Name: Kolorimetrischen Analyse der alkalischen Phosphatase Aktivität in S. Aureus Biofilm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 59 s
Description: Lernen Sie eine hochdurchsatzfähige Methode zur quantitativen Analyse der alkalischen Phosphatase-Aktivität in Staphylococcus aureus Biofilmen. Dieses empfindliche Verfahren erleichtert die Erforschung der Rolle von ALP bei der Biofilmbildung.

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Wir danken William Rainey Harper College und der University of Illinois in Chicago für die Möglichkeit, diese Experimente durchzuführen. Wir danken auch McGraw-Hill-Stiftung für ihre großzügige Unterstützung.

1. mittlere Vorbereitung
<ol><li>1 L des Tryptic Soy Bouillon (TSB) vorbereiten: in 1 L destilliertes Wasser, 15 g des Pankreas verdauen von Kasein, 5 g papaic Digest von Sojaschrot, 3 g Natrium-Chlorid, 2,5 g Dextrose und 2,5 g Dipotassium Phosphat hinzugeben. Vor Gebrauch sterilisieren.</li>
	<li>Für Tryptic Soy Agar (TSA), 15 g Agar-Agar hinzufügen 1 L des TSB, Autoklaven. Dann lassen Sie auf Zimmertemperatur abkühlen. Gießen Sie anschließend bei einem Verhältnis von 20 mL pro Petrischale (100 x 15 mm).</li>
	<li>Biofilm-Nährmedium: 1 L autoklaviert TSB 10 g Glukose hinzufügen. Sterilisieren Sie durch Filtration mit einem 0,2 µm-Filter.</li>
</ol>2. S. Aureus Biofilmbildung in 96 well Gewebekultur-Platte
Hinweis: Der S. Aureus -Biofilm ist wie zuvor beschrieben6,21kultiviert.
<ol><li>Eine einzelne Kolonie von S. Aureus von TSA in 10 mL TSB zu impfen und wachsen über Nacht bei 37 ° C.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Übernachtung Kultur in 10 mL TSB/Glucose (10 g/L) im Verhältnis 1: 100 (V/V). Wirbel sanft, für eine konsequente Konzentration zu mischen.</li>
	<li>Übertragen Sie 200 mL der verdünnten Kultur in insgesamt 18 Brunnen (mehr für experimentelle Gruppen, solche nicht-Biofilm-Kontrolle darauf eine Beziehung zur ALP Aktivität6) von einer 96-well-Platte. Verwenden Sie Drillinge für jeden Zeitpunkt: 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min und 75 min.. Siehe Punkt 3.2.</li>
	<li>Inkubieren Sie die 96-well-Platte bei 37 ° C für 24 h für Biofilm Bildung6,21.</li>
	<li>Dekantieren des Überstands durch Absaugen.</li>
	<li>Waschen Sie jeweils gut mit 1 x Phosphat gepufferte Lösung (PBS, pH 7,4), für 5 min bei 15.000 X g Zentrifugieren und dekantieren des Überstandes durch Absaugen.</li>
</ol>3. Messung der ALP Aktivität in S. Aureus Biofilm
Hinweis: ALP-Aktivität war wie beschrieben6,18gemessen.
<ol><li>75 mL gepufferten ALP Substrat bestehend aus handelsüblichen pNPP in jede Vertiefung aus Schritt 2,6 und beginnen Sie die Aufnahmezeit. Notieren Sie jeden Zeitpunkt in dreifacher Ausfertigung.</li>
	<li>Nach der Inkubation für eine abwechslungsreiche Zeit: 0 min (Kontrolle), 15 min, 30 min, 45 min, 60 min und 75 min. hinzufügen bzw. 75 µL 5 M NaOH, die Reaktion zu stoppen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Platte für 5 min bei 15.000 X g.</li>
	<li>100 µL des Überstandes in eine neue 96-well-Platte für farbmetrische Messung zu übertragen.</li>
	<li>Messen Sie die Absorption der einzelnen gut bei 405 nm mit Platte 96 auch Leser. Nutzen Sie die 0 min Zeit zeigen Brunnen zu steuern für 405 nm Hintergrundgeräusche.</li>
	<li>Wiederhole das ganze Experiment in drei einzelnen 96-well-Platten.</li>
</ol>

<ol><li>Coleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+alkaline+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of alkaline phosphatase.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).</li>
<li>Sharma, U., Pal, D., Prasad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+Phosphatase%3A+An+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Alkaline Phosphatase: An Overview.</a> Indian Journal of Clinical Biochemistry. 29 (3), July-Sept 269-278 (2014).</li>
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<li>Danikowski, K. M., Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+Phosphatase+Activity+of+Staphylococcus+aureus+grown+in+Biofilm+and+Suspension+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alkaline Phosphatase Activity of Staphylococcus aureus grown in Biofilm and Suspension Cultures.</a> Current Microbiology. 75, 1226-1230 (2018).</li>
<li>Okabayashi, K., Futai, M., Mizuno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+Acid+and+Alkaline+Phosphatases+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Localization of Acid and Alkaline Phosphatases in Staphylococcus aureus.</a> Japanese Journal of Microbiology. 18 (4), 287-294 (1974).</li>
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<li>Wolf, P. L., Von der Muehll, E., Ludwick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+test+to+differentiate+Serratia+from+Enterobacter%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">A new test to differentiate Serratia from Enterobacter.</a> American Journal of Clinical Pathology. 56, 241-243 (1972).</li>
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<li>Flemming, H. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+an+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).</li>
<li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Antimicrobial+Agents%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 35, 322-332 (2010).</li>
<li>Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+antibiotic+resistance+of+Escherichia+coli+in+mature+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).</li>
<li>Witherow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ten-Week+Biochemistry+Lab+Project+Studying+Wild-Type+and+Mutant+Bacterial+Alkaline+Phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), Nov/Dec (2016).</li>
<li>Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+human+placental+alkaline+phosphatase+gene+in+transfected+cells%3A+Use+as+a+reporter+for+studies+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).</li>
<li>Horney, B. S., Farmer, A. J., Honor, D. J., MacKenzie, A., Burton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+of+alkaline+phosphatase+isoenzymes+in+the+serum+of+hyperthyroid+cats%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis of alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of hyperthyroid cats.</a> Veterinary Clinical Pathology. 23 (3), 98-102 (1994).</li>
<li>Farley, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Skeletal+Alkaline+Phosphatase+in+Osteoporotic+Serum+by+Wheat+Germ+Agglutinin+Precipitation%2C+Heat+Inactivation%2C+and+a+Two-Site+Immunoradiometric+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay.</a> Clinical Chemistry. 40 (9), 1749-1756 (1994).</li>
<li>O’Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experience%22%5BJournal%5D)">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> Journal of Visualized Experience. , (2011).</li>
<li>Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Characterization+of+Extracellular+Alkaline+Phosphatase+from+an+Alkalophilic+Bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+and+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In unseren Test haben wir als ALP Substrat pNPP verwendet. Dies ist eine funktionierende Lösung für ELISA und keine Verdünnung erforderlich. Nach Hydrolyse von ALP, ein gelbes Produkt entwickelt und kann gemessen werden, bei 405 nm. Am Ende der enzymatischen Reaktion wir kurz zentrifugiert, die 96-well-Platte und den Überstand auf eine frische 96-well-Platte zur Messung der Extinktion mit dem Platte Reader übertragen. Wir fanden, dass dieses zusätzliche Zentrifugationsschritt kritisch, da es die Konsistenz der Extinktion...

Alkalischer Phosphatase (ALP) drückt sich ubiquitär in beide prokaryotischen und eukaryotischen Zellen1. Es kann katalysieren die Hydrolyse von Monophosphate aus unterschiedlichen Molekülen wie Nukleotide, Proteine, Alkaloide, Phosphat Ester und Anhydride der Phosphorsäure. Beim Menschen ist die eukaryotische ALP in vielen Geweben einschließlich Leber, Knochen, Darm und Plazenta2. Es spielt eine wichtige Rolle in Protein-Phosphorylierung, Zellwachstum, Apoptose, Stammzell-Prozesse sowie normale skelettartigen Mineralisierung. Eukaryotische ALP ist auch eine wichtige Serum-Indikator für das Vorliegen von Krankheiten in Knochen, Leber und andere Gewebe/Organe, wenn erhöht3,4.
Prokaryotische ALP wurde in einer Vielzahl von bakteriellen Zellen, einschließlich der E. Coli-5, S. Aureus6,7 und einige gemeinsame Pansen-Bakterien in die Böden8erkannt. Bakterienaktivität ALP wurde als Biosensor zur Erkennung von Pestiziden, Schwermetallen9 und bakterielle Kontamination10verwendet. Die konstitutive Expression von ALP wurde Staphylokokken11 identifizieren und Enterobacter12 Serratia unterscheiden verwendet. Es wird weiter vorgeschlagen, dass konstitutive ALP-Produktion mit Pathogenität Staphylokokken13korreliert ist. Obwohl in verschiedenen Einstellungen3,4, ALP untersucht worden ist noch wenig für seine Tätigkeit und Funktion in Biofilmen Kulturen berichtet.
Ein Biofilm ist dokumentiert worden, um ein anders funktionierenden bakterielle Leben im Vergleich zu seinen frei lebende Bakterienzelle Gegenstück14haben. In S. Aureuswurde die Bildung von Biofilm in einer Vielzahl von Krankheitsbildern und Konten für die Antibiotika-Resistenz und chronische Entzündungen15,16identifiziert. Viele Moleküle war berichtet worden, um in einem Biofilm-Matrix wie Polysaccharide, Proteine, Nukleinsäuren und Lipiden gefunden werden, aber der Mechanismus der Biofilmbildung ist nicht vollständig verstandenen14. Um zu verstehen, die Rolle der ALP in Biofilmbildung, wir S. Aureus Biofilme in 96 gut Gewebekultur Platten kultiviert und die ALP-Aktivität mit Para-Nitrophenylphosphate (pNPP) gemessen.
Das Molekül pNPP ist ein Ready-to-Use-Substrat für die ALP und verbreitet, ALP Aktivität6,17,18zu messen. Dieser farbmetrischen Assay basiert auf der Umwandlung von Para-Nitrophenyl Phosphat (pNPP), Para-Nitrophenol führt ein farbiges Produkt bei 405 nm. Im Vergleich zu anderen herkömmlichen ALP-Assay, wie Agarose gel Elektrophorese19, Weizenkeime Agglutinin (WGA) Niederschlag und WGA-HPLC20, dieser Test hochspezifisch ist, ermöglicht empfindlich, leicht zu reproduzieren, und die meisten vor allem für hohe Durchsatz.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>VWR</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Zentrifuge</td><td>Thomas Scientific</td><td>5810</td><td></td></tr><tr><td>Gluose</td><td>VWR</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>NaOH Pellets</td><td>VWR</td><td>SS0550-500GR</td><td></td></tr><tr><td>Para-Nitrophenylphosphat (pNPP) &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7998-100ML</td><td>Typische Konzentrationen von flüssigen pNPP-Substraten, die häufig in Enzyme-Linked Immunesorbent Assays (ELISA) verwendet werden, liegen zwischen 10 und 50 mM. Ähnlich wie bei den meisten gebrauchsfertigen pNPP-Flüssigsubstraten, wie dem hier verwendeten, wird die genaue pNPP-Konzentration aufgrund des proprietären Charakters nicht bekannt gegeben.</td></tr><tr><td>10x PBS, pH7,4. 173 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P3288-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Plate Reader</td><td>Biotek</td><td>ELx808</td><td></td></tr><tr><td>S. aureus</td><td>ATCC</td><td>ATCC25923</td><td></td></tr><tr><td>Tryptischer Soja-Agar &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 15 g/l TSB</td><td>VWR</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Tryptische Sojabrühe:&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; g/L Pankreasverdauung von Kasein............ 15.0 Päpstlicher Aufschluss über Sojamehl......... 5,00 Natriumchlorid.............................. 3.00 Traubenzucker........................................ &nbsp; 2,50 Dikaliumphosphat.................. 2.50</td><td>VWR</td><td>90006-098</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Gewebekulturplatten</td><td>BD</td><td>6902D09</td><td>U-förmiger Boden</td></tr></tbody></table>

kolorimetrischen analyse der alkalischen phosphatase aktivität in s. aureus biofilm

Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm

Alkalischer Phosphatase (ALP) ist eine gemeinsame Enzym in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen exprimiert. Es katalysiert die Hydrolyse von Phosphat Monoesters aus vielen Molekülen bei grundlegenden pH und Phosphat-Stoffwechsel spielt eine unverzichtbare Rolle. Beim Menschen ist eukaryotische ALP eines der am häufigsten verwendete enzymatische Signale bei der Diagnose verschiedener Krankheiten, wie z. B. Cholestase und Rachitis. In S. Aureus, ALP wird ausschließlich auf der Zellmembran erkannt; Es wird auch als sekretorischen Form sowie ausgedrückt. Allerdings ist wenig über seine Funktion im Biofilmbildung bekannt.
Dieses Manuskript soll einen schnellen und zuverlässigen Assay zur ALP Aktivität in S. Aureus Biofilm zu messen, die kein Protein Isolierung erfordert zu entwickeln. Mit p-Nitrophenyl-Phosphat (pNPP) als Substrat, messen wir ALP Aktivität in S. Aureus Biofilm in 96-Well-Zellkultur-Platten gebildet. Aktivität stützte sich auf die Bildung der lösliche Reaktionsprodukt von 405 nm Absorption gemessen. Die hohen Durchsatz Natur 96 gut Gewebekultur-Platte-Methode bietet eine sensible und reproduzierbare Methode zur ALP Aktivität Assays. Die gleichen experimentellen einrichten kann auch zur Messung der anderen extrazellulären molekulare Marker im Zusammenhang mit Biofilmbildung erweitert werden.

Abbildung 1 zeigt ein repräsentatives Ergebnis der ALP Aktivität von Biofilm Kulturen von S. Aureus in 96 gut Gewebekultur Platten. 75 μL der im Handel erhältlichen pNPP Lösung wurde jeweils gut und inkubierten bei Raumtemperatur hinzugefügt. Nach der Inkubation für unterschiedliche Tageszeiten (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min und 75 min, bzw.) 75 μl 5 M NaOH wurde hinzugefügt, um die Reaktion zu stoppen. Das Produkt wurde dann gemessen in eine...

In diesem Manuskript gründeten wir eine Hochdurchsatz Methode zur Quantifizierung der alkalischen Phosphatase-Aktivität in S. Aureus Biofilm Kultur aus Gewebekultur 96-Well-Platte

Kolorimetrischen Analyse der alkalischen Phosphatase Aktivität in S. Aureus Biofilm

Alkaline phosphatase (ALP) is a common enzyme expressed in both prokaryotic and eukaryotic cells. It catalyzes the hydrolysis of phosphate monoesters from ...

Dieses Protokoll präsentierte eine einfache und zuverlässige Methode zur Messung der alkalisierten Phosphatase-Aktivität in der S.aureus-Biofilmkultur. Es wird uns helfen, die Funktion von ALP in der Biofilmbildung zu verstehen. Der große Vorteil dieser Technik ist ein hoher Durchsatz.Es ist sehr empfindlich und einfach durchzuführen. Das Verfahren wird Kevin Danikowski demonstrieren, ein ehemaliger Student vom Harper College. Zur Zubereitung von TSB die Bauchspeicheldrüsenverdauung von Casein, die papaische Verdauung von Sojamehl, Natriumchlorid, Dextrose und Dikaliumphosphat in destilliertes Wasser geben.Bedecken Sie den Kolben mit Aluminiumfolie und legen Sie ihn in einen Autoklaven, um ihn vor Gebrauch zu sterilisieren. Um eine TSA vorzubereiten, fügen Sie Agar zu TSB hinzu und legen Sie ihn zur Sterilisation in den Autoklaven. Dann auf Raumtemperatur abkühlen lassen.Als nächstes gießen Sie es in die Petrischale im Verhältnis 20 Milliliter pro Schale. Um ein Biofilmkulturmedium vorzubereiten, fügen Sie Glukose zu autoklavierten TSB hinzu, um die Konzentration von 10 Gramm pro Liter zu erreichen. Filtrat der Lösung mit einem Vakuumfiltrationskit mit einem 0,2 Mikrometer porengroßen Filter.Um zu impfen, verwenden Sie eine sterilisierte Impfschleife, um eine einzelne Kolonie von Staph aureus aus der Petrischale zu pflücken und sie in die Kulturröhre mit 10 MilliliterT TSB gefüllt zu platzieren. Legen Sie die Röhre in den Inkubator, um über Nacht bei 37 Grad Celsius zu wachsen. Mit einer Mikropipette 100 Mikroliter Übernachtungskultur zeichnen und in ein Kulturrohr übertragen, das mit 10 Millilitern TSB mit Glukose gefüllt ist, um eine Verdünnung des Volumenverhältnisses von 1:100 zu erhalten.Wirbel sanft für eine konsistente Konzentration zu mischen. Verwenden Sie eine Mikropipette, um 200 Mikroliter verdünnter Kultur in insgesamt 18 Brunnen von einer 96-Well-Platte zu übertragen. Die 96-Wellplatte bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden für die Biofilmbildung inkubieren.Für die beste Biofilm-Formation von S.aureus ist es besser, eine flache oder runde untere 96-Wellplatte zu pflücken. Danach kippen Sie die Platte leicht, um den Überstand durch Aspiration von der Kante jedes Brunnens zu dekanten. Waschen Sie jeden Gut mit 1X PBS.Legen Sie die Platte in die Zentrifuge, um für fünf Minuten bei 8.000 Umdrehungen pro Minute zu drehen und dekantieren Sie den Überstand durch Aspiration. Fügen Sie 75 Mikroliter gepuffertes ALP-Substrat, bestehend aus handelsüblichem PNPP, zu jedem Bohrwert hinzu und verwenden Sie einen Timer, um jeden Zeitpunkt in Dreifacharbeit aufzuzeichnen. Nach jedem Inkubationszeitpunkt 75 Mikroliter von fünf Mol-Natriumhydroxid in jede der drei Brunnen geben, um die Reaktion zu stoppen.Zentrifugieren Sie die Platte für fünf Minuten bei 800 Umdrehungen pro Minute. Verwenden Sie eine Pipette, um 100 Mikroliter Überstand in eine neue 96-Well-Platte für die kalorimetrische Messung zu übertragen. Verwenden Sie einen 96-Well-Plattenleser, um die Absorption jedes Brunnens bei 405 Nanometern zu messen.Verwenden Sie die 30-Minuten-Zeitpunktbrunnen, um Hintergrundgeräusche zu steuern. Wiederholen Sie das gesamte Experiment in drei 96 Brunnenplatten. Dieses Protokoll entwickelt einen schnellen und zuverlässigen Test zur Messung der ALP-Aktivität im S.aureus-Biofilm, der keine Proteinisolation erfordert.Das repräsentative Ergebnis der ALP-Aktivität zeigt einen anstiegen Trend von bis zu 75 Minuten. Nach 75 Minuten wurde keine Zunahme der ALP-Aktivität beobachtet. Es ist sehr wichtig, eine gute Biofilmkultur zu etablieren, und es kann einige Versuche dauern, um zu meistern.Sie können die Biofilmbildung bestätigen, indem Sie kristallvioletten Assay durchführen, wie zuvor von uns und anderen berichtet, oder Sie können die Platte mit menschlichem Plasma vorbehandeln, um die Bildung von Biofilmen zu erleichtern. Nach seiner Entwicklung können Sie potenzielle ALP-Hemmer überprüfen, die die Biofilmbildung stören könnten. Das Ergebnis wird wichtige Informationen zum Biofilmmanagement im medizinischen Bereich liefern.Fünf molare Natriumhydroxid können bei Kontakt gefährlich sein. Achten Sie darauf, persönliche Schutzausrüstung bei der Handhabung zu tragen.

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Biofilme auf der Zahnoberfläche gebildet sind sehr komplex und in denen konstante angeborenen und exogene ökologischen Herausforderungen, die ihre Architektur modulieren, Physiologie und Transkriptom. Wir entwickelten eine Toolbox, um die Zusammensetzung, die strukturelle Organisation und Genexpression von oralen Biofilmen, die auf andere Bereiche der Biofilm-Forschung angepasst werden können zu prüfen.

Ein analytisches Werkzeug-Box für umfassende biochemische, strukturelle und Transkriptom Evaluation of Oral Biofilme von Mutans Streptokokken Mediated

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Quantifizierung enzyminduzierter Biofilmsuppression bei pathogenen Bakterien

Dieses Video zeigt einen in vitro Assay zur Untersuchung der Interaktion zwischen Neutrophilen und Biofilmen. Die im Biofilm eingebetteten pathogenen Bakterien und isolierten Neutrophilen wurden mit Fluoreszenzmarkierungen markiert und die Immunantwort der Neutrophilen und die Umgehung der Immunantwort durch die Bakterien mit einem Fluoreszenzmikroskop bewertet.

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Anders als bei Eukaryonten zu sehen, gibt es nur wenig Untersuchungen, die detailliert Membrandepolarisation und Ionenkonzentrationsänderungen in Bakterien, in erster Linie ihrer geringen Größe macht herkömmliche Messverfahren schwierig. Hier haben wir ausführlich Protokolle zur Überwachung solcher Veranstaltungen in der deutlichen Gram-positive Erreger Streptococcus pneumoniae Verwendung Fluoreszenztechniken.

Überwachen von Änderungen in Membran-Polarity, Membrane Integrity und intrazelluläre Ionenkonzentrationen in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Verwenden von Fluoreszenzfarbstoffen

Hier präsentieren wir Protokolle zum schnellen Screening und zur Charakterisierung von Enzymen auf antimikrobielle Aktivität. Der Mikroschiebe-Diffusionsassay und der Farbstofffreisetzungsassay verwenden bakterielle Zielsubstrate für die qualitative und quantitative Bewertung der enzymatischen Aktivität.

Qualitative und quantitative Assays zur Detektion und Charakterisierung von Protein Antimikrobielle

Die meisten bakteriellen Infektionen erzeugen einen Biofilm. Biofilm-assoziierte Bakterien sind aufgrund ihrer Umgebung oft phänotypisch resistent gegen Medikamente. Neuartige antibakterielle Moleküle, die Bakterien in Biofilmen abtöten, haben daher hohe Priorität. Wir etablieren einen Assay, um schnell nach antimikrobiellen Verbindungen zu suchen, die bei der Beseitigung von Biofilmen wirksam sind.

Targeting Biofilm Assoziierte<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Verwendung von Resazurin Based Drug-Anfälligkeit Assay

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll, um die antimikrobielle Wirkung von 5-Aminolevulinic Säure-vermittelten die photodynamische Therapie (ALA-PDT) auf Staphylococcus Aureus Biofilm untersuchen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um ein in-Vitro Modell zur Untersuchung der Behandlung von bakteriellen Biofilmen mit PDT in der Zukunft zu entwickeln.

Eine In vitro- Modell, die Wirkung von 5-Aminolävulinsäure-vermittelten photodynamische Therapie auf Staphylococcus Aureus Biofilm zu studieren

Das Protokoll beschreibt den Anbau von königreichübergreifenden Biofilmen, die aus Candida-Albicans und Streptococcus-Mutanen bestehen, und stellt eine konfokale Mikroskopie-basierte Methode zur Überwachung des extrazellulären pH-Werts in diesen Biofilmen dar.

Überwachung des extrazellulären pH-Werts in cross-kingdom Biofilmen mit Konfokalmikroskopie

Dieser Artikel stellt eine detaillierte Methodik zur Messung von Isolevuglandinen in Geweben durch Immunfluoreszenz unter Verwendung von alkalischen Phosphatase-konjugierten ScFv D11-Antikörpern vor. Bluthochdruckmodelle sowohl bei Mäusen als auch bei Menschen werden verwendet, um die Schritt-für-Schritt-Verfahren und grundlegenden Prinzipien der Isolevuglandin-Messung in Gewebeproben zu erklären.

Direkter Nachweis von Isolevuglandinen in Geweben mittels eines D11 scFv-alkalischen Phosphatase-Fusionsproteins und Immunfluoreszenz

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Untersuchung neutrophiler Biofilmwechselwirkungen. Staphylococcus aureus Biofilme werden in vitro etabliert und mit peripheren aus Blut gewonnenen menschlichen Neutrophilen inkubiert. Die oxidative Burst-Reaktion von Neutrophilen wird quantifiziert, und die Neutrophilenlokalisation innerhalb des Biofilms wird mikroskopisch bestimmt.

Standardisierte In-vitro-Assays zur Visualisierung und Quantifizierung von Interaktionen zwischen humanen Neutrophilen und Staphylococcus aureus-Biofilmen

Lernen Sie eine hochdurchsatzfähige Methode zur quantitativen Analyse der alkalischen Phosphatase-Aktivität in Staphylococcus aureus Biofilmen. Dieses empfindliche Verfahren erleichtert die Erforschung der Rolle von ALP bei der Biofilmbildung.

Kolorimetrischen Analyse der alkalischen Phosphatase Aktivität in S. Aureus Biofilm

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