Name: Ein menschliches Blut-Hirn-Schnittstellenmodell Barriere Kreuzungen durch Krankheitserreger oder Medikamente und ihre Wechselwirkungen mit dem Gehirn zu studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Erfahren Sie die Einrichtung eines menschlichen Blut-Hirn-Schranken-Minibrain-Modells mit Polyester-Membran-Kulturinserts zur Untersuchung von Biomolekültransport und Pathogen-Interaktionen mit neuronalen Zellen.

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Diese Studie wurde unterstützt durch interne Zuschüsse vom Institut Pasteur, darunter einen förderlich Grant (PTR-435) und durch einen Zuschuss "Contrat de Soutien à la Recherche" zur Verfügung gestellt von Sanofi Pasteur, Institut Pasteur. A. da Costa wurde unterstützt von der Sanofi-Pasteur Grant und Florian Bakoa ist Empfänger von einem Promotionsstipendium zur Verfügung gestellt von ANRT (Association Nationale De La Recherche et De La Technologie). Wir sind verpflichtet, Pr Pierre-Olivier Couraud und Dr Florence Miller für hilfreiche Diskussionen.

Das geistige Eigentum des Systems war die Patente in 32, 35 und 38verwiesen wird.

In diesem Artikel wir gezeigt, wie man eine in Cellulo bauen Blut/Hirn-Schnittstelle, die BBB-Minibrain, durch die Kombination einer BBB-Modell und eine Kultur des Gehirn zerebrale Zellen (Minibrain) in einem einzigen Kit gemischt. Dieses System ist biologisch relevante, einfach einzurichten und für Experimentatoren, die gut ausgebildet in der Zellkultur zu behandeln.
Wie für jedes andere in-vitro-Modell von BBB würde zuverlässige Ergebnisse erzielt werden, wenn drastische Kontrolle der Dichti...

Das Gehirn wird von den Körperkreislauf durch eine nicht-durchlässigen Struktur getrennt, die den Austausch zwischen der Anwesenheit und das Blut, die Blut - Hirn-Schranke (BBB) genannt einschränkt. Meist bestehend aus zerebralen Endothelzellen, interagiert die BBB dynamisch mit perivaskuläre Mikroglia, Astrozyten und Neuronen in Anwesenheit von den benachbarten. Die drei Hauptfunktionen der BBB sind die Erstellung und Pflege der Ionischen Homöostase für neuronale Funktionen, Versorgung des Gehirns mit Nährstoffen und Schutz vor toxischen Verletzungen oder Eintrag von Krankheitserregern1,2, die dazu beitragen die Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns und seiner Funktionen3. Diese Barriere ist so effizient, dass nur wenige Medikamente die BBB4,5überqueren können. Derzeit bestehen die verfügbaren Methoden vorhersagen, ob ein Molekül die BBB passieren und in das Gehirn diffundieren von ex-Vivo-Studien auf Autopsie, Bild Materialverfolgung in das Gehirn der Probanden mittels MRT (Magnet-Resonanz-Tomographie) oder PET (Position emission Tomographie) oder Pharmakodynamik und pharmakokinetischen präklinischen Studien im Tiere6,7,-8. Diese Techniken und Modelle haben einige Einschränkungen, z. B. der begrenzten Auflösung der PET und die geringe Sensitivität der MRT6,8, die Schwierigkeit zu Molekülen (z. B. basierend Antikörpermoleküle zum Beispiel) so schlecht quantifizieren dringen Sie die Gehirn-7, und für die präklinische Studien Sie, ihre hohen Kosten und Resort von Tierversuchen.
Der letzte Punkt ist wichtig, weil nach der 3R Regeln, (Ersatz, Reduktion und Verfeinerung von Tierversuchen) die regulatorischen Behörden gebeten haben, entwickeln die Forscher dringend wissenschaftlich präzise Alternative zum Tier Experiment9,10,11,12,13,14,15.
In den letzten Jahrzehnten mehrere in-vitro-Modelle von BBB vorgeschlagen wurden16,17,18 durch den Anbau auf Filter Membran fügt Endothelzellen aus verschiedenen Arten wie Maus, Ratte, Rind und Schwein. Der menschlichen Spezies angeht, die knappe und schwere Verfügbarkeit von Primärzellen aufgefordert die Forscher menschliche Modelle basierend auf verewigt Gehirn endothelial Zellen oder menschliche Stammzellen19,20zu entwickeln, 21. Diese Barrieren sind richtige in-vitro-Surrogate von BBB, vorausgesetzt, dass sie Endothelzellen Marker, engen Kreuzung Marker, Efflux-Transporter, Solute Carrier, Rezeptoren ausdrücken, und reagieren auf die endotheliale Reize 20. Ein paar BBB-Modelle mit Membran Filtereinsätze beschichtet mit Endothelzellen und anderen Zelltypen (z.B. Astrozyten, Neuronen oder Perizyten22,23,24) wurden untersucht. Das Ziel dieser Co Kulturen war die BBB physikalischen Eigenschaften zu erhöhen, indem unter Ausnutzung der Sekretion der lösliche Faktoren von Astrozyten/Neuronen oder Perizyten.
Dennoch enthält keines dieser Modelle in Anwesenheit von zu studieren und das Schicksal der ein Arzneimittelkandidat vorherzusagen, sobald es die Barriere bestanden hat. Daher unser Ziel bestand darin, eine in Cellulo bauen Blut/Hirn-Schnittstelle, die BBB-Minibrain, durch die Kombination ein BBB-Modell und eine Kultur der gemischten Gehirnzellen in einem einzigen Kit. Die BBB-Minibrain verwendet ein Kultursystem bestehend aus einem porösen Filter in einen Brunnen von einem multiwell Zellplatte Kultur eingefügt. Der Filter ist mit hCMEC/D3 Zellen eines menschlichen Gehirns Endothelzellen Linie beschichtet, die hochzuverlässige für BBB Drogentests25,26,27, bilden die BBB nachgewiesen worden ist. Die Minibrain ist ein Co differenzierte Kultur der menschlichen Neuronen und Astrozyten, abgeleitet vom NTera/Cl2.D1 Zelle Zeile28,29 gemischt zusammen mit der menschlichen Mikroglia-Zell-Linie CHME/Cl530 im Verhältnis entspricht der Mikroglia vs. Neuron-Astrozyten Verhältnisse der Gehirn-31ist in der Unterseite der Platte gut kultiviert.
Neben dem Studium Durchgang von Drogen über die BBB und ihr Schicksal in das Parenchym, könnte die Blut-Hirn-Schnittstelle in Cellulo Modell ein mächtiges Werkzeug, um den Eintrag von Krankheitserregern in das Gehirn (Neuroinvasiveness), die Dispersion ins Gehirn (Neurotropism) Adresse und die Toxizität (Neurovirulence), die sie auf Gehirn Parenchymzellen ausüben können. Neurovirulence und Neuroinvasiveness Studien würde profitieren von der Entwicklung eines effizienten Cellulo Modell und vorteilhaft sein, Tiermodellen zu ersetzen. Mit der BBB-Minibrain Kit32, wir bewiesen Neuroinvasive Phänotyp selten viral Mutanten, die angesammelt in French Neurotropic Virus-Stamm des Gelbfieber-Virus (z.B. FNV-YFV33,34) zur Vorbereitung einer Lebendimpfstoff YFV und den Durchgang von einem neurogenerative und neuroprotektive Biomolekül genannt Neurovita (bezeichnet als NV fortan im Manuskript)35eingestellt. Da NV weder kreuzt natürlich die Zellmembran noch die BBB, NV wurde eine einzelne Kette Antikörpers von Lamas, die Kreuze der biologischen Membranen, einschließlich der BBB und fungiert als eine Zelle eindringen Molekül (CPM)36mit der Variable Teil (LHKW) verschmolzen. Die CPM-Eigenschaft des FHKW scheint der isoelektrischen Punkt und die Länge der LHKW37abhängen.
In diesem Cellulo Test sollen es ermöglichen, die Moleküle zu sortieren, die potenziell die BBB vor Durchführung der pharmakokinetischen und Pharmakodynamik Analyse bei Tieren, und im Idealfall in der gleichen Zeit in der Lage sein, ihr Verhalten in der nervösen vorherzusagen kreuzen könnte Parenchym. Dieses System ist biologisch relevante und einfach einrichten und verarbeiten von Fachleuten gut ausgebildet in Zelle Kultur26,29,30,38. Das Interesse eines solchen Cellulo testen wäre zweifach: Reduzierung der Kosten der präklinischen Tests auf der einen Seite und Verringerung des Einsatzes von Tierversuchen auf der anderen Seite.

<table><tbody><tr><td>12-Well-Platten</td><td>Corning</td><td>3336</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-2' Desoxyuridin</td><td>Merck-Sigma Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>85mm Petrischale</td><td>Sarstedt</td><td>83-3902-500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nf200</td><td>Merck-Sigma Aldrich</td><td>N4142</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercapto-ethanol</td><td>Merck-Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>CHME/Cl5</td><td>Unit&eacute; de Neuroimmunologie Virale</td><td>Auf Anfrage an Dr. Lafon</td><td></td></tr><tr><td>CMC</td><td>Calbiochem</td><td>217274</td><td></td></tr><tr><td>Cytosin &beta;-D-Arabinofuranosid</td><td>Merck-Sigma Aldrich</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>Dunkle 96-Well-Platten</td><td>Corning</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck-Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Endogro IV</td><td>Millipore</td><td>SCME004</td><td>Endothelzellmedium</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Carlo Erba</td><td>529121</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SV30015-04</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Merck-Sigma Aldrich</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>GIEMSA</td><td>RAL Diagnostic</td><td>320310</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti Maus</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>115-545-003</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti Kaninchen</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>R37117</td><td></td></tr><tr><td>HBSS mit Ca2+-Mg2+</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14025-100</td><td></td></tr><tr><td>hCMEC/D3</td><td>Cedarlane</td><td>CLU512</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1M</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15630-070</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>Merck-Sigma Aldrich</td><td>33263</td><td></td></tr><tr><td>Laminine</td><td>Merck-Sigma Aldrich</td><td>L6274</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Luzifer Gelb</td><td>Merck-Sigma Aldrich</td><td>L0259</td><td></td></tr><tr><td>MEM 10X</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>21430</td><td></td></tr><tr><td>MEM 1X</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>42360</td><td></td></tr><tr><td>Ntera/Cl2D.1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1973</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaft</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>PBS ohne Ca2+-Mg2+</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>PBS-Ca2+-MG2+</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14040-091</td><td></td></tr><tr><td>Stift/Strep</td><td>Eurobio</td><td>CXXPES00-07</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Merck-Sigma Aldrich</td><td>P1149</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Qiashredder</td><td>QIAGEN</td><td>79656</td><td></td></tr><tr><td>Rattenkollagen I</td><td>Cultrex</td><td>3443-100-01</td><td></td></tr><tr><td>Retinsäure All-Trans</td><td>Merck-Sigma Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>RNA-Aufreinigungskit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Merck-Sigma Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat 5,6%</td><td>Eurobio</td><td>CXXBIC00-07</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Thermofisher</td><td>Scientific 11360</td><td></td></tr><tr><td>T75 Cell+ Flasche</td><td>Sarstedt</td><td>83-1813-302</td><td>Gewebekultur-Polystyrolflasche mit spezifischer Oberflächenbehandlung (Cell+) für empfindliche adhärente Zellen</td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3460</td><td>Polyester poröse Membrankultureinsätze</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Merck-Sigma Aldrich</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Reinstwasser</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10977-035</td><td></td></tr><tr><td>Uridin</td><td>Merck-Sigma Aldrich</td><td>U3750</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15040-033</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>YFV-FNV</td><td>IP Dakar</td><td>Impfstofffläschchen</td><td></td></tr></tbody></table>

ein menschliches blut-hirn-schnittstellenmodell barriere kreuzungen durch krankheitserreger oder medikamente und ihre wechselwirkungen mit dem gehirn zu studieren

A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain

Die frühen screening Nervensystem Medikamente auf eine sachdienliche und zuverlässig in Cellulo BBB Modell für ihre Verbreitung und ihre Wechselwirkung mit der Barriere und die Anwesenheit von besteht noch ein ungedeckter Bedarf. Um diese Lücke zu füllen, entwarfen wir ein 2D in Cellulo Modell, die BBB-Minibrain, durch die Kombination einer Polyesters poröse Membran Kultur einfügen BBB Menschmodell mit einer Minibrain von einer Tri-Kultur der menschlichen Gehirnzellen (Neuronen, Astrozyten und Mikroglia-Zellen) gebildet. Die BBB-Minibrain erlaubt uns, testen Sie den Transport von eine neuroprotektive Arzneimittelkandidat (z. B. Neurovita), durch die BBB, bestimmen die spezifische Ausrichtung dieses Moleküls zu Neuronen und zu zeigen, dass die neuroprotektive Eigenschaft des Medikaments nach erhalten blieb das Medikament hatte die BBB überschritten. Wir haben auch gezeigt, dass BBB-Minibrain ein interessantes Modell stellt, im Laufe der Viruspartikel durch die Endothelzellen Schranke zu erkennen und die Infektion der Minibrain durch Neuroinvasive Viruspartikel zu überwachen. Die BBB-Minibrain ist ein zuverlässiges System, einfach zu handhaben für Forscher ausgebildet in Zellkulturtechnik und prädiktiv für die Gehirn-Zellen-Phänotypen nach Behandlung oder Beleidigung. Das Interesse eines solchen Cellulo testen wäre zweierlei: Einführung von Konzentrationsrisiken Schritte schon früh in der Entwicklung von Medikamenten auf der einen Seite und Verringerung des Einsatzes von Tierversuchen auf der anderen Seite.

Die BBB-Minibrain ist ein in Cellulo experimentellen Modell der Blut-Hirn-Schnittstelle.
Die BBB-Minibrain ist das Polyester Membran Kultur einfügen System eingerichtet, ein Blut-Fach auf der oberen Ebene und ein Gehirn-Fach auf der unteren Ebene der Blut-Hirn-Schnittstelle (Abb. 2AB) zu imitieren. Es besteht aus einem luminalen Fach mit hCMEC/D3 Endothelzellen auf ...

Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll beschreibt die Einstellung einer in Cellulo BBB (Blut-Hirn-Schranke)-Minibrain aus Polyester poröse Membran Kultur einfügen System um den Transport von Biomolekülen oder infektiöse Erreger über eine menschliche BBB zu bewerten und ihre physiologische Wirkung auf die benachbarten Gehirnzellen.

Ein menschliches Blut-Hirn-Schnittstellenmodell Barriere Kreuzungen durch Krankheitserreger oder Medikamente und ihre Wechselwirkungen mit dem Gehirn zu studieren

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the ...

Dieses menschliche Blut-Hirn-Schnittstellenmodell ist nützlich für die Untersuchung der Übertragung von Molekülen in das Neurosystem. Neben der Untersuchung von Mikroben erreichen einen infizierten Hirnschmerztumor. Die Zugabe des Mini-Gehirns zu dieser Blut-Hirn-Schranke oder BBB-Modell ermöglicht die Untersuchung unserer Krankheitserreger und Moleküle, die das BBB Verhalten im Gehirn verursachen.Das Verfahren wird Florian Bakao, der Doktorand für mein Labor, demostrating. Um ein BBB Mini-Gehirn-Polyester-Membran-Membran-Insert-Gerät einzurichten, verdünnen Sie die Zellen auf eine fünfmal 10 bis die vierte Zelle pro Insert-Konzentration unvollständiges Endothelzellmedium und fügen Sie das entsprechende Volumen von Zellen zu jedem Polyester-Membrankultureinsatz in einer 12-Well-Platte hinzu. Platzieren Sie dann die Inserts und den Zellkultur-Inkubator, bis die Zellen eine 100%ige Konfluenz erreichen.Halten Sie eine 12 WellPlatte mit einem Milliliter Poly-D-Lysin sie gut für vier Stunden bei Raumtemperatur. Gefolgt von einem Milliliter Laminin pro Brunnen über Nacht. Ersetzen Sie das Laminin durch einen Milliliter Endothelzellmedium, ergänzt durch 5% fetales Rinderserum oder FBS.Platzieren Sie den Platz für eine Stunde in einem Inkubator. Um das Minikorn sanft zu versuchen, die menschlichen Neuronen Astrozyten in CHME klonen fünf Zellen vorzubereiten. Ordnen Sie die Zellpellets dem kompletten Endothelzellmedium zu.Nach Zählung bei 3,6 mal 10 bis fünf Neuronen und Astrozyten auf 0,4 mal 10 bis zum fünften CHME-Klon haben fünf Zellen pro Brunnen eine 12-Well-Platte. Und säen Sie die 12 Brunnenplatte. Um das BBB Mini-Gehirn 24 Stunden nach der Aussaat zu konstruieren, ersetzen Sie das verwendete Medium durch frisches komplettes Endothelzellmedium und übertragen Sie die zerebralen mikrovaskulären endothelialen Zellbeschichteten Polyestermembrankultureinsätze über die Mini-Gehirnzellen.Legen Sie dann das BBB-Gerät viele Gehirn in den Inkubator. Um die BBB Mini-Gehirn-Endothelperinabilität zu validieren, fügen Sie 1,5 Milliliter Transportpuffer pro Brunnen zu einer neuen 12 Well-Platte hinzu. Und kippen Sie jeden Filter auf den Kopf, um das Medium vorsichtig zu entfernen, ohne die Endothelzellbarriere zu beeinträchtigen.Legen Sie jeden Filter in einen Brunnen der Transportpuffer gefülltplatte, und fügen Sie 0,5 Milliliter Luzifer gelb in jedem Brunnen. Legen Sie die Platte dann 10 Minuten lang in den Inkubator, bevor Sie die Filter in eine neue Transportpuffergefüllte 12 Wellplatte übertragen. Nach der Einrichtung eines BBB viele Gehirngerät wie gezeigt, fügen Sie 3500 Plattformeinheiten der französisch neurotrophen VirusStamm des Gelbfiebervirus verdünnt und 50 Mikroliter von 2%FPS Endothelzellmedium, sehr sorgfältig, auf der Oberseite der Luminal-Fach.Impfen Sie die Kontrolle BBB Mini-Gehirn mit 50 Mikroliter von 2%FBS Endothelzellmedium ohne Virus. Dann legen Sie das Virus setzen BBB viele Gehirngerät in den Inkubator für 24 Stunden. Entfernen Sie am nächsten Tag die Einsätze, um die Endothelzellpermeabilität und einen Begleiter genau wie gezeigt zu bestimmen.Speichern Sie einen Milliliter Probe aus jedem Brunnen, um den Virustiter im mittleren Fach zu bestimmen. Unter dem Einsatz sanft, um Leckagen des Luminalfachs in die abluminalen Fächer zu vermeiden. Um den Transport eines Neurons zu untersuchen, das auf Biomolekulare über die Bluthirnschranke abzielt, fügen Sie das Biomolekül von Interesse zu den Inserts hinzu und geben Sie die Platte an den Zellkultur-Inkubator zurück.Nach 24 Stunden aus der Ferne einsätze und bestimmen Endothelpermeabilität. Dann färben Sie die vielen Gehirnzellen mit dem entsprechenden Antikörper, um das Vorhandensein des Biomoleküls von Interesse im Mini-Gehirn zu erkennen. Menschliche zerebrale mikrovaskuläre Endothelzellen drücken alle Teilmengen von Rececptoren, Efflux-Transportern oder Transportern aus, die für ihre biologischen Funktionen wichtige relevante Proteine sind.Einige französische Neurotropic Virus Stamm von Gelbfieber-Virus kann die Blut-Hirn-Schranke nach 24 Stunden überqueren. Die Viren verstärken sich dann für die nächsten zwei Tage durch die Vermehrung des Virus in den Gehirnzellen. Darüber hinaus wird die Expression spezifischer viraler Biomarker stimuliert, wenn diese neuroinvasive virusische Population seriell auf den Mini-Gehirnzellen durchdrungen wird und streng mit der Viruslast korreliert.Nach der Hinzukommen an die Grenze der Kompartiment Zelle durchdringendmolekül Neuro-Tag Neurovita kreuzt die Blut-Hirn-Schranke und ist in der Lage, menschliche Neuronen ziel. Zelldurchdringende Molekül Neurotag Delta neurovita überschreitet die Endothelzellbarriere, zielt aber weniger effizient auf die menschlichen Neuronen. Nach der Hinzukommen in das kleine mittlere Fach, Zelle durchdringende Molekül Neuro-Tag Neurovita kreuzt die Blut-Hirn-Schranke und ist in der Lage, die Axone der menschlichen Neuronen zu regenerieren, nach der Wundung.Im Gegensatz zum zelldurchdringenden Molekül Neuro-Tag Neurovita Delta, der inaktiven Form von Neurovita. Bei Anwendung nach dem Axon Kratzen Zelle durchdringende Molekül Neuro-Tag Neurovita löst den Neuroschutz der verwundeten Neuronen und die x zonale Regeneration. Streng um der Praxis willen.I-Zell-Passagen nicht überverwenden. Versuchen Sie, einen Anschein von Medium und Regionen zu erhalten und überprüfen Sie, ob Mykoplasmen fehlen. Wechselwirkungen zwischen dem Mini-Gehirn und den Medikamenten sind Mikroben von Interesse können weiter durch Transkript untersucht werden, die diese oder klassische Biologie genannt Techniken chemischisieren.

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In diesem Video beschreiben wir ein umfassendes Protokoll zur Etablierung eines In-vitro-Modells, das die Blut-Hirn-Tumor-Schranke nachahmt. Das Modell verspricht, die Verabreichung von Therapeutika für die Behandlung von Hirntumoren zu verstehen.

Blut-Hirn-Tumor-Schranke oder BBTB-Modell: Eine Anpassung des Blut-Hirn-Schranken- oder BHS-Modells zur Bewertung der Verabreichung von Therapeutika an den Tumor

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