Hochdurchsatz-Traktionskraftmikroskopie mit PDMS zeigt dosisabhängige Effekte transformierender Wachstumsfaktoren auf den epitheliaal-mesenchymalen Übergang
1. Juni 2019
Wir präsentieren einen mit Silikonkautschuk (PDMS) hergestellten Assay mit hoher Durchsatz-Traktionskraft. Dieser neuartige Test eignet sich zur Untersuchung körperlicher Veränderungen der Zellkontraktilität während verschiedener biologischer und biomedizinischer Prozesse und Krankheiten. Wir demonstrieren den Nutzen dieser Methode, indem wir eine TGF--abhängige Erhöhung der Kontraktilität während des epitheliaal-mesenchymalen Übergangs messen.
Mein Labor interessiert sich für Mechanobiologie, die untersucht, wie Zellen sich ausüben und von mechanischen Kräften beeinflusst werden. Eine Möglichkeit, die Mechanobiologie zu quantifizieren, ist die Messung der Zellkontraktilität. In anhaftenden Zellen manifestiert sich Kontraktilität in Zugkräften, die auf das Zellsubstrat ausgeübt werden. Wir quantifizieren diese Kräfte anhand einer Methode, die allgemein als Traktionskraftmikroskopie oder TFM bezeichnet wird. Und TFM ist in einer Vielzahl von verschiedenen Methoden implementiert, aber ein gemeinsamer Aspekt ist, dass es eine ziemlich serielle und langsame Labortechnik ist, die typischerweise in einem einzigen Gericht wie diesem hier durchgeführt wird. Dies beschränkt uns auf die Bewertung einer Population oder eines Zustands zu einem Zeitpunkt. Überall in der Zellkultur wurde vor einiger Zeit verbessert, aber die Schaffung von Multiwell-Gerichte und wir dachten, wäre es nicht toll, es könnte wir TFM mit dem gleichen erhöhten Durchsatz und die gleiche Effizienz der Zeit und Reagenzien? Und das war unsere Lösung. Also haben wir eine 96-Well-Traktionskraftschale geschaffen. Und es sieht einem herkömmlichen 96-Well-Gewebe-Kulturgericht sehr ähnlich, aber mit diesem Gericht können wir nicht nur 96 verschiedene Zellkulturbedingungen untersuchen, sondern auch deren Zellkontraktilität quantifizieren. Dies stellt eine viel höhere Durchsatzlösung als Einzelschalenansätze dar, die es uns ermöglichen, verschiedene Zellbedingungen und kontraktile Reaktionen zu untersuchen. Während der Krebsmetastasierung wandern Krebszellen von ihrem primären Standort zu sekundären Standorten und verbreiten die Krankheit in unserem Körper. Dieses metastasierende Verhalten von Krebszellen macht 90% des krebsbedingten Todes aus. Einer der vorgeschlagenen Mechanismen für Epithelkrebszellen, um einen wandernderen und invasiveren Phänotyp zu erwerben, ist epithelial-mesenchymaler Übergang, EMT. Während der EMT werden sie wandernder und invasiver und verändern ihr körperliches Verhalten. Um diese Veränderungen im physikalischen Verhalten besser zu verstehen, nutzen wir unser weiches Siliziumsubstrat, um Veränderungen in der Kontraktilität von Maus-Brustdrüsenzellen mit EMT-Induktion durch TGF-In dieser Studie zu messen, untersuchten wir, wie unterschiedliche Konzentrationen und Inkubationszeit des physikalischen Verhaltens von TGF-beeinflussen. Polydimethylsiloxan ist ein sehr konformer Kautschuk mit dem niedrigsten Young-Modul von etwa 0,6 Kilopascal. Die Steifigkeit dieses Materials kann auch mit verschiedenen Konzentrationen von Vernetzen, einschließlich SYLGARD 184.To messen mechanische Eigenschaften von PDMS wir verwenden ein Rheometer. Nach dem Mischen von Teil A und Teil B des PDMS, in einem Eins-zu-Eins-Gewichtsverhältnis und Zugabe des Aushärtungsmittels mit dem angegebenen Gewichtsprozentsatz, laden Sie die vorbereitete Charge auf die Rheometerplatte. Achten Sie darauf, genügend probenweise zu laden, um den Spindelbereich vollständig abzudecken. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Spindel die Probe vollständig berührt, ohne freien Platz an der Kante. Jede zusätzliche Probe sollte sorgfältig getrimmt und von der Platte abgewischt werden. Messen Sie den Endspeichermodul und die Zeitabhängigkeit der Viskoelastizität jeder Probe, indem Sie Zeit- und Frequenzsweeps bei einem oszillatonigen Scherstamm von 0,5%Newsha durchführen]Diese Grafik ist ein Beispiel für den Zeit-Seq-Test, der das rheologische Verhalten von Polydimethylsiloxan mit angewendetem Oszillator-Scherstamm von 0,5% und einer Temperatur von 100 gemessen hat.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Diese Studie stellt einen Hochdurchsatz-Traktionskraft-Assay vor, der aus Silikonkautschuk (PDMS) hergestellt wird und zur Untersuchung physikalischer Veränderungen der Zellkontraktilität während verschiedener biologischer Prozesse dient. Die Anwendbarkeit der Methode wird durch die Messung TGF-β-abhängiger Zunahmen der Kontraktilität während des epithelialen-zu-mesenchymalen Übergangs demonstriert.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Biomechanik
- Biomedizinische Technik
Hintergrund
- Die Zellkontraktilität ist entscheidend für verschiedene biologische Prozesse.
- Das Verständnis von Veränderungen der Kontraktilität kann Einblicke in Krankheiten liefern.
- Herkömmliche Methoden weisen möglicherweise einen geringen Durchsatz und eine unzureichende Empfindlichkeit auf.
- PDMS ist ein vielseitiges Material zur Erstellung von Assays.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Hochdurchsatz-Assays zur Messung der Zellkontraktilität.
- Beurteilung des Einflusses von TGF-β auf die Kontraktilität während des epithelialen zu mesenchymalen Übergangs.
- Bereitstellung einer zuverlässigen Methode zur Untersuchung des Zellverhaltens unter verschiedenen Bedingungen.
Verwendete Methoden
- Herstellung eines Traktionskraftassays unter Verwendung von PDMS.
- Messung der Zellkontraktilität als Reaktion auf TGF-β.
- High-Throughput-Analyse zur Bewertung mehrerer Proben.
- Beurteilung der Dynamik des epithelial-mesenchymalen Übergangs.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Messung von Kontraktivitätsänderungen in Zellen.
- Nachgewiesene, von TGF-β-abhängige Zunahmen der Kontraktivität.
- Bestätigung der Eignung des auf PDMS basierenden Assays.
- Gewonnene Erkenntnisse über die Mechanik von Zellübergangsprozessen.
Schlussfolgerungen
- Der PDMS-Traktionskraft-Assay eignet sich zur Untersuchung der Zellkontraktilität.
- Die erhöhte Kontraktilität während des epithelialen zu mesenchymalen Übergangs wurde bestätigt.
- Diese Methode kann auf verschiedene biologische und biomedizinische Studien angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Hochdurchsatz-Traktionskraftmikroskopie-Plattform ermöglicht eine quantitative Beurteilung der zellulären Kontraktilität in einem skalierbaren Format und unterstützt die mechanistische Risikominderung in der frühen Forschung. Indem die durch TGF-β induzierte epitheliale-mesenchymale Transition mit messbaren biophysikalischen Veränderungen verknüpft wird, liefert die Methode einen prädiktiven Wert für die Zielstrukturvalidierung in der Fibrose- und Metastasenforschung. Das auf PDMS basierende System bietet Reproduzierbarkeit und Kompatibilität mit bestehenden Mehrfachbrunnen-Arbeitsabläufen und verbessert so die unternehmensweite Wiederverwendbarkeit in Entdeckungsbiologie und Assay-Entwicklungsprozessen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von TGF-β als Modulator der zellulären Kontraktilität während der EMT und unterstützt die Überprüfung von Zielhypothesen.
- Operativer Wert: Liefert dosisabhängige und zeitlich aufgelöste Kontraktilitätsdaten, um mechanistische Zielstrukturen in Fibrose- und Krebswegen zu priorisieren.
- Prädiktiver Wert: Quantifiziert biophysikalische Phänotypen, die mit der EMT assoziiert sind, und unterstützt so die präklinische Zielstrukturauswahl und die Risikominderung bei Signalwegen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht quantitative, substratunabhängige Messungen der Kontraktilität zur Standardisierung von Assays in der Mechanobiologie-Screening.
- Operationaler Wert: Kompatibel mit 96-Loch-Formaten, wodurch die parallele Untersuchung von Substanzbibliotheken oder Zytokindosen ermöglicht wird.
- Assay-Bereitschaft: Verwendet stabile, inerte PDMS-Substrate mit einstellbarem Elastizitätsmodul (0,4–100 kPa) und unbegrenzter Haltbarkeit, wodurch die Variabilität zwischen Chargen verringert wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet die Dosis und Dauer von TGF-β mit der kontraktilen Aktivität und unterstützt präklinische Modelle des EMT, die auf Biomarkern basieren.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Ermöglicht die Bewertung von Veränderungen der Kontraktilität als funktionellen Endpunkt in krankheitsrelevanten Systemen vor der Validierung in vivo.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch durch Korrelation molekularer Eingriffe mit der Modulation biophysikalischer Phänotypen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur Lead-Identifizierung ein und liefert biophysikalische Messgrößen, die Entscheidungen in der frühen Phase unterstützen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung der Auswirkungen der TGF-β-Signalübertragung auf zelluläre Mechanik und Kontraktilität.
- Screening: Ermöglicht die hochdurchsatzfähige, reproduzierbare Quantifizierung von Zugkräften über Multiwell-Formate hinweg für die Dosis-Wirkungs-Analyse.
- Analytik: Erzeugt Kontraktilitätskenngrößen (Kraftstärke, Verteilung), die den Vergleich verschiedener TGF-β-Konzentrationen und Expositionszeiten ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die in-vitro-Induktion eines EMT mit messbaren biomechanischen Veränderungen und unterstützt damit die Relevanz präklinischer Modelle.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Messung von Zugkräften, die auf verschiedene Zelltypen und Zielstrukturen der Mechanobiologie in Onkologie und Fibrose anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem die Uneindeutigkeit mechanobiologischer Phänotypen verringert wird.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit durch standardisierte PDMS-Substrate und Kompatibilität mit Mehrfach-Well-Platten.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitaleffizienz, indem parallele Bedingungstests ermöglicht und der Reagenzverbrauch pro Datenpunkt reduziert wird.
- Portfolio-Wirkung: Erleichtert die risikoadjustierte Priorisierung von Targets basierend auf quantitativen Kontraktilitätsverschiebungen während pathogener Übergänge.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Zellkultur, TFM-Bildanalyse und PDMS-Substratpräparation.
- Hängt von der Rheometrie zur Charakterisierung des Substrats und der Fluoreszenzmikroskopie zur Quantifizierung der Zugkräfte ab.
- Erfordert die Standardisierung der Aussaatdichte, Substratfunktionalisierung und Bildgebungsbedingungen über alle Wells hinweg.
- Die Anpassung an verschiedene Zelltypen kann eine Optimierung der Substratsteifigkeit und der Adhäsionsliganden erfordern.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Gleichmäßigkeit der Substratdicke und die mögliche Autofluoreszenz von PDMS bei bestimmten Wellenlängen.
