Name: Isolation, Vermehrung und Prion-Protein-Expression während neuronaler Differenzierung von Stammzellen menschlichen Zahnpulpa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Erfahren Sie die effiziente Isolation und Vermehrung menschlicher Dentalpulpa-Stammzellen mit 90% Erfolgsrate. Diese Methode untersucht die Prion-Protein-Expression während der neuronalen Differenzierung für Anwendungen in der regenerativen Medizin.

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Diese Arbeit wurde von der "Fondazione Varrone" und Rieti Universität Hub "Sabina Universitas" zu Vincenzo Mattei unterstützt.
Abbildung 5 (A, B) abgedruckt mit freundlicher Genehmigung des Verlags Taylor & Francis Ltd aus: Rolle des Prion-Protein-EGFR multimolecular Komplex während neuronaler Differenzierung der menschlichen dental Pulp-Stammzellen. Martellucci, S., Manganelli V. C. Santacroce, Santilli F., Piccoli L., M. Sorice Mattei V. Prion. 2018 4 Mar. Taylor & Francis Ltd.

Dritte Molaren, die in der Studie verwendet wurden von Patienten (13-19 Jahre alt) mit keine vorherige Erfahrung im Bereich der Drogen- oder Alkoholkonsum, alle Nichtraucher-Zimmer und mit geeigneten Mundhygiene herausgeschnitten. Am Tag der Erklärung an die Abteilung Wissenschaft Zahnheilkunde und Kieferchirurgie der Universität Rom "La Sapienza" wurde von den Patienten oder die Eltern Einwilligung eingeholt. Die Einwilligung wurde basierend auf ethischen Überlegungen und Zustimmung der Ethik-Kommission.
1. Zahn und Zahnpulpa Extraktion
<ol><li>
Vorbereitung des entsprechenden Mediums für die Erhaltung oder Transport.
	<ol>
<li>Dulbeccos geändert Eagle mittlere niedrigen Konzentration von Glukose (DMEM-L) mit L-Glutamin (494,5 mL) vorzubereiten.</li>
		<li>Geben Sie 5 mL von Penicillin/Streptomycin (1 %) und 0,5 mL Amphotericin (0,1 %).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Der dritte Molar vom Patienten zu extrahieren, schnell spülen Sie ihn mit PBS, legen Sie in einem 15 mL Reagenzglas mit dem Medium und überträgt es auf das Labor in weniger als 2 h.</li>
	<li>Öffnen Sie unter der Haube ein Biohazard den Zahn mit einem Cutter von koronalen Schnittlaufs parallel und tangential durch das Dach der Pulpakammer.</li>
	<li>Vorsichtig entfernen Sie, das Fruchtfleisch mit einem kleinen Bagger und legen Sie sie in ein Reagenzglas.</li>
	<li>Dreimal mit PBS waschen und Zentrifugieren bei 2.500 X g für 10 min bei RT</li>
</ol>2. Verarbeitung der Pulpa und Stammzell-Release
<ol><li>Entfernen des Überstands, Aufschwemmen das Pellet in Hanks Lösung und legen Sie sie in eine Petrischale. 2 h bei 37 ° C in 5 % CO2inkubieren.</li>
	<li>
Typ IV Kollagenase Vorbereitung der Lösung.
	<ol>
<li>Bereiten Sie 0,8 mL DMEM-L.</li>
		<li>Schmelzen Sie 1 mg Typ IV Kollagenase in 0,8 mL DMEM-L und Vortex für mehrere Minuten.</li>
		<li>Fügen Sie DMEM-L bis zu 1 mL, eine Endkonzentration haben 1 mg/mL.</li>
		<li>Filtern Sie die Lösung mit einem 0,22 µM-Filter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hank es Lösung durch Zentrifugation bei 2.500 X g für 10 min bei RT entfernen und dem Fruchtfleisch in kleine Scheiben ca. 1 mm jeweils mit einem Einweg Skalpell unterteilen.</li>
	<li>Legen Sie die Zellstoff-Scheiben in einer Petrischale und inkubieren Sie mit 1 mL Typ IV Kollagenase für 15 min bei 37 ° C in 5 % CO2.</li>
	<li>
Mittlere Kultur Vorbereitung (500 mL).
	<ol>
<li>Auf 445 mL DMEM-L mit L-Glutamin.</li>
		<li>Fügen Sie 50 mL der fetalen Bovine Serum (FBS) (10 %).</li>
		<li>Fügen Sie 5 mL von Penicillin/Streptomycin (1 %).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Probe bei 2.500 X g für 10 min bei RT, entfernen des Überstands, Aufschwemmen das Pellet in das Medium (Schritt 2.5) und Kultur in T25 Kolben speziell für Stammzellen bei 37 ° C in 5 % CO2.</li>
</ol>(3) Stammzelle-Kultur und Vermehrung
<ol><li>Jeden Tag überprüfen Sie die Kultur und nach 3 Tagen des Wachstums beobachten Sie verschiedene Klone von adhärenten Zellen innerhalb der Flasche.</li>
	<li>Alle 3 Tage ändern das Kulturmedium.</li>
	<li>Zwischen 7 und 12 Tagen sobald die adhärenten Zellen erreichen Zusammenfluss haben, lösen sie durch Behandlung der Zellen mit 1 mL Trypsin-EDTA für 3 min bei 37 ° C oder sanft mit einem Zelle Schaber.</li>
	<li>Fügen Sie 4 ml (Verhältnis 1:5) des Kulturmediums (Schritt 2.5), Trypsin-Aktion zu stoppen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 6 min bei 259 X g, entfernen Sie überstand zu und legen Sie die Zellen in einem T25 Kolben zu propagieren. Hinweis: Alle 3 Tage erreichen die Zellen Zusammenfluss.</li>
	<li>Verbreiten Sie die Zellen bis zu 21 oder 28 Tage (ca. 6-8 Gänge), das Vorhandensein von nicht-Stamm wie Zellen in der Kultur zu vermeiden.</li>
	<li>Lösen Sie die Zellen mit 1 mL Trypsin-EDTA für 3 min bei 37 ° C oder sanft kratzen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 6 min bei 259 X g.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand zu und testen Sie die Zellen für die Cytofluorimetric Analyse (Schritt 6).</li>
</ol>(4) vorübergehende PrPC Silencing durch siRNA
<ol><li>Kultur der hDPSCsin-6-Well-Platten (2 x 105 Zellen/mL) mit 2 mL Kulturmedium (Schritt 2.5) für 24 h.</li>
	<li>
Am darauffolgenden Tag bereiten SiRNA PrP Medium (400 µL).
	<ol>
<li>Hinzufügen einer sterilen Reagenzglas 384 µL DMEM-L.</li>
		<li>1 µL für jede Art von SiRNA PrP hinzufügen DMEM-L haben eine Endkonzentration von 5 nM (4 SiRNA PrP verwendet wurden und verifiziert durch den Lieferanten garantieren eine Knockdown Effizienz ≥70 %).</li>
		<li>DMEM-L. 12 µL Transfectionreagent hinzufügen</li>
		<li>Wirbel der Mischung und 10 min bei RT ermöglicht die Bildung von komplexen Transfektion inkubieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jede Probe 400 μl SiRNA PrP Medium hinzu und 6 h bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Fügen Sie ohne SiRNA PrP Medium zu verwerfen, 1,6 mL Kulturmedium (Schritt 2.5) (Verhältnis von 1 bis 5).</li>
	<li>Lassen Sie die Zellen für 72 h bei 37 ° C.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand zu und waschen Sie 3 Mal mit 2 mL PBS bei RT</li>
	<li>Fügen Sie 2 mL der neuronalen Kulturmedium für 7 bzw. 14 Tage (Schritt 5.1).</li>
	<li>Ändern der neuronalen Kulturmediums alle 3 Tage. Hinweis: Ersetzen Sie der SiRNA PrP Lösung jeder Zeit ersetzen die neuronalen Kulturmedium.</li>
	<li>Am Ende der Zeit 3 Mal mit 2 mL PBS bei RT waschen und testen für neuronale Oberflächenantigenen von Western-Blot Analyse.</li>
</ol>(5) neuronale Einführungsprozess des hDPSCs
<ol><li>
Neuronale Kulturmedium Vorbereitung (500 mL).
	<ol>
<li>Bereiten Sie 444,7 mL basale Medien formuliert, um neuronale Zellen.</li>
		<li>Das Medium fügen Sie 50 mL serumfreien Ergänzung zur Unterstützung der langfristigen Rentabilität des embryonalen und adulten neuronalen Stammzellen (10 %) eingesetzt hinzu.</li>
		<li>Das Medium (Endkonzentration 20 ng/mL) 200 µL des basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) (Endkonzentration 40 ng/mL) und 100 µL der epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) hinzufügen.</li>
		<li>Geben Sie 5 mL von Penicillin/Streptomycin (1 %) auf das Medium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kultur hDPSCs in 6-Well-Platten (2 x 105 Zellen/mL) bis zu 28 Tage von der Zellstoff-Trennung und mit 2 mL der neuronalen Kulturmedium zu stimulieren.</li>
	<li>Alle 3 Tage überstand verwerfen, 3 Mal mit 2 mL PBS bei RT waschen und 2 mL der neuronalen Kulturmedium zu ersetzen.</li>
	<li>Lösen Sie nach 7 bzw. 14 Tage die Zellen mit 1 mL Trypsin-EDTA für 3 min bei 37 ° C oder vorsichtig mit einem Schaber.</li>
	<li>Fügen Sie 4 mL (Verhältnis 1:5) Kulturmedium (Schritt 2.5), Trypsin-Aktion zu stoppen.</li>
	<li>Test für das Vorhandensein von neuronalen Oberflächenantigenen (Schritt 6) oder die Prion-Protein-Expression (Schritt 7) durch Flow-Zytometrie-Analyse.</li>
</ol>6. Charakterisierung der hDPSCs von Flow Cytometry
<ol><li>Wählen Sie mesenchymaler Stromazellen (MSC)-spezifische oder neuronale Oberflächenantigenen.</li>
	<li>Kultur der hDPSCs in 6-Well-Platten (2 x 105 Zellen/mL) mit 2 mL Kulturmedium (Schritt 2.5).</li>
	<li>Lösen Sie hDPSCs mit 28 Tagen von der Zahnpulpa Trennung oder nach 14 Tagen der neuronalen Kulturmedium (Schritt 5.1) mit 1 mL Trypsin-EDTA für 3 min bei 37 ° C oder sanft Schaber.</li>
	<li>4 ml (Verhältnis 1:5) Kulturmedium (Schritt 2.5), Trypsin-Aktion zu stoppen und entmischen bei 259 X g für 6 min bei RT Waschen ein anderes 2 Mal mit 2 mL PBS bei RT</li>
	<li>Befestigen Sie die behandelten oder unbehandelten hDPSCs mit 4 % Paraformaldehyd in PBS für 10 min bei 4 ° c</li>
	<li>Permeabilize hDPSCS mit 0,1 % (V/V) nichtionisches Tensid mit PBS-Puffer für zusätzliche 10 min bei RT</li>
	<li>Führen Sie die Sperrung mit 5 % getrockneten Magermilch in 1 mL PBS für 1 h bei RT</li>
	<li>3 Mal mit 1 mL PBS waschen und inkubieren Sie die Zellen mit Anti-CD105 (1: 100 / 5 x 105 Zellen), Anti-CD44 (1: 100 / 5 x 105 Zellen), Anti-STRO-1 (1: 100 / 5 x 105 Zellen), Anti-CD90 (1: 100 / 5 x 105 Zellen), Anti-CD73 (1: 100 / 5 x 105 Zellen), anti-β3-Tubulin (1: 100 / 5 x 105 Zellen), Anti-NFH (1: 100 / 5 x 105 Zellen) und Anti-GAP43 (1: 100 / 5 x 105 Zellen) mAb für 1 h bei RT</li>
	<li>Die Zellen 3 Mal mit 1 mL PBS waschen und inkubieren Sie mit Anti-Maus-PE (01:50 / 5 x 105 Zellen) oder Anti-Kaninchen-CY5 (01:50 / 5 x 105 Zellen) mAb für zusätzliche 1 h bei RT</li>
	<li>Verwenden Sie die sekundäre Antikörper für gating Immunopositive Zellen (Anti-Maus-PE oder Anti-Kaninchen-CY5-mAb) und analysieren Sie alle Proben mit einem Durchflusszytometer und erwerben Sie mindestens 20.000 Veranstaltungen.</li>
</ol>7. Bewertung der PrPC Ausdruck in hDPSCs von Flow Cytometry Analysis
<ol><li>Kultur der hDPSCsin-6-Well-Platten (2 x 105 Zellen/mL) mit 2 mL Kulturmedium (Schritt 2.5).</li>
	<li>Lösen Sie hDPSCs mit 21 und 28 Tagen Zahnpulpa Trennung und nach 7 bzw. 14 Tage mit neuronalen Kulturmedium (Schritt 5.1) mit 1 mL Trypsin-EDTA zu und stoppen Sie die Trypsin-Aktion zu, wie unter Punkt 6.4 beschrieben. Befestigen Sie die Exemplare mit 4 % Paraformaldehyd in PBS für 10 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Permeabilize mit 0,1 % (V/V) nichtionischen Surfactantin PBS für 10 min bei RT. Entfernen Sie den Überstand und die Zellen mit Kaninchen Anti-PrP mAb EP1802Y (01:50 / 5 x 105 Zellen) Flecken mAb für 1 h bei RT inkubieren mit Anti-Kaninchen CY5 (01:50 / 5 x 105 Zellen) mAb für zusätzliche 1 h bei RT</li>
	<li>Alle Proben mit einem Durchflusszytometer analysiert und mindestens 20.000 Veranstaltungen zu erwerben.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dabei konzentrierten wir uns auf Methoden zur Isolierung und neuronale Differenzierung der hDPSCs; Darüber hinaus haben wir die Rolle des PrPC in diesem Prozess ausgewertet. Es gibt verschiedene Methoden, zu isolieren und hDPSCs in Neuron-wie Zellen und kritischen Schritte während des Prozesses zu unterscheiden. hDPSCs sind in der Lage, mehrere Linien wie Neuronen, Chondroblasten, Adipozyten und Osteoblasten differenzieren. In unserem Paper untersuchten wir die Mechanismen der neuronale Differenzierung und das...

Mesenchymaler Stammzellen wurden isoliert aus verschiedenen Geweben, einschließlich Knochenmark, Nabelschnurblut, menschliche Zahnpulpa, Fettgewebe und Blut1,2,3,4,5 , 6. wie von mehreren Autoren berichtet, zeigen hDPSCs Kunststoff festhalten, eine typische Fibroblasten-ähnliche Morphologie. Diese stellen eine sehr heterogene Bevölkerung mit verschiedenen Klonen und Unterschiede in der proliferativen und differenzierenden Kapazität7,8. hDPSCs express spezifischer Marker für mesenchymale Stammzellen (d.h. CD44, CD90, CD73, CD105, STRO-1), sie sind negativ für einige hämatopoetischen Marker (z. B. CD14 und CD19) und sind in der Lage, in-vitro-multilineage Differenzierung9, 10,11.
Mehrere Autoren haben gezeigt, dass diese Zellen in der Lage sind zu differenzieren in Neuron-wie Zellen mit verschiedenen Protokollen, die den Zusatz von NGF, bFGF, EGF in Kombination mit den spezifischen Medien und Ergänzungen7,-12enthalten. Auch viele Proteine während neuronaler Differenzierungsprozess beteiligt sind, und unter diesen sind mehrere Papiere zeigen eine wichtige Rolle und Ausdruck des zellulären Prion-Proteins (PrPC), beide in embryonalen und adulten Stammzellen13, 14. PrPC stellt einen pleiotropen Molekül in der Lage verschiedene Funktionen innerhalb der Zellen als Kupfermetabolismus, Apoptose, und Widerstand gegen oxidativen stress15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.
In unseren bisherigen Papier23untersuchten wir die Rolle von PrPC in den hDPSCs neuronalen Differenzierungsprozess. In der Tat hDPSCs express altklug PrPC und nach neuronaler Differenzierung war es möglich, eine zusätzliche Erhöhung zu beobachten. Andere Autoren die Hypothese auf einer möglichen Rolle von PrPC in neuronale Differenzierungsprozesse von Stammzellen. In der Tat treibt PrPC die Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen in Neuronen, Oligodendrozyten und Astrozyten24. Der Zweck dieser Studie war, die Methodik für die Gewinnung von Stammzellen aus Zahnpulpa, seine Differenzierungsprozess und die Rolle der PrPC während neuronaler Differenzierung zu betonen.

<table><tbody><tr><td>Amphotericin B-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td>Es wird zur Ergänzung von Zellkulturmedien verwendet, es ist ein Polyen-Antimykotikum von Streptomyce</td></tr><tr><td>Anti-B3tubulin</td><td>Cell Signaling Technology&nbsp;</td><td>#4466</td><td>Als eine von sechs B-Tubulin-Isoformen wird sie während der fetalen und postnatalen Entwicklung stark exprimiert, bleibt aber im peripheren Nervensystem hoch</td></tr><tr><td>Anti-CD105&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>611314</td><td>Endoglin (CD105), ein Hauptglykoprotein des menschlichen Gefäßendothels, ist ein integrales Membranprotein vom Typ I mit einer großen extrazellulären Region, einer hydrophoben Transmembranregion und einem kurzen zytoplasmatischen Schwanz</td></tr><tr><td>Anti-CD44</td><td>Millipore</td><td>CBL154-20ul</td><td>Positive Zellmarker Antikörper, die gegen mesenchymale Stammzellen gerichtet</td></tr><tr><td>sind Anti-CD73&nbsp;</td><td>Zellsignaltechnologie&nbsp;</td><td>13160</td><td>CD73 ist ein 70 kDa Glykosylphosphatidylinositol-verankertes, membrangebundenes Glykoprotein, das die Hydrolyse von extrazellulären Nukleosidmonophosphaten in bioaktive Nukleoside katalysiert</td></tr><tr><td>Anti-CD90</td><td>Millipore</td><td>CBL415-20ul</td><td>Positive Zellmarker Antikörper, die gegen mesenchymale Stammzellen gerichtet</td></tr><tr><td>sind Anti-GAP43&nbsp;</td><td>Zellsignaltechnologie&nbsp;</td><td>#8945</td><td>Ist ein spezifisches, wachstumsassoziiertes Protein des Nervensystems in Wachstumskegeln und Bereichen mit hoher Plastizität</td></tr><tr><td>Anti-Maus PE&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab7003</td><td>ist ein Antikörper, der in der Durchflusszytometrie oder FACS-Analyse verwendet wird</td></tr><tr><td>Anti-NFH&nbsp;</td><td>Zellsignaltechnologie&nbsp;</td><td>#2836</td><td>ist ein Antikörper, der endogene Spiegel des gesamten Neurofilament-H-Proteins</td></tr><tr><td>Anti-PrP mAb nachweist EP1802Y&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab52604</td><td>Kaninchen monoklonal [EP 1802Y] zu Prion Protein PrP</td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen CY5&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab6564</td><td>ist ein Antikörper, der in der Durchflusszytometrie oder FACS-Analyse verwendet</td></tr> wird <tr><td>Anti-STRO 1</td><td>Millipore</td><td>MAB4315-20ul</td><td>Positive Zellmarker Antikörper, die gegen mesenchymale Stammzellen gerichtet</td></tr> sind <tr><td>B27 Supp XF CTS</td><td>Gibco von life technologies</td><td>A14867-01</td><td>B-27&nbsp; kann verwendet werden, um die Induktion von humanen neuralen Stammzellen (hNSCs) aus pluripotenten Stammzellen (PSCs), die Expansion von hNSCs, Differenzierung von hNSCs und Erhaltung reifer differenzierter Neuronen in Kultur</td></tr><tr><td>BD Accuri C6 Durchflusszytometer&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>AC6531180187</td><td>Durchflusszytometer, ausgestattet mit einem blauen Laser (488 nm) und einem roten Laser (640 nm)</td></tr><tr><td>BD Accuri C6 Software&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Steuert das BD Accuri C6 Durchflusszytometer-System, um Daten zu erfassen, Statistiken zu erstellen und Ergebnisse zu analysieren</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>PeproThec, DBA</td><td>100-18B</td><td>basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor&nbsp;</td></tr><tr><td>Zentrifuge CL30R</td><td>Termo fisher Scientific</td><td>11210908</td><td>es ist ein Gerät, das zur Trennung von Flüssigkeiten, Gas oder Flüssigkeit verwendet wird, basierend auf der Dichte</td></tr><tr><td>CO2 Inkubator 3541</td><td>Termo fisher Scientific</td><td>317527-185</td><td>es gewährleistet optimale und reproduzierbare Wachstumsbedingungen für Zellkulturen</td></tr><tr><td>Kollagenase, Typ IV & nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17104019</td><td>Kollagenase ist eine Protease, die die Bindung zwischen einer neutralen Aminosäure (X) und Glycin in der Sequenz Pro-X-Glyc-Pro spaltet, die mit hoher Frequenz in Kollagen vorkommt.</td></tr><tr><td></td><td>Swann-Morton</td><td>501</td><td>Es wird verwendet, um Gewebe</td></tr><tr><td>zu schneiden DMEM-L</td><td>Euroclone</td><td>ECM0060L</td><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose mit L-Glutamin mit Natriumpyruvat</td></tr><tr><td>EGF</td><td>PeproThec, DBA</td><td>AF-100-15</td><td>Epidermaler Wachstumsfaktor&nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco von life technologies</td><td>10270-106</td><td>FBS ist ein beliebtes Nahrungsergänzungsmittel, da es eine breite Palette von Funktionen in der Zellkultur bietet. FBS liefert Nährstoffe, Wachstums- und Bindungsfaktoren und schützt die Zellen vor oxidativen Schäden und Apoptose durch Mechanismen, die in serumfreien Medien (SFM)-Systemen schwer zu reproduzieren sind</td></tr><tr><td>Filtropur BT50 0,2.500 mL Flaschenaufsatzfilter</td><td>Sarstedt</td><td>831.823.101</td><td>Es ist ein Gerät, das zur Filtration von Lösungen verwendet wird</td></tr><tr><td>Flexitube GeneSolution für PRNP</td><td>Qiagen</td><td>GS5621</td><td>4 siRNAs für das Entrez-Gen 5621. Zielsequenz N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA&nbsp; N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA&nbsp; N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA&nbsp; Nr. 4&nbsp; Die</td></tr><tr><td>Lösung von Hank 1x</td><td>Gibco von life technologies</td><td>240200083</td><td>Die wesentliche Funktion von Hanks&prime; Ausgewogene Salzlösung dient zur Aufrechterhaltung des pH-Werts sowie des osmotischen Gleichgewichts. Es versorgt die Zellen auch mit Wasser und essentiellen anorganischen Ionen</td></tr>. <tr><td>HiPerFect Transfektionsreagenz&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>301705</td><td>HiPerFect Transfect Reagenz ist eine einzigartige Mischung aus kationischen und neutralen Lipiden, die eine effektive siRNA-Aufnahme und eine effiziente Freisetzung von siRNA in Zellen ermöglicht, was zu einem hohen Gen-Knockdown führt, selbst wenn niedrige siRNA-Konzentrationen</td></tr> verwendet werden.<tr><td></td>Das Neurobasal-A-Medium <td>von Gibco by life technologies</td><td></td><td>ist ein Basalmedium 10888022, das für die langfristige Erhaltung und Reifung reiner postnataler und adulter Gehirnneuronen entwickelt wurde.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td>Paraformaldehyd wird zur Fixierung von Zell- und Gewebeschnitten während der Färbung</td></tr> von <tr><td>Penicillin/Streptomycin verwendet.</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D&nbsp;</td><td>Es wird zur Ergänzung von Zellkulturmedien verwendet, um die bakterielle Kontamination zu kontrollieren</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Euroclone</td><td>ECB4004LX10&nbsp;</td><td>PBS ist eine ausgewogene Salzlösung, die für die Handhabung und Kultivierung von Säugetierzellen verwendet wird. PBS wird verwendet, um Säugetierzellen zu bewässern, zu waschen und zu verdünnen. Phosphatpufferung hält den pH-Wert im physiologischen Bereich</td></tr><tr><td>TC-Platte 6 Well, Cell+,F</td><td>Sarstedt</td><td>833,920,300</td><td>Es ist eine Wachstumsoberfläche für adhärente Zellen</td></tr><tr><td>Gewebekulturkolben T-25,Cell+,Belüftete Kappe</td><td>Sarstedt</td><td>833,910,302</td><td>Gewebekulturkolben T-25, Polystyrol, Cell+ Wachstumsfläche für empfindliche adhärente Zellen, z.B. Primärzellen, schräger Hals, Beatmungskappe, gelb, steril, pyrogenfrei, nicht zytotoxisch, 10 Stk./Beutel</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>Weit verbreitetes nichtionisches Tensid zur Rückgewinnung von Membrankomponenten unter milden, nicht denaturierenden Bedingungen</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA&nbsp;</td><td>Euroclone</td><td>ECB3052D&nbsp;</td><td>Trypsin spaltet Peptide auf der C-terminalen Seite von Lysin- und Arginin-Aminosäureresten. Trypsin wird verwendet, um adhärente Zellen von einer Kulturoberfläche zu entfernen</td></tr><tr><td>Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,502</td><td>Röhrchen 15 mL, 120 mm x17 mm, PP</td></tr><tr><td>VBH 36 C2 Compact</td><td></td><td>Steril ST-003009000</td><td>Bietet umfassenden Schutz für die Umwelt und den Arbeiter</td></tr><tr><td>ZEISS Axio Vert.A1 &ndash; Invertiert&nbsp; Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>3849000962</td><td>ZEISS Axio Vert.A1 bietet einen einzigartigen Einstiegspreis und kann alle Kontrasttechniken bieten, einschließlich Hellfeld, Phasenkontrast, PlasDIC, VAREL, verbesserter Hoffman-Modulationskontrast (iHMC), DIC und Fluoreszenz. Integrierte LED-Beleuchtung für eine schonende Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Zellen. Der Axio Vert.A1 ist ergonomisch für Routinearbeiten konzipiert und kompakt genug, um in Gewebekulturhauben zu sitzen.</td></tr></tbody></table>

isolation, vermehrung und prion-protein-expression während neuronaler differenzierung von stammzellen menschlichen zahnpulpa

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

Bioethische Fragen im Zusammenhang mit der Manipulation von embryonalen Stammzellen haben Fortschritte auf dem Gebiet der medizinischen Forschung behindert. Aus diesem Grund ist es sehr wichtig, adulten Stammzellen aus verschiedenen Geweben wie Fettgewebe, Nabelschnurblut, Knochenmark und Blut zu erhalten. Zu den möglichen Quellen ist Zahnpulpa besonders interessant, weil es einfach ist, in Bezug auf bioethische Aspekte zu erhalten. In der Tat Dental Pulp Stammzellen (hDPSCs) sind eine Art von adulten Stammzellen in neuronalen-ähnliche Zellen zu unterscheiden und kann der dritte Molar von gesunden Patienten (im Alter von 13-19) entnommen werden. Insbesondere wurde die Pulpa entfernt mit einem Bagger, in kleine Scheiben schneiden, mit Kollagenase IV behandelt und kultiviert in einem Kolben. Um die neuronale Differenzierung zu induzieren, wurden hDPSCs für 2 Wochen mit EGF/bFGF stimuliert. Bisher haben wir gezeigt, dass bei der Differenzierung der Gehalt an zellulären Prion Protein (PrPC) in hDPSCs erhöht. Die Cytofluorimetric Analyse zeigte frühen Ausdruck der PrPC , die nach neuronalen Differenzierungsprozess erhöht. Ablation von PrPC von SiRNA verhindert PrP neuronaler Differenzierung induziert durch EGF/bFGF. In diesem Beitrag zeigen wir, dass wir verstärkte Isolation, Trennung und in-vitro- Kultivierung Methoden der hDPSCs mit einige einfache Verfahren, effizientere Zellklonen erhaltenen und groß angelegte Erweiterung der mesenchymalen Stammzellen (MSCs) waren wurde beobachtet. Wir zeigen auch, wie die hDPSCs, mit Methoden, die gemäß des Protokolls erhalten sind ein ausgezeichnetes experimentelles Modell neuronaler Differenzierung der MSCs und anschließende zelluläre und molekulare Prozesse zu studieren.

Die Isolierung und Trennung Verfahren des hDPSCs von Zahnpulpa, gewonnen aus der dritte Molar sind komplexe Prozesse, in denen kleine Veränderungen ein ruinöse Ergebnis führen kann. In diesem Papier verwenden wir das Protokoll des Arthur Et Al. 12 mit einigen Verbesserungen. Eine repräsentative Regelung der Verfahren ist in Abbildung 1dargestellt.
hDPSCs stellt eine ...

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die menschlichen Dental Pulp Stammzellen isoliert und Vermehrung um das Prion-Protein-Expression bei neuronalen Differenzierungsprozess zu bewerten.

Isolation, Vermehrung und Prion-Protein-Expression während neuronaler Differenzierung von Stammzellen menschlichen Zahnpulpa

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...

Der Standardweg, eine Stammzelle aus Zellstoff zu erhalten, ist schlecht effizient, und dies hängt von mehreren Variablen ab. Unser Protokoll ermöglichte es, eine erfolgreiche Isolierung von Stammzellen von behandelten Zähnen in 90% der Fälle zu erhalten. Eine hohe Anzahl von Zellen in wenigen Wochen zu erhalten, ist der Hauptvorteil.Das ermöglicht es uns, die Zelle in der regenerativen Medizin zu nutzen und eine Biobank zu schaffen, die anderen Wissenschaftlern dieses nützliche Werkzeug zur Verfügung stellt. Das Verfahren zum Öffnen des Zahnes wird von Dr.Constantino Santacroce durchgeführt. Anschließend wird das Protokoll von Stefano Martellucci, dem Doktoranden aus meinem Labor, der der erste Autor des Artikels ist, gezeigt.Zu Beginn den dritten Molaren vom Patienten extrahieren, schnell mit PBS abspülen, mit dem Medium in ein 15-Milliliter-Reagenzglas geben und in weniger als zwei Stunden ins Labor überführen. Unter einer Biohazard-Haube, verwenden Sie einen Fräser, um den Zahn durch einen koronaren Schneidpass zu öffnen, parallel und tangent, durch das Dach der Zellstoffkammer. Mit einem kleinen Bagger das Fruchtfleisch vorsichtig entfernen und in ein Reagenzglas legen.Dann mit PBS dreimal waschen, und Zentrifuge bei 2, 500 mal g bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand. Setzen Sie das Pellet in Hanks Lösung wieder auf und übertragen Sie die Probe in eine Petrischale.Entfernen Sie die Hank-Lösung durch Zentrifugation bei 2, 500 mal g bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Dann, mit einem Einweg-Skalpell, teilen Sie das Fruchtfleisch in etwa ein Millimeter Scheiben, und fügen Sie einen Milliliter Typ IV Kollagenase. Als nächstes zentrifugieren Sie die Probe bei 2, 500 mal g bei Raumtemperatur für 10 Minuten.Entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie das Pellet im Medium wieder auf. Kultur es in einem T25-Kolben spezifisch für Stammzellen bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid. Während der Inkubationszeit, ändern Sie das Kulturmedium alle drei Tage.Sobald die anhaftenden Zellen den Zusammenfluss erreichen, fügen Sie den Zellen einen Milliliter Trypsin-EDTA-Lösung hinzu, um sie zu lösen, und brüten die Zellen drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Als nächstes fügen Sie vier Milliliter des Kulturmediums im Verhältnis eins zu fünf hinzu, um die Trypsin-Aktion zu stoppen, und zentrifugieren Sie die Zellsuspension sechs Minuten lang bei 259 mal g. Entfernen Sie den Überstand.Legen Sie dann die Zellen in einen T25-Kolben, um sich zu vermehren. Lösen Sie dann die Zellen drei Minuten lang mit einem Milliliter Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 259 mal g für sechs Minuten.Entfernen Sie den Überstand, und führen Sie fort, die Zellen auf zytofluorimetrische Analysen zu testen. Um den transienten Prionprotein-Silencing-Schritt durchzuführen, kultiumieren Sie zunächst die menschlichen Zellstoffstammzellen in Sechs-Well-Platten mit zwei Millilitern des Kulturmediums für 24 Stunden. Dann fügen Sie 400 Mikroliter des kleinen störenden RNA PrP Mediums zu jeder Probe hinzu und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für sechs Stunden.Ohne siRNA PrP medium zu entsorgen, 1,6 Milliliter des Kulturmediums im Verhältnis von eins zu fünf hinzufügen und die Zellen 72 Stunden bei 37 Grad Celsius belassen. Nach der Inkubationszeit den Überstand entfernen und die Zellen bei Raumtemperatur dreimal mit zwei Millilitern PBS waschen. Dann fügen Sie zwei Milliliter des neuronalen Kulturmediums hinzu und halten Sie die Zellen sieben bis 14 Tage in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius.Nach der Inkubationszeit, waschen Sie die Zellen mit zwei Milliliter PBS dreimal bei Raumtemperatur, und gehen Sie zur Western Blot Analyse, um auf neuronale Oberflächenantigene zu testen. Um den neuronalen Induktionsprozess durchzuführen, Kultur 2 Millionen menschliche Zahnstoff Stammzellen in sechs-Well-Platten, bis zu 28 Tage von der Zellstoff-Trennung. Alle drei Tage, entsorgen Sie den Überstand.Waschen Sie dreimal mit zwei Milliliter PBS bei Raumtemperatur, und ersetzen Sie zwei Milliliter des neuronalen Kulturmediums. Nach sieben bis 14 Tagen die Zellen drei Minuten lang mit einem Milliliter Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius ablösen. Fügen Sie dann vier Milliliter des Kulturmediums im Verhältnis eins zu fünf hinzu, um die Trypsin-Aktion zu stoppen.Um die menschlichen Zellstoffstammzellen durch Durchflusszytometrie zu charakterisieren, Kultur 2 Millionen pro Milliliter der Zellen in Sechs-Well-Platten mit zwei Milliliter des Kulturmediums. Nach 28 Tagen nach der zellärztlichen Trennung oder nach weiteren 14 Tagen mit neuronatorischem Kulturmedium einen Milliliter Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius für drei Minuten hinzufügen, um die Zellen zu lösen. Als nächstes fügen Sie vier Milliliter des Kulturmediums im Verhältnis eins zu fünf hinzu, um die Trypsin-Aktion zu stoppen, und zentrilegieren Sie bei 259 mal g bei Raumtemperatur sechs Minuten.Fixieren Sie die unbehandelten oder behandelten Zellen mit 300 Mikrolitern 4%Paraformaldehyd in PBS bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Als nächstes Zentrifugen, entsorgen Sie den Überstand und permeabilisieren Sie die Zellen mit 1% nicht-ionischem Tensid in PBS bei Raumtemperatur für weitere 10 Minuten. Dann zentrifugieren Sie wieder, entsorgen Sie den Überstand und führen Sie die Blockierung mit 5% fettfreier trockener Milch in einem Milliliter PBS bei Raumtemperatur für eine Stunde durch.Waschen Sie dreimal mit einem Milliliter PBS, und inkubieren Sie die Zellen mit Anti-CD105, Anti-CD44, Anti-STRO-1, Anti-CD90, Anti-CD73, Anti-Beta-Drei-Tubulin, Anti-NFH und Anti-GAP43 monoklonale Antikörper bei Raumtemperatur für eine Stunde. Anschließend zentrieren Sie die Zellen wieder dreimal hintereinander mit einem Milliliter PBS im Sechs-Minuten-Takt und inkubieren Sie dann mit Anti-Maus-PE oder Anti-Kaninchen-CY5-Monoklon-Antikörpern bei Raumtemperatur für eine weitere Stunde. Verwenden Sie die sekundären Antikörper, um die immunpositiven Zellen zu veranieren, und analysieren Sie alle Proben mit einem Durchflusszytometer.Kultur 2 Millionen Zellen pro Milliliter der menschlichen Zellstoffstammzellen in Sechs-Brunnen-Platten mit zwei Millilitern des Kulturmediums. Nach 21 und 28 Tagen nach der Zellstofftrennung oder nach weiteren sieben bis 14 Tagen mit dem neuronalen Kulturmedium einen Milliliter trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius für drei Minuten hinzufügen, um die Zellen zu lösen. Dann Zentrifuge, entsorgen Sie den Überstand, und fixieren Sie dann die Proben mit 4%Paraformaldehyd in PBS bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.Als nächstes Zentrifugen, entsorgen Sie den Überstand, und dann permeabilisieren mit 1%nicht-ionischen Tensid in PBS bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Entfernen Sie den Überstand, und färben Sie die Zellen mit Kaninchen Anti-PrP monoklonalen Antikörper bei Raumtemperatur für eine Stunde. Schließlich Zentrifugen, entsorgen Sie den Überstand, und dann mit Anti-Kaninchen CY5 monoklonalen Antikörper bei Raumtemperatur für eine weitere Stunde inkubieren.Analysieren Sie alle Proben mit einem Durchflusszytometer. Nach der Zellstofftrennung wurden Cluster menschlicher Zellstoffstammzellen an der Peripherie erweitert. Ein Vergleich zwischen dem Wachstum dieser Zellen vor und nach der durch EGF/bFGF induzierten neuronalen Differenzierung zeigte signifikante Veränderungen in der Zellmorphologie und dem Auswuchs von Neuriten.Unbehandelte menschliche Zellstoffstammzellen exprimiert multipotente mesenchymale stromale spezifische Oberflächenantigene wie CD44, CD90, CD105, CD73 und STRO-1. Nach geeigneten neuronalen Induktionsreizen exprimierten diese Zellen spezifische neuronale Marker, wie Beta-Drei-Tubulin, NFH und GAP43. Unbehandelte oder behandelte Zellen drückten keine hämatopoetischen Marker wie CD14 und CD19 aus.Nach 28 Tagen wurde Prionprotein im Vergleich zur entsprechenden Negativkontrolle in menschlichen Zellstoffstammzellen präkoziert und seine Expression nach dem durch EGF/bFGF induzierten neuronalen Differenzierungsprozess erhöht. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass das Silencing des Prionproteins durch sRNA vor EGF/bFGF-Stimuli den neuronalen Differenzierungsprozess menschlicher Zellstoffstammzellen beeinflussen könnte, indem die Expression neuronaler Marker Beta-Drei-Tubulin und NHF verhindert wird. Das Wichtigste ist die Wahl des Enzyms, um die Zellen vom Zellstoff zu trennen.In der Tat, wenn das Enzym zu aggressiv ist, könnten die Zellen beschädigt werden und ihr Wachstum und differenzierungsfähig sein. Die Zellstoffstammzellen sind ein hervorragendes Experimentelles Modell, das in vivo- und in-vitro-Studien im Bereich der regenerativen Medizin eingesetzt werden kann. Da PrP eine Schlüsselrolle im neuronalen Differenzierungsprozess von Zellstoffstammzellen spielt, kann dieser Marker ein ausgezeichneter Kandidat als wirksames Ziel bei neurodegenerativen Erkrankungen sein.Der wichtigste Aspekt zu beraten ist der Gesundheitszustand der Patienten, wie das Fehlen von Infektionskrankheiten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Das beschriebene Verfahren Isolierung und Charakterisierung von menschlichen Zahnpulpa Stammzellen (hDPSCs) unter Verwendung...

Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Dieses Video zeigt eine Technik zur Etablierung einer Co-Kultur von Trigeminusneuronen und primären Zahnpulpazellen unter Verwendung eines Transwell-Filters. In diesem physikalisch getrennten Zustand sezernieren mesenchymale Zellen, die aus Zahnpulpagewebe gewonnen werden, parakrine Signalmoleküle, die die Poren durchqueren und die Differenzierung und Migration von Neuronen zu den mesenchymalen Zellen fördern, wodurch ein Co-Kultursystem entsteht.

Etablierung einer Co-Kultur von Zahnpulpazellen und Trigeminusneuronen für die Querkommunikation

Dieses Video zeigt den Prozess der Induktion menschlicher pluripotenter Stammzellen zur Differenzierung in Neuronen durch Transfektion mit gentechnisch veränderten Lentiviren, die ein neurogenes Transkriptionsfaktor-Gen tragen, unter der Kontrolle eines Tetracyclin-responsiven Elements, gefolgt von einer Behandlung mit einem Tetracyclin-Derivat und einem Reifungsmedium.

Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen in Neuronen mit gentechnisch veränderten Lentiviren

Dieses Verfahren ergibt telencephalen Neuronen durch Durchlaufen Kontrollpunkten, die ähnlich wie beim menschlichen Entwicklung beobachtet werden, sind. Die Zellen werden dürfen spontan zu differenzieren, sind Faktoren, die beide gegenüber der neuronalen Abstammungslinie schieben ausgesetzt, werden isoliert, und werden auf Deckgläschen ausplattiert, um die terminale Differenzierung und Reifung zu ermöglichen.

Die Spezifikation der telencephalen glutamatergen Neuronen von menschlichen pluripotenten Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt der Transienten Gentechnik zahnmedizinische Stammzellen aus der menschlichen zahnmedizinische Follikel extrahiert. Die angewandte nicht-viralen Modifikation Strategie kann eine Grundlage für die Verbesserung der therapeutischen Stammzellen Produkte geworden.

Isolierung, Charakterisierung und RNA-basierte gentechnische Veränderung von menschlichen Dental follikelstimulierendes Stammzellen

Wir beschreiben die Isolierung, Dispersion und Beschichtung von Zellstoff (DP) Primärzellen mit trigeminalen (TG) Neuronen, die auf darüber liegenden Transwellfiltern kultiviert sind. Zelluläre Reaktionen von DP-Zellen können mit Immunfluoreszenz oder RNA/Protein-Analyse analysiert werden. Die Immunfluoreszenz neuronaler Marker mit konfokaler Mikroskopie ermöglicht die Analyse von Neuriten-Auswuchsreaktionen.

Eine Co-Kultur-Methode zur Untersuchung des Neuriten-Auswuchss als Reaktion auf Dental Pulp Paracrine Signale

Dieser Artikel enthält eine schrittweise Anleitung zur Etablierung einer Primärkultur von Zahnpulpa-Stammzellen unter Verwendung der Explantatkulturmethode und zur Charakterisierung dieser Zellen auf der Grundlage der ICSCRT-Richtlinien. Die durch dieses Protokoll isolierten Zellen können als mesenchymale Stammzellen für weitere Anwendungen betrachtet werden.

Primärkultur von Stammzellen der Zahnpulpa

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Extraktion, Kultivierung und Konservierung von multipotenten Stammzellen aus Zahnpulpa durch enzymatischen Verdau. Darüber hinaus demonstriert es ihr Potenzial, sich in Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten zu differenzieren, was die Bedeutung von Präzision und Konsistenz in diesem Prozess unterstreicht.

Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung von Stammzellen der Zahnpulpa aus menschlichen Milchzähnen und bleibenden Zähnen

Die wichtigsten adhärenten Zelltypen, die aus dem menschlichen Muskel stammen, sind myogene Zellen und Fibroblasten. Hierbei werden Zellpopulationen mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung auf Basis des CD56-Antigens angereichert. Die anschließende Immunmarkierung mit spezifischen Antikörpern und der Einsatz von Bildanalysetechniken ermöglicht die Quantifizierung der zytoplasmatischen und nukleären Eigenschaften in einzelnen Zellen.

Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von aus Schweinefettgewebe gewonnenen Stammzellen (pADSC) aus subkutanem Fettgewebe mit Untersuchung der Multipotenz. Die multipotenten pADSC werden verwendet, um Prozesse der Adipozytendifferenzierung abzugrenzen und die Transdifferenzierung in mehrere Zelllinien des mesodermalen Mesenchyms oder weitere Linien des Ektoderms und des Endoderms für regenerative Studien zu untersuchen.

Isolierung und Differenzierung von Fettgewebe gewonnenen Stammzellen aus Porcine Subkutan Fettgewebes

Erfahren Sie die effiziente Isolation und Vermehrung menschlicher Dentalpulpa-Stammzellen mit 90% Erfolgsrate. Diese Methode untersucht die Prion-Protein-Expression während der neuronalen Differenzierung für Anwendungen in der regenerativen Medizin.

Isolation, Vermehrung und Prion-Protein-Expression während neuronaler Differenzierung von Stammzellen menschlichen Zahnpulpa

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