Kolorimetrischen Analyse der alkalischen Phosphatase Aktivität in S. Aureus Biofilm
12. April 2019
In diesem Manuskript gründeten wir eine Hochdurchsatz Methode zur Quantifizierung der alkalischen Phosphatase-Aktivität in S. Aureus Biofilm Kultur aus Gewebekultur 96-Well-Platte
Dieses Protokoll präsentierte eine einfache und zuverlässige Methode zur Messung der alkalisierten Phosphatase-Aktivität in der S.aureus-Biofilmkultur. Es wird uns helfen, die Funktion von ALP in der Biofilmbildung zu verstehen. Der große Vorteil dieser Technik ist ein hoher Durchsatz.
Es ist sehr empfindlich und einfach durchzuführen. Das Verfahren wird Kevin Danikowski demonstrieren, ein ehemaliger Student vom Harper College. Zur Zubereitung von TSB die Bauchspeicheldrüsenverdauung von Casein, die papaische Verdauung von Sojamehl, Natriumchlorid, Dextrose und Dikaliumphosphat in destilliertes Wasser geben.
Bedecken Sie den Kolben mit Aluminiumfolie und legen Sie ihn in einen Autoklaven, um ihn vor Gebrauch zu sterilisieren. Um eine TSA vorzubereiten, fügen Sie Agar zu TSB hinzu und legen Sie ihn zur Sterilisation in den Autoklaven. Dann auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
Als nächstes gießen Sie es in die Petrischale im Verhältnis 20 Milliliter pro Schale. Um ein Biofilmkulturmedium vorzubereiten, fügen Sie Glukose zu autoklavierten TSB hinzu, um die Konzentration von 10 Gramm pro Liter zu erreichen. Filtrat der Lösung mit einem Vakuumfiltrationskit mit einem 0,2 Mikrometer porengroßen Filter.
Um zu impfen, verwenden Sie eine sterilisierte Impfschleife, um eine einzelne Kolonie von Staph aureus aus der Petrischale zu pflücken und sie in die Kulturröhre mit 10 MilliliterT TSB gefüllt zu platzieren. Legen Sie die Röhre in den Inkubator, um über Nacht bei 37 Grad Celsius zu wachsen. Mit einer Mikropipette 100 Mikroliter Übernachtungskultur zeichnen und in ein Kulturrohr übertragen, das mit 10 Millilitern TSB mit Glukose gefüllt ist, um eine Verdünnung des Volumenverhältnisses von 1:100 zu erhalten.
Wirbel sanft für eine konsistente Konzentration zu mischen. Verwenden Sie eine Mikropipette, um 200 Mikroliter verdünnter Kultur in insgesamt 18 Brunnen von einer 96-Well-Platte zu übertragen. Die 96-Wellplatte bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden für die Biofilmbildung inkubieren.
Für die beste Biofilm-Formation von S.aureus ist es besser, eine flache oder runde untere 96-Wellplatte zu pflücken. Danach kippen Sie die Platte leicht, um den Überstand durch Aspiration von der Kante jedes Brunnens zu dekanten. Waschen Sie jeden Gut mit 1X PBS.
Legen Sie die Platte in die Zentrifuge, um für fünf Minuten bei 8.000 Umdrehungen pro Minute zu drehen und dekantieren Sie den Überstand durch Aspiration. Fügen Sie 75 Mikroliter gepuffertes ALP-Substrat, bestehend aus handelsüblichem PNPP, zu jedem Bohrwert hinzu und verwenden Sie einen Timer, um jeden Zeitpunkt in Dreifacharbeit aufzuzeichnen. Nach jedem Inkubationszeitpunkt 75 Mikroliter von fünf Mol-Natriumhydroxid in jede der drei Brunnen geben, um die Reaktion zu stoppen.
Zentrifugieren Sie die Platte für fünf Minuten bei 800 Umdrehungen pro Minute. Verwenden Sie eine Pipette, um 100 Mikroliter Überstand in eine neue 96-Well-Platte für die kalorimetrische Messung zu übertragen. Verwenden Sie einen 96-Well-Plattenleser, um die Absorption jedes Brunnens bei 405 Nanometern zu messen.
Verwenden Sie die 30-Minuten-Zeitpunktbrunnen, um Hintergrundgeräusche zu steuern. Wiederholen Sie das gesamte Experiment in drei 96 Brunnenplatten. Dieses Protokoll entwickelt einen schnellen und zuverlässigen Test zur Messung der ALP-Aktivität im S.aureus-Biofilm, der keine Proteinisolation erfordert.
Das repräsentative Ergebnis der ALP-Aktivität zeigt einen anstiegen Trend von bis zu 75 Minuten. Nach 75 Minuten wurde keine Zunahme der ALP-Aktivität beobachtet. Es ist sehr wichtig, eine gute Biofilmkultur zu etablieren, und es kann einige Versuche dauern, um zu meistern.
Sie können die Biofilmbildung bestätigen, indem Sie kristallvioletten Assay durchführen, wie zuvor von uns und anderen berichtet, oder Sie können die Platte mit menschlichem Plasma vorbehandeln, um die Bildung von Biofilmen zu erleichtern. Nach seiner Entwicklung können Sie potenzielle ALP-Hemmer überprüfen, die die Biofilmbildung stören könnten. Das Ergebnis wird wichtige Informationen zum Biofilmmanagement im medizinischen Bereich liefern.
Fünf molare Natriumhydroxid können bei Kontakt gefährlich sein. Achten Sie darauf, persönliche Schutzausrüstung bei der Handhabung zu tragen.
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Übersicht
Dieses Manuskript stellt eine Hochdurchsatzmethode zur Quantifizierung der alkalischen Phosphatase-Aktivität in Biofilmen von S. aureus unter Verwendung einer 96-Loch-Gewebekulturplatte vor. Die Methode ist so konzipiert, dass sie empfindlich und einfach durchzuführen ist und somit die Erforschung der Rolle der alkalischen Phosphatase bei der Biofilmbildung erleichtert.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrobiologie
- Biofilmforschung
- Enzymologie
Hintergrund
- Die alkalische Phosphatase (ALP) ist ein Enzym, das an verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt ist.
- Das Verständnis der Rolle von ALP bei der Biofilmbildung ist entscheidend für mikrobiologische Untersuchungen.
- Hochdurchsatzmethoden sind für eine effiziente Datenerhebung in der Forschung unerlässlich.
- Biofilme sind komplexe Gemeinschaften von Mikroorganismen, die Gesundheit und Industrie beeinflussen können.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Messung der ALP-Aktivität in Biofilmen etablieren.
- Das Verständnis der Funktion von ALP bei der Biofilmbildung vertiefen.
- Einen Protokollablauf bereitstellen, der leicht von Forschenden übernommen werden kann.
Verwendete Methoden
- Zubereitung von TSB unter Verwendung von pankreatischem Caseinverdau, papaischem Sojamehlverdau, Natriumchlorid, Dextrose und Dipotassiumphosphat.
- Verwendung einer 96-Loch-Gewebekulturplatte für die Hochdurchsatzanalyse.
- Bestimmung der alkalischen Phosphataseaktivität in Biofilmen von S. aureus.
- Demonstration des Verfahrens durch Kevin Danikowski, einen ehemaligen Studenten des Harper College.
Hauptergebnisse
- Die Methode quantifiziert erfolgreich die ALP-Aktivität in Biofilmen.
- Die hohe Empfindlichkeit der Technik ermöglicht genaue Messungen.
- Das Protokoll ist unkompliziert und kann leicht in verschiedenen Laboren implementiert werden.
- Die aus dieser Studie gewonnenen Erkenntnisse können zukünftige Biofilmforschung leiten.
Schlussfolgerungen
- Die etablierte Methode eignet sich zur Untersuchung von ALP in Biofilmen.
- Diese Forschung trägt zum Verständnis der Biofilmdynamik bei.
- Zukünftige Studien können auf diesem Protokoll aufbauen, um weitere Aspekte der Biofilmbiologie zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht eine schnelle, hochdurchsatzfähige Quantifizierung der alkalischen Phosphatase-Aktivität im S. aureus-Biofilm ohne Proteinisolierung und unterstützt so die Validierung von Zielstrukturen in einem frühen Stadium der antimikrobiellen Wirkstoffentwicklung. Durch die Bereitstellung eines sensitiven und reproduzierbaren Nachweises der extrazellulären Enzymaktivität erleichtert sie die mechanistische Absicherung von therapeutischen Hypothesen im Zusammenhang mit Biofilmen. Die Kompatibilität des Assays mit 96-Loch-Plattenformaten erlaubt eine nahtlose Integration in Screening-Kaskaden zur Identifizierung von Leitverbindungen und zum Aufbau vorhersagekräftiger Sicherheit.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft die therapeutische Hypothese, dass alkalische Phosphatase zur Biofilmbildung und -persistenz beiträgt.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Zielvalidierung durch quantitative Messung der Enzymaktivität in intakten Biofilmsystemen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem sie die Modulation von ALP mit Biofilm-Inhibitionsphänotypen verknüpft.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet ein standardisiertes, hochdurchsatzfähiges Format zur Bewertung der Wirkung von Verbindungen auf extrazelluläre enzymatische Marker vor.
- Quantitative Ausgabe: Erzeugt absorbanzbasierte Messungen bei 405 nm, die Dosis-Wirkungs-Analysen und die Bestätigung von Treffern ermöglichen.
- Skalierbarkeit: Verwendet das 96-Loch-Plattenformat, um den mittleren Durchsatz bei der Bildschirmanalyse von Inhibitorbibliotheken zu unterstützen.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Verbindet die ALP-Aktivität mit dem S. aureus-Biofilm, einem entscheidenden Virulenzfaktor bei geräteassoziierten und chronischen Infektionen.
- Übersetzbarkeit: Liefert einen biomarkerbasierten Endpunkt, der Entdeckung und präklinische Wirksamkeitsprüfung miteinander verbindet.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen basierend auf Targetbindung und phänotypischem Effekt in Biofilmmodellen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein und ermöglicht die Zielvalidierung, um die Identifizierung von Leitstrukturen und die präklinische Bewertung von anti-biofilmbildenden Strategien zu unterstützen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem ALP als funktioneller Output des Biofilmmetabolismus gemessen wird.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Messwerte, die für das Screening von Substanzbibliotheken in Mikrotiterplatten geeignet sind.
- Analytik: Ermöglicht kinetische und Endpunkt-Messungen, die einen statistischen Vergleich zwischen behandelten und Kontrollbedingungen erlauben.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Entwicklung von Biomarkern, indem sie die Enzymaktivität mit der Biofilmbildung und potenziellen therapeutischen Eingriffen verknüpft.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Untersuchung extrazellulärer Enzyme in mikrobiellen Biofilmen über mehrere Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem die mechanistische Uneindeutigkeit hinsichtlich der Rolle von ALP im Biofilm verringert wird.
- Operativer Wert: Bietet Standardisierung, Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit durch einen einfachen kolorimetrischen Nachweis.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem eine schnelle Bildschirmung von ALP-Modulatoren mit klaren phänotypischen Bezügen zum Biofilm ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen zur Voranbringung, indem die Target-Modulation mit anti-biofilmaktiver Wirksamkeit verknüpft wird.
Durchführungsaspekte
- Erfordert grundlegende mikrobiologische Fachkenntnisse für die sterilen Biofilmkultur und den Umgang mit S. aureus.
- Hängt von dem Zugang zu einem 96-Well-Plattenreader ab, der in der Lage ist, die Absorption bei 405 nm zu messen.
- Erfordert die Standardisierung der Biofilmbildungsbedingungen über alle Vertiefungen und Platten hinweg, um zuverlässige Vergleiche zu ermöglichen.
- Schließt Optimierungsüberlegungen ein, wenn die Methode auf andere Bakterienspezies oder extrazelluläre Marker ausgeweitet wird.
- Beinhaltet praktische Einschränkungen, wie beispielsweise die Notwendigkeit, den Hintergrundabsorptionswert zu kontrollieren und eine ordnungsgemäße Reaktionsbeendigung mit NaOH sicherzustellen.
