutzausrüstung beim Umgang mit Formalin und EDTA und achten Sie beim Umgang mit chirurgischen Instrumenten, insbesondere der Bohr- und oszillierenden Knochensäge.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Einstellbare Steifheit, Fixateur externe für die Ratte Femurosteotomie und segmentale Knochendefekt Modelle

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Eine effiziente und reproduzierbare Protokoll für Ablenkung Osteogenesis in einem Rattenmodell führt zu einer funktionalen regenerierten Femur

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Eine zuverlässige und reproduzierbare kritische Größe segmentale femoralen defekt-Modell bei Ratten mit einer benutzerdefinierten Fixateur externe stabilisiert (Video) | JoVE Journal

Eine zuverlässige und reproduzierbare kritische Größe segmentale femoralen defekt-Modell bei Ratten mit einer benutzerdefinierten Fixateur externe stabilisiert

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