Hochdurchsatz-Traktionskraftmikroskopie mit PDMS zeigt dosisabhängige Effekte transformierender Wachstumsfaktoren auf den epitheliaal-mesenchymalen Übergang
June 1st, 2019
Wir präsentieren einen mit Silikonkautschuk (PDMS) hergestellten Assay mit hoher Durchsatz-Traktionskraft. Dieser neuartige Test eignet sich zur Untersuchung körperlicher Veränderungen der Zellkontraktilität während verschiedener biologischer und biomedizinischer Prozesse und Krankheiten. Wir demonstrieren den Nutzen dieser Methode, indem wir eine TGF--abhängige Erhöhung der Kontraktilität während des epitheliaal-mesenchymalen Übergangs messen.
Mein Labor interessiert sich für Mechanobiologie, die untersucht, wie Zellen sich ausüben und von mechanischen Kräften beeinflusst werden. Eine Möglichkeit, die Mechanobiologie zu quantifizieren, ist die Messung der Zellkontraktilität. In anhaftenden Zellen manifestiert sich Kontraktilität in Zugkräften, die auf das Zellsubstrat ausgeübt werden. Wir quantifizieren diese Kräfte anhand einer Methode, die allgemein als Traktionskraftmikroskopie oder TFM bezeichnet wird. Und TFM ist in einer Vielzahl von verschiedenen Methoden implementiert, aber ein gemeinsamer Aspekt ist, dass es eine ziemlich serielle und langsame Labortechnik ist, die typischerweise in einem einzigen Gericht wie diesem hier durchgeführt wird. Dies beschränkt uns auf die Bewertung einer Population oder eines Zustands zu einem Zeitpunkt. Überall in der Zellkultur wurde vor einiger Zeit verbessert, aber die Schaffung von Multiwell-Gerichte und wir dachten, wäre es nicht toll, es könnte wir TFM mit dem gleichen erhöhten Durchsatz und die gleiche Effizienz der Zeit und Reagenzien? Und das war unsere Lösung. Also haben wir eine 96-Well-Traktionskraftschale geschaffen. Und es sieht einem herkömmlichen 96-Well-Gewebe-Kulturgericht sehr ähnlich, aber mit diesem Gericht können wir nicht nur 96 verschiedene Zellkulturbedingungen untersuchen, sondern auch deren Zellkontraktilität quantifizieren. Dies stellt eine viel höhere Durchsatzlösung als Einzelschalenansätze dar, die es uns ermöglichen, verschiedene Zellbedingungen und kontraktile Reaktionen zu untersuchen. Während der Krebsmetastasierung wandern Krebszellen von ihrem primären Standort zu sekundären Standorten und verbreiten die Krankheit in unserem Körper. Dieses metastasierende Verhalten von Krebszellen macht 90% des krebsbedingten Todes aus. Einer der vorgeschlagenen Mechanismen für Epithelkrebszellen, um einen wandernderen und invasiveren Phänotyp zu erwerben, ist epithelial-mesenchymaler Übergang, EMT. Während der EMT werden sie wandernder und invasiver und verändern ihr körperliches Verhalten. Um diese Veränderungen im physikalischen Verhalten besser zu verstehen, nutzen wir unser weiches Siliziumsubstrat, um Veränderungen in der Kontraktilität von Maus-Brustdrüsenzellen mit EMT-Induktion durch TGF-In dieser Studie zu messen, untersuchten wir, wie unterschiedliche Konzentrationen und Inkubationszeit des physikalischen Verhaltens von TGF-beeinflussen. Polydimethylsiloxan ist ein sehr konformer Kautschuk mit dem niedrigsten Young-Modul von etwa 0,6 Kilopascal. Die Steifigkeit dieses Materials kann auch mit verschiedenen Konzentrationen von Vernetzen, einschließlich SYLGARD 184.To messen mechanische Eigenschaften von PDMS wir verwenden ein Rheometer. Nach dem Mischen von Teil A und Teil B des PDMS, in einem Eins-zu-Eins-Gewichtsverhältnis und Zugabe des Aushärtungsmittels mit dem angegebenen Gewichtsprozentsatz, laden Sie die vorbereitete Charge auf die Rheometerplatte. Achten Sie darauf, genügend probenweise zu laden, um den Spindelbereich vollständig abzudecken. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Spindel die Probe vollständig berührt, ohne freien Platz an der Kante. Jede zusätzliche Probe sollte sorgfältig getrimmt und von der Platte abgewischt werden. Messen Sie den Endspeichermodul und die Zeitabhängigkeit der Viskoelastizität jeder Probe, indem Sie Zeit- und Frequenzsweeps bei einem oszillatonigen Scherstamm von 0,5%Newsha durchführen]Diese Grafik ist ein Beispiel für den Zeit-Seq-Test, der das rheologische Verhalten von Polydimethylsiloxan mit angewendetem Oszillator-Scherstamm von 0,5% und einer Temperatur von 100 gemessen hat.
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Überblick
Diese Studie präsentiert einen Hochdurchsatz-Traktionskraft-Assay, der mit Silikonkautschuk (PDMS) hergestellt wurde und zur Untersuchung physikalischer Veränderungen der Zellkontraktilität während verschiedener biologischer Prozesse konzipiert ist. Die Nützlichkeit der Methode wird durch die Messung von TGF-β-abhängigen Zunahmen der Kontraktilität während des epithelialen-zu-mesenchymalen Übergangs demonstriert.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Zellbiologie
- Biomechanik
- Biomedizintechnik
Hintergrund
- Zellkontraktilität ist entscheidend für verschiedene biologische Prozesse.
- Das Verständnis von Kontraktilitätsänderungen kann Einblicke in Krankheiten liefern.
- Herkömmliche Methoden mangelt es möglicherweise an Durchsatz und Empfindlichkeit.
- PDMS ist ein vielseitiges Material zur Erstellung von Assays.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Hochdurchsatz-Assays zur Messung der Zellkontraktilität.
- Bewertung der Auswirkungen von TGF-β auf die Kontraktilität während des epithelialen-zu-mesenchymalen Übergangs.
- Bereitstellung einer zuverlässigen Methode zur Untersuchung des Zellverhaltens unter verschiedenen Bedingungen.
Verwendete Methoden
- Herstellung eines Traktionskraft-Assays mit PDMS.
- Messung der Zellkontraktilität als Reaktion auf TGF-β.
- Hochdurchsatz-Analyse zur Bewertung mehrerer Proben.
- Bewertung der Dynamik des epithelialen-zu-mesenchymalen Übergangs.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Messung von Kontraktilitätsänderungen in Zellen.
- Nachgewiesene TGF-β-abhängige Zunahmen der Kontraktilität.
- Validierung der Nützlichkeit des PDMS-basierten Assays.
- Einblicke in die Mechanik von Zellübergangsprozessen geliefert.
Schlussfolgerungen
- Der PDMS-Traktionskraft-Assay ist effektiv zur Untersuchung der Zellkontraktilität.
- Erhöhte Kontraktilität während des epithelialen-zu-mesenchymalen Übergangs wurde bestätigt.
- Diese Methode kann auf verschiedene biologische und biomedizinische Studien angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This high-throughput traction force microscopy platform enables quantitative assessment of cellular contractility in a scalable format, supporting mechanistic de-risking in early discovery. By linking TGF-β-induced epithelial-to-mesenchymal transition to measurable biophysical changes, the method provides predictive value for target validation in fibrosis and metastasis research. The PDMS-based system offers reproducibility and compatibility with existing multi-well workflows, enhancing enterprise reuse across discovery biology and assay development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of TGF-β as a modulator of cellular contractility during EMT, supporting target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides dose-dependent and time-resolved contractility data to prioritize mechanistic targets in fibrosis and cancer pathways.
- Predictive Value: Quantifies biophysical phenotypes linked to EMT, aiding in preclinical target selection and pathway de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, substrate-independent contractility measurements for assay standardization in mechanobiology screening.
- Operational Value: Compatible with 96-well formats, enabling parallel screening of compound libraries or cytokine doses.
- Assay Readiness: Uses stable, inert PDMS substrates with tunable modulus (0.4–100 kPa) and indefinite shelf life, reducing batch variability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links TGF-β dose and duration to contractile output, supporting biomarker-aligned preclinical models of EMT.
- Mechanistic De-risking: Enables evaluation of contractility changes as a functional readout in disease-relevant systems prior to in vivo validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by correlating molecular intervention with biophysical phenotype modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing biophysical readouts that inform early-phase decision-making.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of TGF-β signaling effects on cellular mechanics and contractility.
- Screening: Enables high-throughput, reproducible quantification of traction forces across multi-well formats for dose-response analysis.
- Analytics: Generates contractility metrics (force magnitude, distribution) that allow comparison of TGF-β concentrations and exposure times.
- Translational Research: Connects in vitro EMT induction to measurable biomechanical changes, supporting preclinical model relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable traction force platform applicable across cell types and mechanobiology targets in oncology and fibrosis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in mechanobiological phenotypes.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized PDMS substrates and multi-well compatibility.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling parallel condition testing and reducing reagent consumption per data point.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on quantitative contractility shifts during pathogenic transitions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, TFM image analysis, and PDMS substrate preparation.
- Depends on rheometry for substrate characterization and fluorescence microscopy for traction force quantification.
- Necessitates standardization of seeding density, substrate functionalization, and imaging conditions across wells.
- Adaptation to different cell types may require optimization of substrate stiffness and adhesion ligands.
- Practical limitations include substrate thickness uniformity and potential autofluorescence of PDMS at certain wavelengths.
