Name: Materialbildung von Rekombinanten Spider-Seiden durch wässrige Lösung mit Wärme und Druck (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Erfahren Sie eine einfache Methode zur Solubilisierung rekombinanter Spinnenseiden in wässriger Lösung unter Wärme und Druck. Dieses Verfahren ermöglicht die Herstellung verschiedener Materialformen wie Hydrogelen, Fasern und Beschichtungen.

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Die Autoren möchten die Finanzierung der Utah Science and Technology Research (USTAR)-Initiative dankbar würdigen.

1. Rekombinante Seidenmischung aus lyophilisierten Proteinvorräten
<ol><li>Bestimmen Sie die für die beabsichtigten Materialformationen erforderlichen Formulierungen und Volumen. Typische Formulierungen reichen von 3% (w/v) bis zu 15% (w/v). Mit dieser Auswahl berechnen Sie die passende RSSp, Konzentrationen und Verhältnisse.<ol>
<li>Verwenden Sie die folgenden entsprechenden Formulierungen, um jedes Material vorzubereiten, das in diesem Protokoll beschrieben wird: Hydrogels/sponges/lyogels, 6% (w/v) 50:50 MaSp1:MaSp2; Films/Beschichtungen, 5% (w/v) 80:20 MaSp1:MaSp2; Klebstoffe, 12% (w/v) 50:50 MaSp1:MaSp2; Fasern, 12,5% (w/v) 80:MaSp1:MaSp2. Achtung: Auch wenn die meisten Rezepturen besser für bestimmte Formen und Materialien geeignet sind, gibt es eine Vielzahl von Formulierungen, die sich oft überschneiden können. Darüber hinaus können die endgültigen RSSp-Materialien auch bei der Bildung und Verarbeitung auf die gewünschten Eigenschaften zugeschnitten werden. In der Regel muss jedes Protein untersucht werden, welche Parameter angemessen oder nützlich sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wählen Sie eine saubere und neue 8 mL autoklavable Borosilikat-Glaskultur mit Gummi-Schraubkappe.</li>
	<li>Entfernen Sie die Kappe und legen Sie die leere Ampulle auf eine analytische Balance. Die Masse der leeren Ampullen so zu erkleiden, dass das Gleichgewicht null Masse liest.</li>
	<li>Fügen Sie für jedes einzelne Material das gewünschte lyophilisierte RSSp-Pulver in die leere Ampulliere.<ol>
<li>Verwenden Sie diese spezifischen Massen jeder Proteinsorte für jedes Material, wenn Sie eine 2 ml Lösung vorbereiten: Hydrogels/sponges/-Liogels, 60 mg MaSp1 und 60 mg MaSp2; Films/Lackierungen, 80 mg MaSp1 und 20 mg MaSp2; Klebstoffe, 120 mg MaSp1 und 120 mg MaSp2; Fasern, 200 mg MaSp1 und 50 mg MaSp2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie der Ampulere, die bereits die gewichteten RSSp-Pulver enthält, die gewünschte Menge ultrareines Wasser, mindestens 2 ml, hinzu. Hinweis: Für alle Lösungsvorgänge wird ein minimales Volumen von 2 mL empfohlen.</li>
	<li>Die Ampelkappe versiegelt und den Inhalt mit einem brisanten Wirbel überziehen, um eine zerstreute und homogene RSSp-Mischung zu erzeugen, die nun für den Lösungsvorgang bereit ist. Zusätzliche Homogenisierungsansätze wie Schalldeinigung oder Laufradmischung können mit oder zusätzlich mit der Wirbelmischung eingesetzt werden.</li>
</ol>2. Rekombinant Spinnenseide löst
CAUTION: Während des Lösungsvorgangs werden hohe Heizungen und Drücke erzeugt. Für diesen Prozess sind richtige persönliche Schutzausrüstung, insbesondere Brillen, lange Ärmel und hitzebeständige Handschuhe erforderlich.
<ol><li>Führen Sie eine abschließende Überprüfung der Ampullen oder Gefäße durch, um sicherzustellen, dass sie fest und sicher festgezogen wurde. Anschließend das aufgehängte RSSp-Gemisch auf einen herkömmlichen Mikrowellenherd übertragen. Hinweis: Mikrowelleneinheiten im Leistungsbereich von 700 bis 1.500 Watt, die über kleinere interne Kammerkapazitäten verfügen, und rotierende Plattformen werden empfohlen, um bessere Lösungsbedingungen zu bieten.</li>
	<li>Beginnen Sie den Betrieb der Mikrowelle mit 5 s platzt bei voller Leistung. Nach jedem Einbruch kurz die Tür öffnen und vorsichtig mischen Sie die Vial, um zu verhindern, dass sich die aufgehängte Mischung.</li>
	<li>Wiederholen Sie diesen Mikrowellen-Prozess, bis das Gemisch and/oder die Lösung eine Temperatur von mindestens 130 ° C erreicht hat, wenn sie mit einem Infrarot-Thermometer direkt mit der Lösung gemessen wird, die Teile der Ampullen enthält. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle festen Partikel vollständig aufgelöst sind und nicht mehr sichtbar sind. Hinweis: Es wird empfohlen, die Ampulle und die Lösung gelegentlich abkühlen zu lassen, besonders wenn die Formulierung eine hohe RSSp-Konzentration hat. Temperaturen von über 200 ° C erhöhen das Risiko eines Ampelversagens. Besonderes Augenmerk muss auch darauf gelegt werden, dass die überhitzte Mixture/Lösung die Dichtung berührt, was auch zu einem Ampeleindämmungsausfall führt.</li>
	<li>Nach erfolgreichem Ablösen des RSSp-Gemisches in eine Lösung lassen Sie die Temperatur der Lösung und die Ampelkappe unter 100 ° C (Siedepunkt) vor dem Öffnen abkühlen.</li>
</ol>3. Hydrogels
<ol><li>Bereiten Sie ein Hydrogel aus der Lösung, nachdem Sie es aus der Mikrowelle entfernt und es abkühlen und setzen lassen. Das Hydrogel in bestimmte Geometrien geben, bevor es vollständig abkühlen kann. Hinweis: Verschiedene rSSps benötigen eine Vielzahl von Zeiten, um zu einem Hydrogel überzugehen. So bilden beispielsweise MaSp2-ähnliche Sequenzen im Vergleich zu MaSp1-ähnlichen Sequenzen eher schneller Hydrogele. Proteinkonzentrationen, Salzgehalt und pH-Wert wirken sich auch direkt auf die Übergangsquote zu einem Hydrogel aus.</li>
</ol>4. Sponges
<ol><li>Bereiten Sie einen RSSp-Swamm vor, indem Sie zuerst die primäre lösbare Lösung zu einem Hydrogel bilden.</li>
	<li>Das Hydrogel in ein Wasserbad legen, dieses Bad in den Gefrierschrank-20 ° C legen und warten, bis das Bad vollständig eingefroren ist.</li>
	<li>Vervollständigen Sie den Schwammbildungsprozess, indem Sie das gefrorene Hydrogel und das Wasserbad aus dem Gefrierschrank entfernen und bei 25 ° C tauen. Der daraus resultierende Schwamm kann nun aus dem aufgetauten Wasser entfernt werden.</li>
</ol>5. Lyogel
<ol><li>Bereiten Sie ein RSSp-Lyogel vor, indem Sie direkt ein geformtes Hydrogel, entweder mit oder ohne Wasserbad, einfrieren und die gefrorene Hydrogelprobe auf einen Lyophilisator (Gefriertrockner) übertragen.</li>
	<li>Entfernen Sie das endgültige lyophilisierte Gel-Material aus dem Gefäß, in dem die Feuchtigkeitssublimation auftrat.</li>
</ol>6. Folien und Beschichtungen
<ol><li>Verwenden Sie eine der drei folgenden Methoden: Lösungsguss, Lösungspilung oder Tauchbeschichtung zur Herstellung von Folien oder Beschichtungen von rSSp.<ol>
<li>Die lösbare Seidenlösung auf die PDMS-Formen der gewünschten Form legen.</li>
		<li>200 μL der Folienlösung gießen und verteilen und trocknen lassen, bevor sie das PDMS-Substrat zum Testen oder zur Behandlung abschallen.</li>
		<li>Nachdem diese getrocknet werden können, entfernen Sie die geformten Folien für die mechanische Prüfung oder nach der Behandlung der Folien, um die mechanischen Eigenschaften zu verbessern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zur Herstellung einer Beschichtung oder einer Folie, die nicht aus dem Substrat entfernt werden kann, verwenden Sie entweder Spray oder Dip-Beschichtung, um eine dünne Folienschicht zu erzeugen. Hinweis: Um die Anhand zu sprühen, hat dieses Protokoll mit einem Master Airbrush Modell Lacksprayer Erfolg gefunden.<ol>
<li>Eine Dip-Beschichtung bilden, indem Sie einfach das Untergrund der Wahl in den lösubilisierten RSSp eintauchen und nach dem Trocknen wiederholen, um die gewünschte Dicke zu erreichen.</li>
		<li>Führen Sie vor dem Auftragen eines Tauchwells einen ersten Spritzmantel durch, um die Konsistenz und Wirksamkeit der Endschicht zu erhöhen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Klebstoffe
Achtung: Die Bildung von Klebstoffen wird durch eine der folgenden Methoden erreicht.
<ol><li>Fügen Sie den lösungrigen RSSp direkt auf ein Substrat und tragen Sie dann ein zweites Substrat über die Oberseite der Lösung auf. Die Teile fest zusammenklemmen und dann in einem Backofen mit einer Minimaltemperatur von 25 ° C für mindestens 16 Stunden trocknen.</li>
	<li>Alternativ können die beiden Substratoberflächen mit einer Sprühschicht besprüht und dann die Substrate zusammengeklemmt werden.</li>
	<li>Das Auftragen des RSSp durch die Dip-Methode der Beschichtung der Substrate und das Aufkleben der Substrate können auch zur Vorbereitung und Klebung verwendet werden.</li>
</ol>8. Nassgesponnen-Fasern
<ol><li>Die lösungläubige Dope-Lösung mit der Luer-Lok-Spitze durch eine 19 G-Gleichnadel in eine konzentrische Spritze laden. Luft sprengen und die Dope am Luer-Lok am Ende der Spritze sitzen lassen.</li>
	<li>Fügen Sie mindestens 25 mm PEEK-Schläuche mit einem internen Durchmesser von 0,01 Zoll in die einteiligen Finger-Armaturen für den Zoll 4-Zoll-OD und 10/32 Kegel ein. Befestigen Sie diese Passform an einem PEEK-Schlauch an Luer-Lok-Adapter.<ol>
<li>Ersetzen Sie die 19-Spurnadel mit dieser Einstellung auf die geladene Spritze.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Füllen Sie ein großes, klares Glasbad mit 99% reinem Isopropanol, um es für das Gerinnungsbad zu verwenden.<ol>
<li>Füllen Sie die Stretchbäder, die sich unterhalb der Stretchkate befinden. Diese werden 80:20 Isopropanol haben: Destilliertes Wasser im ersten Stretchbad, und 20:80 Isopropanol: Destilliertes Wasser im zweiten Stretchbad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stellen Sie das Stotet-Stretchsystem so ein, dass der erste Godet nach dem Gerinnungsbad und der erste Godet im ersten Stretchbad mit der gleichen Geschwindigkeit rotieren.<ol>
<li>Initiieren Sie die erste Strecke, indem Sie die Geschwindigkeiten des letzten Godet im Stretchbad 1, dem mittleren oberen Godet, und dem ersten Godet im Stretchbad 2 auf die gleiche Geschwindigkeit einstellen. Diese Geschwindigkeit wird 2x so schnell sein wie die anfängliche Faserentfernungsgeschwindigkeit.</li>
		<li>Initiieren Sie den zweiten Streckenabschnitt, indem Sie die Geschwindigkeiten des letzten Godet im Stretchbad 2, dem letzten oberen Godet und dem Wickler auf die gleiche Geschwindigkeit einstellen. Diese Geschwindigkeit wird 2x so schnell sein wie die Geschwindigkeit, die für die erste Strecke verwendet wird, oder 4x die anfängliche Faserentfernungsgeschwindigkeit.</li>
		<li>Nitrilhandschuhe an die Außenseite der Zwischengottes legen, um das Verrutschen der Faser zu verhindern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beginnen Sie langsam, die Lösung in das Gerinnungsbad zu extrudieren. In einem automatisierten System stellen Sie die Extrusionsrate auf eine Entfernungsgeschwindigkeit von 10 mm/.<ol>
<li>Lassen Sie die Faserextrusion gleichmäßig werden, bevor Sie die Fasern mit einem dünnen Metallhaken oder Zangen aus dem Bad ziehen. Überprüfen, ob die Faser aus dem Bad entfernt wurde, wurde eine Schleife zwischen der PEEK Schlauchspitze und Pfad der Faser, die das Bad verlassen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie die abgeholte Faser durch die Reihe von Götteln so, dass die Faser in den Stretchbädern untergetaucht ist, aber in der Luft zwischen den Stretchbädern trocknet und bevor sie auf eine Spule geht. Diese Trocknung wird durch die höher platzierten Zwischengottesdienststellen erreicht. Hinweis: Die Faserentfernungsrate und/oder die Extrusionsrate müssen auf der Grundlage der Proteinkonzentration, der Zusatzstoffe und des Proteintyps angepasst werden, um eine ausreichende Gerinnungszeit zu ermöglichen, ohne Fasern auf dem Boden des Gerinnungsbades zu bündeln.</li>
	<li>Befestigen Sie die voll gestreckte Faser mit Klebeband an der Spule.</li>
</ol>

<ol><li>Huemmerich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Structure+Elements+of+Spider+Dragline+Silks+and+Their+Contribution+to+Protein+Solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Primary Structure Elements of Spider Dragline Silks and Their Contribution to Protein Solubility.</a> Biochemistry. 43 (42), 13604-13612 (2004).</li>
<li>Schacht, K., Scheibel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+Hydrogel+Formation+of+a+Recombinant+Spider+Silk+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Controlled Hydrogel Formation of a Recombinant Spider Silk Protein.</a> Biomacromolecules. 12 (7), 2488-2495 (2011).</li>
<li>Jones, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+Than+Just+Fibers%3A+An+Aqueous+Method+for+the+Production+of+Innovative+Recombinant+Spider+Silk+Protein+Materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">More Than Just Fibers: An Aqueous Method for the Production of Innovative Recombinant Spider Silk Protein Materials.</a> Biomacromolecules. 16 (4), 1418-1425 (2015).</li>
<li>Tucker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+and+Physical+Properties+of+Recombinant+Spider+Silk+Films+Using+Organic+and+Aqueous+Solvents%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Mechanical and Physical Properties of Recombinant Spider Silk Films Using Organic and Aqueous Solvents.</a> Biomacromolecules. 15 (8), 3158-3170 (2014).</li>
<li>Harris, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sticky+Situation%3A+An+Investigation+of+Robust+Aqueous-Based+Recombinant+Spider+Silk+Protein+Coatings+and+Adhesives%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">A Sticky Situation: An Investigation of Robust Aqueous-Based Recombinant Spider Silk Protein Coatings and Adhesives.</a> Biomacromolecules. 17 (11), 3761-3772 (2016).</li>
<li>Jones, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+Heat+and+Pressure+for+Solubilization+of+Recombinant+Spider+Silk+Proteins+in+Aqueous+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Importance of Heat and Pressure for Solubilization of Recombinant Spider Silk Proteins in Aqueous Solution.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (11), 1955(2016).</li>
<li>Copeland, C. G., Bell, B. E., Christensen, C. D., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Process+for+the+Spinning+of+Synthetic+Spider+Silk%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Development of a Process for the Spinning of Synthetic Spider Silk.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 1 (7), 557-584 (2015).</li>
<li>Arcidiacono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+Processing+and+Fiber+Spinning+of+Recombinant+Spider+Silks%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Aqueous Processing and Fiber Spinning of Recombinant Spider Silks.</a> Macromolecules. 35 (4), 1262-1266 (2002).</li>
<li>Work, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Major+Ampullate+Silk+Fiber+Formation+by+Orb-Web-Spinning+Spiders%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+American+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Major Ampullate Silk Fiber Formation by Orb-Web-Spinning Spiders.</a> Transactions of the American Microscopical Society. 96 (2), 170-189 (1977).</li>
<li>Decker, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+Destruction+of+Endotoxin+in+Synthetic+Spider+Silk+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Method for the Destruction of Endotoxin in Synthetic Spider Silk Proteins.</a> Scientific Reports. 8 (12166), 1-6 (2018).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Nachdem rekombinante Spinnenseidenproteine gereinigt sind, müssen sie dann in einer Lösung hergestellt werden, die zur Materialbildung eingesetzt werden kann. Durch die Mischung von lyophilem Spinnenseidenprotein mit Wasser und die Exposition dieser Mischung der Mikrowellenbestrahlung, um Wärme und Druck zu erzeugen, ist es möglich, eine RSSp-Lösung vorzubereiten. Aus dieser einfachen und effizienten Methode der RSSp-Solubilisierung lassen sich eine Vielzahl von Materialformen herstellen. Jedes Material muss individuell ...

Spiderseide haben das Interesse der Materialwissenschaftler für ihre beeindruckende Kombination aus Festigkeit, Elastizität und Bioverträglichkeit geweckt. Die Neuaufnahme von Fasern ist traditionell der Tenor der Forschung. Diese Anstrengung wurde durch die rekombinante Spinnenseidenprotein (RSSp) Unlöslichkeit im Wasser sowie die Unfähigkeit der traditionellen Lösungstechniken (Chaotropen und Waschmittel), eine wässrige Lösung zu erreichen, behindert. Darüber hinaus funktionieren Techniken, die für lösende Versionen von rSSp entwickelt wurden, nicht an allen rSSp-Varianten und erfordern auch umfangreiche Manipulationen und Zeit, die oft zu Proteinverlust 1,2führen. Dies hat zum großen Teil dazu geführt, dass das Feld 1, 1, 1, 3, 3 hexafluoroisopropanol (HFIP) als Lösungsmittel zur Bildung von Fasern und anderen begrenzten Materialformen verwendet. Der Vorteil besteht darin, dass alle bekannten rSSp in HFIP löslich sind und eine Dateneinheitlichkeit zwischen den einzelnen Forschungsgruppen bieten. Der Nachteil ist, dass HFIP ein giftiges Lösungsmittel ist, das teuer und aus gesundheitlichen Gründen und aus Umweltgründen nicht in der Lage ist, zu skalieren.
Es wurde ein neuartiger Ansatz zur RSSp-Rotation entwickelt, der die technologische Kluft zwischen dem rauen organischen Lösungsmittel HFIP und anderen Techniken überbrückte, die selektiv für die RSSp-Rotation arbeiteten. Die Kombination von spezifischen Heizungen und Drücke wurde auf die Suspensionen von RSSp und Wasser angewendet. Die Ergebnisse waren nahezu 100% Lösungsmittel-und Rückgewinnung des RSSp sowie hohe Proteinkonzentrationen; Aus diesen Formulierungen, die mit HFIP oder anderen organischen Lösungsmitteln 3, 4,5,6nichtalle erreichbar waren, wurde eine VielzahlvonWerkstoffformenermittelt,ummöglich zu sein. Ziel dieses Ansatzes ist es, gereinigte und getrocknete rekombinante Spinnenproteine effizient und einfach in einer wässrigen Lösung zu lösen, die dann für die Herstellung einer Vielzahl von Materialformen genutzt werden kann.
Fasern, Folien, Beschichtungen, Klebstoffe, Hydrogele, Litogen, Mikrosphären und Schwammmaterialien sind mit dieser Methode aus der gleichen wässrigen RSSp-Lösung problemlos zu erreichen. Die weitere Entwicklung dieser Methode, nicht nur mit zusätzlichem RSSp, sondern auch mit anderen Proteinen, könnte zu neuen Materialformen und alternativen Möglichkeiten der Proteinreinigung und-lösung führen.

<table><tbody><tr><td>3-ml-Spritze mit Luer-Lok-Spitze</td><td>BD</td><td>309657</td><td>Spritzen anderer Größe können verwendet werden, aber um die Spitzen dran zu halten, wird empfohlen, Luer-Lok-Spitzen zu verwenden 4-ml-Kulturfläschchen</td></tr><tr><td>, klar mit gummierter Kappe</td><td>Wheaton</td><td>225142</td><td>Minimales Dope-Volumen beträgt 1 ml, maximal 2 mL</td></tr><tr><td>8-ml-Kulturfläschchen, klar mit gummierter Kappe</td><td>Wheaton</td><td>225144</td><td>Mindestdope-Volumen beträgt 2 ml, max. 4 ml</td></tr><tr><td>99% Isopropylalkohol, Reagenz ACS/USP</td><td>Grade Pharmco-Aaper</td><td>231000099</td><td></td></tr><tr><td>Freezone 4.5 Plus</td><td>Labconco</td><td>7386030</td><td>Gefriertrockner</td></tr><tr><td>Luer-Adapter Weiblicher Luer x 10-32 Buchse, Tefzel (ETFE)</td><td>IDEX</td><td>P-629</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowelle</td><td>Magic Chef</td><td>HMD1110B</td><td>120 V, 60 Hz AC; 1000 Watt; 1,1 Kubikfuß Kapazität; mit Glasdrehtisch</td></tr><tr><td>Einteiliger Fingertight 10-32 konisch, für 1/16" AD</td><td>IDEX</td><td>F-120X</td><td></td></tr><tr><td>PEEK Schlauch 1/16" AD x 0,010" ID</td><td>IDEX</td><td>1531B</td><td></td></tr><tr><td>Sprühgerät: Master Airbrush</td><td>Master Airbrush</td><td>TC-60</td><td></td></tr></tbody></table>

materialbildung von rekombinanten spider-seiden durch wässrige lösung mit wärme und druck

Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure

Viele Spinnen produzieren sieben Seidenarten. Sechs der Seiden sind in Form, wenn sie von den Spinnen hergestellt werden. Diese Fasern sind nicht wasserlöslich. Um die bemerkenswerten mechanischen Eigenschaften von Spinnenseiden zu reproduzieren, müssen sie in heterologischen Hosts hergestellt werden, da Spinnen sowohl territorial als auch kannibalistisch sind. Die synthetischen Analogien von Spinnenseide sind auch in wässrigen Lösungen unlöslich. So ist ein großer Teil der Forschung an rekombinanten Spinnenseiden auf organische Lösungsmittel angewiesen, die sich nachteilig auf die großflächige Produktion von Materialien auswirken. Die Methode unserer Gruppe zwingt die Lösung dieser rekombinanten Spinnenseiden ins Wasser. Bemerkenswert ist, dass, wenn diese Proteine mit dieser Methode der Wärme und des Drucks hergestellt werden, eine breite Palette von Materialformen aus der gleichen Lösung rekombinanter Spinnenseidenproteine (rSSp) hergestellt werden kann, darunter: Folien, Fasern, Schwamm, Hydrogel, Lyogel und Klebstoffe. Dieser Artikel zeigt die Produktion der gelösten RSSp und Materialformen in einer Weise, die leichter zu verstehen ist als aus schriftlichen Materialien und Methoden allein.

Aus der beschriebenen Methode der Lösungsmethode von rSSp lassen sich eine Vielzahl von Materialformen erzielen, wie in Abbildung1 zu sehen ist. Die Methode der Lösungsmittellösung besteht darin, Wärme und Druck, die durch eine herkömmliche Mikrowelle erzeugt werden, auf eine Aufhängung von RSSp und Wasser zu verwenden. Wenn kritische Temperaturen und Drücke erreicht werden, wird sich das Protein lösen. Aus dieser lösungsgeschichteten RSSp-Lösung werden die e...

Hier stellen wir ein Protokoll zur Herstellung wasserlöslicher rekombinanter Spinnenseidenproteinlösungen und der aus diesen Lösungen entstandenen Materialformen vor.

Materialbildung von Rekombinanten Spider-Seiden durch wässrige Lösung mit Wärme und Druck

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order ...

Diese Methode der Löslichkeit rekombinanter Spinnenseiden produziert Materialformen, die mit traditionellen harten organischen Lösungsmitteln nicht möglich sind. Darüber hinaus ist der Prozess Getreide, was zu einer einfachen Proteinlösung in Wasser führt. Durch die Verwendung dieser Methode erhalten die gebildeten oder hergestellten Materialien die wünschenswerten Eigenschaften von Spinnenseidenproteinen.Diese Löslichkeitstechnik für rekombinante Spinnenseiden ermöglicht die Löslichkeit rekombinanter Spinnenseiden in einem einstufigen Prozess. Dies ist wünschenswert, weil diese notorisch schwierigen Proteine nicht durch umfangreiche Verarbeitung verloren gehen. Da die Lösungen nur Protein in Wasser sind, können andere biologisch aktive Verbindungen hinzugefügt werden, wenn dies für die Anwendung wünschenswert ist.Insbesondere die Proteinstruktur-Funktionsbeziehung, dieses System ist memetische, wie eine Spinne eine Faser macht, indem sie Wasser und Proteine in einer hohen Konzentration nutzt. Durch die Verwendung dieser Löslichkeitsmethode und einer anschließenden Materialbildung sollte es möglich sein, Verständnis für die gebildeten Materialien und die strukturen, die für sie verantwortlich sind, zu gewinnen. Es wird angenommen, dass es sein kann, Wir haben diese Technik für die Löslichkeit synthetischer Peptide verwendet, die sonst eine alkalische oder saure Umgebung benötigen würden, um zu solvate.Das kann bei nachgelagerten Anwendungen für diese Peptide von Vorteil sein. Darüber hinaus neigen eine Reihe bekannter Proteine, wenn sie synthetisch exprimiert werden, dazu, in der unlöslichen Fraktion zu enden. Resolubilisieren, und dann diese Proteine neu falten ist oft ein mühsamer Prozess, der zu großen Verlusten führt.Durch die Verwendung dieser Technik könnte es möglich sein, die Effizienz von Rückgewinnungsprozessen für unlösliche Proteine zu erhöhen. Das Platzieren einer versiegelten Durchstechflasche in eine Mikrowelle ist etwas beängstigend, was das Risiko einer Überhitzung und damit über das Druckaufdrücken der Durchstechflasche gibt. Das Verständnis des inszenierten Ansatzes zur Anwendung von Wärme und Druck ist von entscheidender Bedeutung.Zweitens, für die rekombinante Spinnenseide insbesondere, mit Salz vorhanden wird nicht zulassen, dass die Technik arbeiten oder arbeiten so effektiv, je nachdem, wie viel Salz vorhanden ist. Salzentfernung ist der Schlüssel. Seien Sie geduldig und vorsichtig, überwachen Sie Ihre Mikrowellenzeiten und -temperaturen in der Durchstechflasche genau.Es ist entscheidend, da es eine Reihe von beweglichen Teilen gibt, die oft schwierig durch herkömmliche schriftliche Materialien und Methodenabschnitte zu transportieren sind. Angesichts der Tatsache, dass es viele Proteine gibt, die Löslichkeitsprobleme haben, die eine angemessene Untersuchung verhindern, hat diese Methode das Potenzial, über eine Vielzahl von Proteinräumen angewendet zu werden, um sich zu verbessern, oder sogar analytische Techniken und Charakterisierung zu ermöglichen. Wählen Sie zunächst eine saubere und neue acht Milliliter autoklavierbare Borosilikatglaskultur-Durchstechflasche mit einem gummigefütterten Schraubverschluss aus und legen Sie die leere Durchstechflasche auf eine analytische Waage.Reißen Sie die Masse der leeren Durchstechflasche, so dass die Waage NullMasse liest. Fügen Sie das gewünschte lyophilisierte rekombinante Spinnenseidenproteinpulver in die leere Durchstechflasche für das jeweilige Material ein. Dann fügen Sie die gewünschte Menge an ultrareinem Wasser, mindestens zwei Milliliter, in die Durchstechflasche.Versiegeln Sie die Durchstechflasche und wirbeln Sie den Inhalt schnell aus, um eine dispergierte und homogene rekombinante Spinnenseide-Protein-Mischung zu schaffen. Führen Sie eine abschließende Überprüfung der Durchstechflasche durch, um sicherzustellen, dass sie fest und sicher angezogen wurde. Dann übertragen Sie die schwebende rekombinante Spinnenseidenproteinmischung in einen herkömmlichen Mikrowellenherd mit einem Leistungsbereich von 700 bis 1500 Watt.Beginnen Sie den Betrieb der Mikrowelle mit fünf Sekunden Bursts, die volle Leistung durch manuelles Ein- und Ausschalten einstellen. Nach jedem Platzen kurz die Tür öffnen und die Durchstechflasche vorsichtig mischen, um eine Setzung zu verhindern, und halten Sie die aufgehängte Mischung. Gelegentlich die Durchstechflasche und die Lösung abkühlen lassen und verhindern, dass die überhitzte Lösung die Dichtung berührt.Verwenden Sie ein Infrarot-Thermometer, um die Temperatur der Lösung zu messen, die einen Teil der Durchstechflasche enthält. Wiederholen Sie den Mikrowellenprozess, bis die Temperatur mindestens 130 Grad Celsius erreicht und alle festen Partikel vollständig aufgelöst wurden. Dann lassen Sie die Temperatur der Lösung und die Durchstechflasche Kappe unter 100 Grad Celsius abkühlen.Bevor diese Lösung vollständig gekühlt wird, gießen Sie sie aus der Durchstechflasche in spezifische Geometrien, um ein Hydrogel zu bilden. Nachdem das Hydrogel gebildet ist, legen Sie es in ein Wasserbad und übertragen Sie es bei minus 20 Grad Celsius in den Gefrierschrank. Warten Sie, bis das Bad vollständig gefroren ist.Schließen Sie den Schwammbildungsprozess ab, indem Sie das gefrorene Hydrogel und das Wasserbad aus dem Gefrierschrank entfernen und bei 25 Grad Celsius auftauen. Entfernen Sie dann den resultierenden Schwamm aus dem aufgetauten Wasser. Um ein Lyogel vorzubereiten, eine gefrorene Hydrogelprobe auf einen Lyophilisator zu übertragen.Nach 24 Stunden das endgültige lyophilisierte Gelmaterial aus dem Gefäß entfernen. Um Filme aus rekombinantem Spinnenseidenprotein herzustellen, werfen Sie 200 Mikroliter des heißen löslichen rekombinanten Spinnenseidenproteins aus der Durchstechflasche auf eine PDMS-Form der gewünschten Form. Nach dem Trocknen das PDMS-Substrat zur Prüfung oder Behandlung abziehen.Um eine Beschichtung vorzubereiten, die nicht aus dem Substrat entfernt werden kann, verwenden Sie einen Airbrush-Sprüher, um das lösliche rekombinante Spinnenseidenprotein aufzutragen, um eine erste Sprühbeschichtung auf dem Substrat ihrer Wahl durchzuführen. Nach dem Trocknen das beschichtete Substrat in das lösliche rekombinante Spinnenseidenprotein untertauchen, um eine Dip-Beschichtung zu bilden. Wiederholen Sie die Tauchbeschichtung, um die gewünschte Dicke zu erreichen.Um Klebstoffe zu bilden, verwenden Sie eine Pipette, um das lösliche rekombinante Spinnenseidenprotein auf ein Substrat zu geben, und tragen Sie dann ein zweites Substrat über der Oberseite der Lösung auf. Die Teile fest zusammenklemmen und die Proben dann mindestens 16 Stunden lang in einem Ofen mit einer Minimaltemperatur von 25 Grad Celsius trocknen. Um nass gesponnene Fasern zu erzeugen, verwenden Sie eine 19 Gauge Gleitnadel und laden Sie die lösliche Dope-Lösung in eine konzentrische Spritze mit einer Luer-Verriegelungsspitze.Luftblasen auswerfen und die Dope am Luer-Schlossende der Spritze sitzen lassen. Legen Sie mindestens 25 Millimeter PEEK-Schläuche in die einteiligen fingerdichten Armaturen des PEEK-Schlauchs für einen über 16 Zoll Außendurchmesser und 10 über 32 Kamm ein. Ersetzen Sie die 19-Spur-Nadel mit diesem Setup auf dem Luer-Schloss-Buchsenadapter der Spritze.Legen Sie dann Nitrilhandschuhe auf die Außenseite der Zwischengötter, um die zu entführende Faser vor dem Rutschen zu bewahren und um eine Beschädigung der Motoren zu vermeiden. Holen Sie sich ein hohes Klarglasbad mit 99% reinem Isopropanol, um es als Gerinnungsbad zu verwenden. Füllen Sie das erste Stretchbad mit einem Verhältnis von Isopropanol und destilliertem Wasser von 80 bis 20.Im zweiten Stretchbad ein Verhältnis von Isopropanol und destilliertem Wasser von 20 bis 80 füllen. Richten Sie das Godet-Stretch-System auf dem Computer ein. Um die Hauptgeschwindigkeit der Faserentfernung einzustellen, passen Sie die Schiebestange für Godet Triplet A-Geschwindigkeit auf einen Wert zwischen 10 und 14 Millimeter pro Sekunde an, je nachdem, wie gut und schnell sich die Faser bildet.Initiieren Sie eine erste Strecke, indem Sie die Schiebestange des Godet Triple B Stretch-Verhältnisses auf zwei für die letzte Godet im Stretchbad eins, Die mittlere obere Godet und die erste Godet im Stretchbad zwei bewegen. Initiieren Sie den zweiten Abschnitt, indem Sie die Schiebestange des Godet Triple C Dehnungsverhältnisses auf zwei für das letzte Godet im Stretchbad zwei, die letzte obere Godet und den Wicker bewegen. Dieses Setup sorgt dafür, dass die erste Godet nach dem Gerinnungsbad und die erste Godet im ersten Stretchbad mit der gleichen Geschwindigkeit rotieren.Als nächstes laden Sie die Seidenlösung in die Spritze eines benutzerdefinierten Spin-Line-Instruments. Legen Sie im automatisierten System die Extrusionsrate auf 10 Millimeter pro Sekunde fest, um die Seidenlösung in das mit Isopropanol gefüllte Glasgerinnungsbad zu extrudieren. Lassen Sie die Faserextrusion gleichmäßig werden, bevor Sie die Fasern mit einem dünnen Metallhaken aus dem Bad ziehen.Stellen Sie sicher, dass das Entfernen der Faser aus dem Bad eine Schleife zwischen der PEEK-Schlauchspitze und dem Pfad der Faser beim Verlassen des Bads erzeugt. Führen Sie die gewonnene Faser durch die Reihe von Godets, so dass die Faser in den Stretchbädern untergetaucht ist, aber in der Luft zwischen den Stretchbädern trocknet, und bevor Sie auf eine Spule gehen. In diesem Protokoll können durch eine Löslichkeit von rekombinantem Spinnenseidenprotein eine Vielzahl von Materialformen erreicht werden.Sieben Materialformen werden hier vorgestellt. Hydrogele, Lyogel, Schwamm, Klebstoffe, Beschichtungen, Folien und Fasern. Fasern erfordern die umfangreichste Verarbeitung, indem sie in ein Gerinnungsbad extrudieren und dann die Rohfaser in Post-Bin-Stretch-Badewannen seriell dehnen.Angesichts der Tatsache, dass die Protein- und Wasserlösungen auf eine relativ hohe Temperatur und einen relativ hohen Druck erhitzt werden, haben wir die Erfahrung gemacht, dass die Lösungen an dem Punkt steril sind, an dem das Protein gelöst wird. Dadurch kann jede der hier vorgestellten materiellen Formen in die Zellkultur gebracht werden, solange sie angemessen behandelt werden, um die zelluläre Reaktion auf die Materialien zu untersuchen. Sicherlich hat diese Technik zur Entdeckung neuer Materialformen geführt, einschließlich Klebstoffen und Schwammmaterial.Materialformen, die nicht unbedingt auf Faserbildung ausgerichtet sind, obwohl die Faserbildung einer der Bereiche ist, die sich auch durch die Entwicklung dieser Technik verbessert haben. Die Erzeugung von Wärme und Druck in einer versiegelten Durchstechflasche birgt eine inhärente Gefahr. Tragen Sie bei der Durchführung dieser Verfahren immer persönliche Schutzausrüstung.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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