Eine automatisierte Methode zur Durchführung des In-Vitro-Mikrokern-Assays mit multispektraler Bildflusszytometrie

Der bildstrombasierte Mikrokern-Assay kann mehrere Einschränkungen von Methoden wie der automatisierten Mikroskopie und der konventionellen Durchflusszytometrie überwinden, einschließlich niedriger Durchsatz und fehlender visueller Bestätigung von Ereignissen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass alle erforderlichen Ereignisse zur Bestimmung der Genotoxizität und Zytotoxizität automatisch abgebildet, identifiziert und bewertet werden können, ohne Mikroskopschlitten erstellen zu müssen. Für die Zellexposition gegenüber Clastogenen und/oder Aneugenen einen Millimeter der chemikalie von Interesse zu sieben bis acht mal zehn zu den fünften Versuchszellen in neun Millilitern des geeigneten Zellkulturmediums in einem T25-Kolben und einem Milliliter Wasser zu den Kontrollkulturen hinzufügen.

Inkubieren Sie die Kolben bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid für drei Stunden, bevor Sie die Zellen auf ein 15 Milliliter Polypropylenrohr pro Kolben übertragen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie die Pellets in 10 Milliliter frischem Kulturmedium pro Tube für die Aussaat in neuen T25-Kulturkolben wieder auf. Fügen Sie dann 150 Mikroliter der Lagerkonzentration von Cytochalasin B zu jedem Kolben hinzu, um eine Endkonzentration von drei Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen.

Bringen Sie die Kolben für eine Erholungszeit von 1,5 bis zwei Verdoppelungszeiten an den Inkubator zurück, wie von den Leitlinien der Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung empfohlen. Am Ende der Erholungsphase die Kulturen zur Zentrifugation in einzelne 15 Milliliter Polypropylenröhren übertragen und die Pellets in fünf Millilitern 75 Millimolar Kaliumchlorid wieder aufsetzen. Mischen Sie die Proben bei vier Grad Celsius sieben Minuten lang sanft durch Inversion und bebrüten Sie sie.

Am Ende der Inkubation zwei Milliliter von vier Prozent Formalin zu jeder Probe hinzufügen und sanft mit drei Inversionen mischen. Geben Sie die Proben für 10 Minuten auf vier Grad Celsius zurück, bevor Sie die Zellen durch Zentrifugation sammeln. die Pellets in 100 Mikroliter frischem Vier-Prozent-Formalin für 20 Minuten wieder aufhängen.

Am Ende der Inkubation die festen Zellen in fünf Milliliter Waschpuffer pro Rohr durch Zentrifugation waschen und die Pellets in 100 Mikroliter Waschpuffer pro Tube wieder aufhängen. Als nächstes übertragen Sie die Proben in einzelne 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohre, um auf ein Hämozytometer zu zählen. Fügen Sie fünf Mikroliter von 100 Mikrogramm pro Milliliter Hoechst 33342 pro 1,0 x 10 zu den sechs Zellen pro Milliliter und 10 Mikroliter 500 Mikroliter pro Milliliter RNase pro 100 Mikroliter Probe pro Tube hinzu.

Zentrifugieren Sie die Proben nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid in einer Mikrozentrifuge und entfernen Sie alle bis auf 30 Mikroliter Überstand aus jedem Rohr. Dann die Proben sorgfältig wieder aussetzen, wobei darauf geachtet wird, keine Blasenbildung zu induzieren. Wenn Blasen bei der Resuspension auftreten, streichen Sie vorsichtig das Rohr, um sie zu entfernen.

Um die Proben mittels multispektraler Bildströmungszytometrie auszuführen, schalten Sie zunächst den 405-Nanometer-Laser ein und stellen Sie die Laserleistung auf 10 Milliwatt ein. Deaktivieren Sie alle anderen Laser, einschließlich des Seitenstreulasers, und stellen Sie das helle Feld auf die Kanäle eins und neun ein. Vergewissern Sie sich, dass der Vergrößerungsregler auf 60x eingestellt ist, dass der Modus mit hoher Empfindlichkeit ausgewählt ist und dass nur die Kanäle eins, sieben und neun in der Bildergalerie angezeigt werden.

Klicken Sie auf Streudiagramm, und wählen Sie die gesamte Grundgesamtheit und Fläche M01 auf der X-Achse aus. Wählen Sie das Seitenverhältnis M01 auf der Y-Achse aus, und klicken Sie auf den quadratischen Bereich, um einen Bereich um die einzelnen Zellen zu zeichnen. Benennen Sie diese Region einzelne Zellen, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Diagramm, um Bereiche auszuwählen.

Markieren Sie den Bereich der einzelnen Zellen, und ändern Sie die X-Koordinaten auf 100 und 900 und die Y-Koordinaten auf 0,75 und eine. Legen Sie die Erfassungsparameter fest, und geben Sie den Dateinamen und den Zielordner an. Ändern Sie dann die Anzahl der Ereignisse auf 20.000, wählen Sie die positive DNA-Population aus, und führen Sie die erste Probe aus.

Um eine Datendatei in IDEAS zu öffnen, klicken Sie auf Analyse starten, um den Assistenten zum Öffnen von Dateien zu starten, und navigieren Sie nach der gewünschten Rohbilddatei. Klicken Sie dann auf Weiter, und suchen Sie in der Bildergalerie nach einer zelle. Um eine Maske zu erstellen, klicken Sie auf , um das interessennahe Bild auszuwählen und die Registerkarte Analyse zu öffnen.

Klicken Sie auf Masken, Neu und Funktion, um LevelSet auszuwählen. Wählen Sie unter Maske M07 und Middle Level Mask aus, und legen Sie die Konturdetails skala auf drei fest. Klicken Sie dann zwei Mal auf OK.

Um die Anzahl der binucleatierten Zell-Features zu erkennen, öffnen Sie die Registerkarte Analyse, und wählen Sie Features und Neu aus. Wählen Sie für den Feature-Typ Spot-Anzahl aus. Wählen Sie unter Maske die endgültige binucleated-Maske aus, und legen Sie die Verbindung auf vier fest, ändern Sie dann den Namen in Spot Count BNC, und klicken Sie auf OK und schließen Sie, um die Feature-Werte zu berechnen.

Klicken Sie für ein Punktanzahl-Binucleat-Zellhistogramm auf Histogramm, und wählen Sie nicht-apoptopic als übergeordnete Grundgesamtheit aus. Wählen Sie für das X-Achsen-Feature Die Option BnC-Wert von Spot count aus, und klicken Sie auf OK und linearer Bereich, zeichnen Sie dann einen Bereich über Bim Two und benennen Sie diesen Bereich 2N. Um eine Mikrokernmaske zu erstellen, wählen Sie eine binucleatierte Zelle aus, die einen Mikrokern enthält, aus der Bildergalerie aus, und öffnen Sie Masken auf der Registerkarte Analyse.

Um eine Spot-Identifikationsmaske zu erstellen, klicken Sie auf Neu und Funktion, und wählen Sie Spot aus. Vergewissern Sie sich, dass das Helle Optionsfeld ausgewählt ist, und wählen Sie M07 unter Maske aus. Legen Sie das Spot-auf-Zell-Hintergrundverhältnis und den minimalen Radius auf zwei fest, und legen Sie den maximalen Radius auf sechs fest.

Klicken Sie auf OK und OK, um die Maske zur Liste auf der linken Seite hinzuzufügen, und klicken Sie dann auf Neu, um eine weitere Maske zu erstellen. Klicken Sie auf den Spot M07 Channel sieben Helle zwei sechs zwei Masken und klicken Sie auf den Pfeil nach unten, um ihn der Maskendefinition hinzuzufügen, und klicken Sie auf die Operatoren Ein und Nicht. Klicken Sie auf den Pfeil nach unten, um der Maskendefinition eine erweiterte Bereichsmaske hinzuzufügen.

Um eine polynukleierte Bevölkerungsmaske zu erstellen, klicken Sie auf Analyse, Masken, Neu und Funktion. Wählen Sie unter Funktion Bereich aus. Wählen Sie unter Maske Wasserscheidende Karte M07 Channel07, Mitte, drei, zwei aus, und legen Sie das Bild so fest, dass es auf Kanal 07 angezeigt wird.

Legen Sie die minimalen und maximalen Flächenwerte auf 135 bzw. 5000 fest, und legen Sie die Minimal- und Maximalseitenverhältniswerte auf 0,4 bzw. 1 fest. Klicken Sie auf OK, und ändern Sie im Namensfeld den Text, um die POLY-Maske zu lesen, und klicken Sie dann auf OK und Schließen. Um eine benutzerdefinierte Ansicht zu erstellen, klicken Sie auf die Schaltfläche Bildergalerieeigenschaften, öffnen Sie die Registerkarte Verbundwerkstoffe, und klicken Sie auf Neu.

Geben Sie unter Name Kanal 01 in Kanal 07 ein. Klicken Sie auf Bild hinzufügen, und wählen Sie unter Bild Kanal 01 aus, und legen Sie den Prozentsatz auf 100 fest. Klicken Sie erneut auf Bild hinzufügen, und wählen Sie unter Bild Kanal 07 aus, und legen Sie den Prozentsatz auf 100 fest.

Klicken Sie auf die Registerkarte Anzeigen, klicken Sie auf Neu, und geben Sie unter Name BNC- und MN-Masken ein. Klicken Sie dann auf Spalte hinzufügen, und wählen Sie unter Bildtyp Kanal 01 aus, und wählen Sie unter Maske aus Keine. Klicken Sie auf Spalte hinzufügen, und wählen Sie unter Bildtyp Kanal 07 aus, und wählen Sie unter Maske die Option Keine aus.

Klicken Sie auf Spalte hinzufügen, klicken Sie auf das Optionsfeld "Verbund", und klicken Sie dann auf Okay, um die benutzerdefinierte Ansicht abzuschließen. Klicken Sie auf das Pulldown-Menü Ansicht, und klicken Sie auf die Ansicht der BNC- und MN-Masken. Klicken Sie auf die Schaltfläche Masken ausblenden anzeigen.

Um wichtige Ereignisse aufzuzählen, öffnen Sie die Registerkarte Berichte, und klicken Sie auf Statistikbericht definieren, und klicken Sie dann im neuen Fenster auf Spalten hinzufügen. Um die Statistik für die Liste der zellenzählungen hinzuzufügen, wählen Sie unter Statistik die Option Anzahl aus, und wählen Sie unter Ausgewählte Bevölkerung die BNC-Population aus, und klicken Sie dann auf Statistik hinzufügen, um die Statistik zur Liste hinzuzufügen und die Vorlage zu speichern. Nachdem alle Statistiken der Liste hinzugefügt wurden, klicken Sie auf Schließen, dann auf OK, und speichern Sie dann die Datenanalysevorlage.

Um die experimentellen Dateien im Batch zu verarbeiten, klicken Sie im Menü Extras auf Batch-Datendateien und im neuen Fenster auf Batch-Dateien hinzufügen. Klicken Sie auf Dateien hinzufügen, um die Experimentdateien auszuwählen, die dem Stapel hinzugefügt werden sollen, und klicken Sie unter der Option Vorlage oder Datenanalysedatei auswählen auf die Schaltfläche Ordner öffnen. Navigieren Sie zu der Vorlage, die gerade gespeichert wurde, und öffnen Sie sie.

Klicken Sie auf OK, um das aktuelle Fenster zu schließen. Klicken Sie dann auf Batches senden, um die Stapelverarbeitung aller Dateien zu starten. Hier werden vier ausgewählte Panels zur Identifizierung von binucleatierten Zellen gezeigt.

Diese bivariaten Plots und Histogramme ermöglichen die Auswahl von binukleierten Zellen sowie die Identifizierung jener Zellen, die zwei Kerne mit ähnlicher Zirkularität, Flächen und Intensitäten haben und gut voneinander getrennt sind. Diese Brightfield- und Hoechst-Bilder sowie die binucleierten Zell- und Mikrokernmasken erleichtern die Identifizierung und Aufzählung von Binukleat-Zellen und Mikrokernen. Die Anwendung des Spot-Count-Features verwendet die polynukleierte Maske, um mononukleäre, trinukleare und quadranukleare Zellen zu identifizieren.

Die Anzahl der Tri- und Quadrakernzellen kann dann summiert werden, um die endgültige Anzahl der polynukleierten Zellen zu erhalten, die für die Berechnung der Zytotoxizität erforderlich sind. Hierbei werden repräsentative Genotoxizitäts- und Zytotoxizitätswerte für das Endogen Colchicin, das Clastogen Mitomycin C und eine negative Kontrolle, Mannitol, angezeigt, um die Gültigkeit des Protokolls nachzuweisen. Die Kennzeichnung der Zellen mit einer angemessenen Konzentration von DNA-Färbung ist entscheidend, um eine qualitativ hochwertige Bildaufnahme zu gewährleisten, so dass alle wichtigen Ereignisse leicht identifiziert und bewertet werden können.

Diese Techniken gelten auch für den Mikrokern-Assay für DieStrahlungsbiodosimetrie, der eine Dosisabschätzung bei Personen ermöglicht, die möglicherweise Strahlung ausgesetzt waren.