Ein menschliches Blut-Hirn-Schnittstellenmodell Barriere Kreuzungen durch Krankheitserreger oder Medikamente und ihre Wechselwirkungen mit dem Gehirn zu studieren
9. April 2019
Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll beschreibt die Einstellung einer in Cellulo BBB (Blut-Hirn-Schranke)-Minibrain aus Polyester poröse Membran Kultur einfügen System um den Transport von Biomolekülen oder infektiöse Erreger über eine menschliche BBB zu bewerten und ihre physiologische Wirkung auf die benachbarten Gehirnzellen.
Dieses menschliche Blut-Hirn-Schnittstellenmodell ist nützlich für die Untersuchung der Übertragung von Molekülen in das Neurosystem. Neben der Untersuchung von Mikroben erreichen einen infizierten Hirnschmerztumor. Die Zugabe des Mini-Gehirns zu dieser Blut-Hirn-Schranke oder BBB-Modell ermöglicht die Untersuchung unserer Krankheitserreger und Moleküle, die das BBB Verhalten im Gehirn verursachen.
Das Verfahren wird Florian Bakao, der Doktorand für mein Labor, demostrating. Um ein BBB Mini-Gehirn-Polyester-Membran-Membran-Insert-Gerät einzurichten, verdünnen Sie die Zellen auf eine fünfmal 10 bis die vierte Zelle pro Insert-Konzentration unvollständiges Endothelzellmedium und fügen Sie das entsprechende Volumen von Zellen zu jedem Polyester-Membrankultureinsatz in einer 12-Well-Platte hinzu. Platzieren Sie dann die Inserts und den Zellkultur-Inkubator, bis die Zellen eine 100%ige Konfluenz erreichen.
Halten Sie eine 12 WellPlatte mit einem Milliliter Poly-D-Lysin sie gut für vier Stunden bei Raumtemperatur. Gefolgt von einem Milliliter Laminin pro Brunnen über Nacht. Ersetzen Sie das Laminin durch einen Milliliter Endothelzellmedium, ergänzt durch 5% fetales Rinderserum oder FBS.
Platzieren Sie den Platz für eine Stunde in einem Inkubator. Um das Minikorn sanft zu versuchen, die menschlichen Neuronen Astrozyten in CHME klonen fünf Zellen vorzubereiten. Ordnen Sie die Zellpellets dem kompletten Endothelzellmedium zu.
Nach Zählung bei 3,6 mal 10 bis fünf Neuronen und Astrozyten auf 0,4 mal 10 bis zum fünften CHME-Klon haben fünf Zellen pro Brunnen eine 12-Well-Platte. Und säen Sie die 12 Brunnenplatte. Um das BBB Mini-Gehirn 24 Stunden nach der Aussaat zu konstruieren, ersetzen Sie das verwendete Medium durch frisches komplettes Endothelzellmedium und übertragen Sie die zerebralen mikrovaskulären endothelialen Zellbeschichteten Polyestermembrankultureinsätze über die Mini-Gehirnzellen.
Legen Sie dann das BBB-Gerät viele Gehirn in den Inkubator. Um die BBB Mini-Gehirn-Endothelperinabilität zu validieren, fügen Sie 1,5 Milliliter Transportpuffer pro Brunnen zu einer neuen 12 Well-Platte hinzu. Und kippen Sie jeden Filter auf den Kopf, um das Medium vorsichtig zu entfernen, ohne die Endothelzellbarriere zu beeinträchtigen.
Legen Sie jeden Filter in einen Brunnen der Transportpuffer gefülltplatte, und fügen Sie 0,5 Milliliter Luzifer gelb in jedem Brunnen. Legen Sie die Platte dann 10 Minuten lang in den Inkubator, bevor Sie die Filter in eine neue Transportpuffergefüllte 12 Wellplatte übertragen. Nach der Einrichtung eines BBB viele Gehirngerät wie gezeigt, fügen Sie 3500 Plattformeinheiten der französisch neurotrophen VirusStamm des Gelbfiebervirus verdünnt und 50 Mikroliter von 2%FPS Endothelzellmedium, sehr sorgfältig, auf der Oberseite der Luminal-Fach.
Impfen Sie die Kontrolle BBB Mini-Gehirn mit 50 Mikroliter von 2%FBS Endothelzellmedium ohne Virus. Dann legen Sie das Virus setzen BBB viele Gehirngerät in den Inkubator für 24 Stunden. Entfernen Sie am nächsten Tag die Einsätze, um die Endothelzellpermeabilität und einen Begleiter genau wie gezeigt zu bestimmen.
Speichern Sie einen Milliliter Probe aus jedem Brunnen, um den Virustiter im mittleren Fach zu bestimmen. Unter dem Einsatz sanft, um Leckagen des Luminalfachs in die abluminalen Fächer zu vermeiden. Um den Transport eines Neurons zu untersuchen, das auf Biomolekulare über die Bluthirnschranke abzielt, fügen Sie das Biomolekül von Interesse zu den Inserts hinzu und geben Sie die Platte an den Zellkultur-Inkubator zurück.
Nach 24 Stunden aus der Ferne einsätze und bestimmen Endothelpermeabilität. Dann färben Sie die vielen Gehirnzellen mit dem entsprechenden Antikörper, um das Vorhandensein des Biomoleküls von Interesse im Mini-Gehirn zu erkennen. Menschliche zerebrale mikrovaskuläre Endothelzellen drücken alle Teilmengen von Rececptoren, Efflux-Transportern oder Transportern aus, die für ihre biologischen Funktionen wichtige relevante Proteine sind.
Einige französische Neurotropic Virus Stamm von Gelbfieber-Virus kann die Blut-Hirn-Schranke nach 24 Stunden überqueren. Die Viren verstärken sich dann für die nächsten zwei Tage durch die Vermehrung des Virus in den Gehirnzellen. Darüber hinaus wird die Expression spezifischer viraler Biomarker stimuliert, wenn diese neuroinvasive virusische Population seriell auf den Mini-Gehirnzellen durchdrungen wird und streng mit der Viruslast korreliert.
Nach der Hinzukommen an die Grenze der Kompartiment Zelle durchdringendmolekül Neuro-Tag Neurovita kreuzt die Blut-Hirn-Schranke und ist in der Lage, menschliche Neuronen ziel. Zelldurchdringende Molekül Neurotag Delta neurovita überschreitet die Endothelzellbarriere, zielt aber weniger effizient auf die menschlichen Neuronen. Nach der Hinzukommen in das kleine mittlere Fach, Zelle durchdringende Molekül Neuro-Tag Neurovita kreuzt die Blut-Hirn-Schranke und ist in der Lage, die Axone der menschlichen Neuronen zu regenerieren, nach der Wundung.
Im Gegensatz zum zelldurchdringenden Molekül Neuro-Tag Neurovita Delta, der inaktiven Form von Neurovita. Bei Anwendung nach dem Axon Kratzen Zelle durchdringende Molekül Neuro-Tag Neurovita löst den Neuroschutz der verwundeten Neuronen und die x zonale Regeneration. Streng um der Praxis willen.
I-Zell-Passagen nicht überverwenden. Versuchen Sie, einen Anschein von Medium und Regionen zu erhalten und überprüfen Sie, ob Mykoplasmen fehlen. Wechselwirkungen zwischen dem Mini-Gehirn und den Medikamenten sind Mikroben von Interesse können weiter durch Transkript untersucht werden, die diese oder klassische Biologie genannt Techniken chemischisieren.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Einrichtung eines menschlichen Blut-Hirn-Schranke-(BBB-)Minihirnmodells unter Verwendung von kultivierbaren Inserten mit poröser Polyester-Membran, um den Transport von Biomolekülen und infektiösen Agenzien in das zentrale Nervensystem zu untersuchen. Das Ziel der Studie ist es, die physiologischen Auswirkungen auf benachbarte Hirnzellen zu bewerten und Erkenntnisse über die Wechselwirkungen zwischen der BBB und verschiedenen Pathogenen zu gewinnen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Infektionskrankheiten
Hintergrund
- Die Blut-Hirn-Schranke ist entscheidend für den Schutz des Gehirns, stellt jedoch gleichzeitig eine Herausforderung für die Arzneimittelaufgabe und den Zugang von Pathogenen dar.
- Das Minihirn-Modell ermöglicht Wechselwirkungen zwischen menschlichen Neuronen und der Blut-Hirn-Schranke.
- Dieser Ansatz erlaubt die Beurteilung der Permeabilität und physiologischen Auswirkungen verschiedener Moleküle.
Zweck der Studie
- Untersuchung des Transports von Biomolekülen und Viren über die Blut-Hirn-Schranke.
- Verständnis der Wirkung von Krankheitserregern auf neuronale Zellen.
- Entwicklung eines zuverlässigen Modells für zukünftige Arzneimitteltests und neurobiologische Untersuchungen.
Verwendete Methoden
- Die Studie nutzte ein Zellkultursystem mit Polyester-Membraneinsätzen in einer 12-Loch-Platte.
- Das biologische Modell umfasste humane zerebrale mikrovaskuläre Endothelzellen in Kombination mit humanen Neuronen und Astrozyten.
- Zu den entscheidenden Schritten gehörten die Zellkultivierung bis zur Konfluenz, die Applikation viraler Agentien und die Messung der endothelialen Permeabilität.
- Der Aufbau wurde inkubiert, und zu festgelegten Zeitpunkten wurden verschiedene Assays durchgeführt, um die Ergebnisse zu bewerten.
Hauptergebnisse
- Die Studie bestätigte, dass bestimmte Viren die Blut-Hirn-Schranke überwinden und sich in Gehirnzellen vermehren können.
- Zellpenetrierende Moleküle zeigten die Fähigkeit, Axone zu regenerieren und Neuroprotektion zu fördern.
- Validierungsversuche zeigten eine direkte Korrelation zwischen Viruslast und der Expression spezifischer Biomarker.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie ermöglicht ein vertieftes Verständnis der Dynamik der Blut-Hirn-Schranke und ihrer Wechselwirkungen mit Krankheitserregern.
- Die Ergebnisse unterstützen die Entwicklung therapeutischer Strategien, die auf die neurovaskuläre Grenzfläche abzielen.
- Die Implikationen reichen bis zu möglichen Interventionen bei Erkrankungen, die das Gehirn betreffen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das BBB-Minibrain-Modell schließt eine entscheidende Lücke in der frühen neurotherapeutischen Entwicklung, indem es eine vorhersagbare Bewertung des Blut-Hirn-Schranken-Transports und der Zielstrukturenbindung ermöglicht. Dieses für Menschen relevante In-Zellulo-System unterstützt die mechanistische Risikominderung von Wirkstoffkandidaten und die Untersuchung von Krankheitserregern vor Tierversuchen und entspricht damit den branchenüblichen Prioritäten hinsichtlich Übertragbarkeit und Verringerung des Tierversuchseinsatzes. Die Kompatibilität mit standardmäßigen Zellkulturarbeitsabläufen erleichtert die Integration in Entdeckungsprozesse zur Zielvalidierung und Assay-Entwicklung.
Strategische Anwendungen in der biopharmazeutischen Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen bezüglich der Arzneimittelfreigabe im zentralen Nervensystem und der Interaktionen zwischen Krankheitserregern und dem Gehirn.
- Operativer Wert: Bietet ein reproduzierbares, auf menschlichen Zellen basierendes System zur Beurteilung der Zielgenauigkeit und der Transportmechanismen über biologische Barrieren.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt frühzeitige Entscheidungen über die Fortführung oder Einstellung von Projekten, indem der Übertritt über Barrieren mit funktionellen Ergebnissen in Neuronen wie Neuroprotektion oder axonaler Regeneration korreliert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Messwerte zur molekularen Transportbewegung über die Barriere hinweg und zu den anschließenden zellulären Effekten im Minihirn-Kompartiment.
- Operativer Wert: Verwendet standardisierte Inserts und gut definierte Permeabilitätsassays (z. B. Lucifergelb), um Konsistenz und Skalierbarkeit des Assays sicherzustellen.
- Eignung für die Bildschirmanalyse: Kompatibel mit Hochdurchsatz-Screening-Formaten zur Bewertung von Bibliotheken neuroaktiver Verbindungen oder viraler Partikel.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Erhält die phänotypische Relevanz menschlicher Neuronen, Astrozyten und Mikrogliazellen aufrecht und unterstützt biomarkerbasierte Aussagen zu Neuroinvasion oder Neuroprotektion.
- Mechanistische Ent风险bewertung: Ermöglicht die Beobachtung der Pathogenvermehrung und Biomarker-Expression nach dem Überschreiten der Barriere und liefert damit Hinweise zur Bewertung von antiviralen oder neuroprotektiven Wirkstoffkandidaten.
- Krankheitsrelevante Systemplattform: Modelliert Wechselwirkungen der neurovaskulären Einheit, die auf neurodegenerative, infektiöse und neuroinflammatorische Krankheitskontexte anwendbar sind.
Pipeline- und Workflow-Integration
Das BBB-Minibrain fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein, insbesondere nach der Zielidentifizierung und vor der Leitstruktur-Optimierung, indem es eine für den Menschen relevante Plattform bietet, um die Exposition im Gehirn und die Zielmodulation zu bewerten.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zu Transportmechanismen der Barriere und nachgeschalteten neuronalen Wirkungen von Wirkstoffen oder Pathogenen.
- Screening: Ermöglicht die standardisierte Beurteilung des Penetrationsvermögens von Verbindungen oder Viren mit quantitativen nachgeschalteten Messgrößen in Gehirnzellen.
- Analytik: Liefert messbare Ergebnisse, einschließlich endothelialer Permeabilität, intrazellulärer Akkumulation und phänotypischer Veränderungen in Neuronen (z. B. Neuritenregeneration, Markerexpression).
- Translationale Forschung: Verknüpft Permeabilitätsdaten mit funktionellen Reaktionen von Gehirnzellen und unterstützt die Abstimmung von Biomarkern sowie die Bestätigung des Wirkmechanismus.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Für den wiederholten Einsatz in verschiedenen Projekten konzipiert, mithilfe standardisierter Zellkultivierungstechniken und kryokonservierter Zelllinien, wodurch der Aufwand für erneute Validierungen reduziert wird.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert das Vorhersagevertrauen hinsichtlich der ZNS-Drug-Delivery und Zielstrukturenbindung, indem menschliche Barrier-Hirn-Interaktionen modelliert werden.
- Operationaler Wert: Verwendet zugängliche Zellkultivierungstechniken und Standardlaborausrüstung und reduziert so den Bedarf an spezieller Ausbildung.
- Strategischer Wert: Verringert die Abhängigkeit von Tierversuchen bei der frühen Durchlässigkeitstestung der Blut-Hirn-Schranke, verbessert die ethische Verträglichkeit und erhöht die Durchsatzrate der Studien.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten basierend auf nachgewiesener Hirndurchgängigkeit und zielstrukturenspezifischer Aktivität.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultur humaner Zellen, einschließlich der Pflege von endothelialen Zellen, Neuronen, Astrozyten und Mikroglia.
- Basiert auf Polyester-Membran-Einsätzen mit Poren und einer Standard-12-Well-Platten-Ausstattung, die mit Inkubatoren und Bildgebungssystemen kompatibel ist.
- Erfordert die Standardisierung der Zellsägetichte, Mediumzusammensetzungen und der Zeitpunkte für Permeabilitätsassays über verschiedene Arbeitsgruppen hinweg.
- Die Anpassung an alternative Krankheitsmodelle kann eine Validierung der Stabilität des Zellphänotyps und der Barrierefunktion über verlängerte Kultivierungszeiträume notwendig machen.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören mögliche Variabilität der primären Zellquellen und die Notwendigkeit routinemäßiger Mykoplasmen-Tests zur Sicherstellung der Datenzuverlässigkeit.
Biopharma-FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:36
Human Cerebral Microvascular Endothelial Cell (hCMEC)/D3 Insert Coating and Blood Brain Barrier (BBB) Preparation
2:48
BBB-Minibrain Endothelial Permeability Validation
3:38
BBB Crossing and Multiplication of Yellow Fever Viruses in the Minibrain and Biomolecule BBB Crossing and Brain Cell Targeting
5:22
Results: Representative BBB-Minibrain Testing of Neuroinvasive Variants and Biomolecule Properties
7:19
Conclusion
