Chromatin Immunoprecipitation Assay mit Mikrokokken-Nukleasen in Säugetierzellen

In diesem Protokoll können wir die Wechselwirkungen zwischen Proteinen und DNA identifizieren und die transkriptionelle Regulation des Gens aufdecken. Dies hilft, die molekularen Mechanismen in den Zellen zu verstehen. Wir ändern die bereits vorhandenen Protokolle und erstellen dann ein einfaches und klareres Assay-Protokoll.

Sie folgen einfach dem Protokoll aus dem ersten Schritt, damit der Assay erfolgreich durchgeführt werden kann. Um vernetztes Chromatin in einer Dunstabzugshaube zuzubereiten, fügen Sie vier Milliliter 1%VCaP Zellkulturmedien und 0,229 Milliliter 18,5%PFA zu einem Sechs-Zentimeter-Fach hinzu. Mischen Sie die Schale vorsichtig, um die PFA gleichmäßig zu verteilen.

Bei Raumtemperatur genau 10 Minuten inkubieren. Dann 0,47 Milliliter 1,25-Molar-Glykollösung in die Schale geben und bei Raumtemperatur fünf Minuten lang brüten, um die weitere Vernetzung zu stoppen. Nach dem Waschen der Zellen nach dem Manuskript, kratzen Sie die Zellen und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr.

Zentrifugieren Sie das Rohr mit der Zellsuspension bei 3.000 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur, um das Zellpellet zurückzugewinnen. Verwenden Sie eine Pipette, um die PBS vollständig zu entfernen. Zeichnen Sie die Zellenzahl pro Tube auf, und speichern Sie das Zellpellet bei minus 80 Grad Celsius.

Um eine Zelllyse durchzuführen, tauen Sie zunächst die gespeicherten VCaP-Zellpellets auf Eis auf. Fügen Sie 300 Mikroliter des vorbereiteten ChIP-Zelllysepuffers, ergänzt mit PIC, in jedes Rohr ein, und setzen Sie das Pellet gründlich wieder auf. Wirbeln Sie die Röhre für 15 Sekunden, und inkubieren Sie die Suspension auf Eis für 10 Minuten.

Zentrifuge bei 9.000 mal g für drei Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand vollständig, und fügen Sie 300 Mikroliter MNase Verdauungspuffer hinzu, um das Pellet wieder auszusetzen. MNase mit MNase-Verdauungspuffer in einem 1,5-Milliliter-Rohr verdünnen, um 50 Geleinheiten pro Mikroliter zu ergeben.

Fügen Sie die verdünnte MNase in die Suspension und brüten Bei 37 Grad Celsius für genau 10 Minuten. Stellen Sie das Mischen durch Inversion alle 2 1/2 Minuten ein. Um die MNase-Verdauung zu beenden, fügen Sie 30 Mikroliter 0,5-Molar EDTA bei pH 8 hinzu und wirbeln Sie kurz.

Nach der Inkubation für fünf Minuten auf Eis zentrifugieren Sie bei 9.000 mal g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand vollständig, und setzen Sie das Pellet in 300 Mikroliter des vorbereiteten ChIP-Verdünnungspuffers, ergänzt mit PIC, wieder auf. Dann, auf einem Beschallungsgerät mit einer Mikrospitzensonde ausgestattet, stellen Sie die Beschallungsbedingungen auf Amplitude zwei, verarbeitete Zeit 15 Sekunden, Puls ON fünf Sekunden und Puls OFF 30 Sekunden.

Sonicate die Suspension auf Eis. Zeichnen Sie einen Mikroliter der Suspension und erkennen Sie auf ein Gleitglas. Beobachten Sie unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellstruktur fast gebrochen ist.

Zentrifugieren Sie das Rohr bei 9.000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. 20 Mikroliter des verdauten Chromatins in einem 1,5-Milliliter-Schraubrohr zur weiteren Behandlung einsparen und den Rest bei minus 80 Grad Celsius lagern. Zunächst, in jedem 1,5-Milliliter-Schraubrohr, fügen Sie 75 Mikroliter Wasser, vier Mikroliter fünf-Molar-Natriumchlorid, und ein Mikroliter Proteinase K.To Vernetzung zwischen Protein und DNA zu entfernen, fügen Sie 20 Mikroliter verdautem Chromatin aus jedem MNase Verdauungszustand zu einem Schraubrohr.

Schließen Sie die Kappe fest, mischen Sie sie vollständig und bebrüten Sie die Röhre über Nacht bei 65 Grad Celsius. Am Morgen, nach zentrifugieren der Röhre bei zwei bis 3.000 mal g für ein paar Sekunden, fügen Sie 100 Mikroliter PCI. Wirbel kräftig zu einer Emulsion zu bilden.

Zentrifugieren Sie das Rohr bei Raumtemperatur 30 Sekunden lang wieder mit maximaler Geschwindigkeit. Bereiten Sie dann zwei 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pro Zustand vor. Fügen Sie 100 Mikroliter PCI in eine Röhre.

Fügen Sie 10 Mikroliter dreimolares Natriumacetat bei pH 5,2 und zwei Mikroliter Glykogen in eine andere Röhre. Aus dem Rohr aus der Zentrifuge entnommen, ziehen Sie sorgfältig die obere Phase mit DNA, und fügen Sie es in die Röhre mit PCI. Vortex kräftig, und Zentrifugieren Sie das Rohr mit maximaler Geschwindigkeit für 30 Sekunden bei Raumtemperatur.

Als nächstes übertragen Sie die obere Phase auf die Zuvor hergestellte Röhre mit Natriumacetat und Glykogen. 250 Mikroliter Ethanol hinzufügen und durch Inversion mischen. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Zentrifugieren Sie das Rohr mit maximaler Geschwindigkeit für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Bestätigen Sie die Pellets auf der Unterseite des Rohres. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, um das Pellet nicht zu stören, und fügen Sie 500 Mikroliter 70% Ethanol hinzu.

Zentrifugieren Sie das Rohr mit maximaler Geschwindigkeit für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand vollständig, und trocknen Sie das Pellet für etwa fünf Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie dann 20 Mikroliter TE hinzu, um das Pellet aufzulösen.

Messen Sie die DNA-Konzentration mit einem UV-Spektralphotometer. Nach der Herstellung von verdautem Chromatin alle Proben auf Eis auftauen. Fügen Sie 1200 Mikroliter des vorbereiteten ChIP-Verdünnungspuffers hinzu, der mit PIC ergänzt wird, um verdautes Chromatin in die Konzentration von fünf Mikrogramm pro 500 Mikroliter zu verdünnen.

Fünf Mikroliter des verdünnten Chromatins zu einem 1,5-Milliliter-Schraubrohr als Eingangsprobe geben. Bewahren Sie die Probe bei minus 80 Grad Celsius auf. Fügen Sie 500 Mikroliter des verdünnten Chromatins zu einem 1,5-Milliliter-Schraubenrohr als Immunpräzipitationsprobe hinzu.

Fügen Sie zwei Mikrogramm Antikörper zu jeder Röhre hinzu, und schließen Sie die Kappe. Die Rohre über Nacht bei vier Grad Celsius mit sanftem Mischen auf einer Schaukelplattform bebrüten. Am Morgen 30 Mikroliter ChIP-Grade-Protein G-Magnetperlen in jede Röhre geben.

Die Rohre zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius mit sanftem Mischen wieder bebrüten. Danach drehen Sie das Rohr kurz bei zwei bis 3 000 mal g herunter und legen Sie das Rohr eine Minute lang in ein Polyethylen-Rack mit Neodym-Magneten. Entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand durch Aspiration.

Als nächstes fügen Sie 0,5 Milliliter salzarmen Immunkomplex-Waschpuffer zu jeder Röhre hinzu. Kurz wirbeln Sie die Röhre, um die Perlen zu zerstreuen. Inkubieren Sie die Röhre bei vier Grad Celsius für fünf Minuten mit sanftem Mischen auf einer Schaukelplattform.

Wiederholen Sie die Wäsche mit hochsalzigen Immunkomplex und Lithiumchlorid-Immunkomplex nach dem Manuskript. Nachdem Sie den verbleibenden Überstand vollständig entfernt haben, fügen Sie 150 Mikroliter Elutionspuffer in das Rohr ein. Wirbel nieren Sie die Röhre, um die Perlen vollständig zu zerstreuen.

Schließen Sie die Kappe, und bebrüten Sie die Röhre bei 65 Grad Celsius für 30 Minuten. Um die Perlen gründlich zu zerstreuen, mischen Sie durch Umkehrung alle fünf Minuten. Während der Inkubation ein 1,5-Milliliter-Schraubrohr vorbereiten und sechs Mikroliter fünfmolares Natriumchlorid und zwei Mikroliter Proteinase K.Thaw die zuvor auf Eis zubereitete 1%-Eingangsprobe hinzufügen.

Fügen Sie 150 Mikroliter Elutionspuffer, sechs Mikroliter fünfmolares Natriumchlorid und zwei Mikroliter Proteinase K in die Eingangsprobe ein. Nach der Inkubation der Röhre mit Perlen, spinnen. Legen Sie das Rohr für eine Minute in ein magnetisches Rack und übertragen Sie den Überstand auf das Schraubrohr, das Natriumchlorid und Proteinase K.Representative Mikrofotos vernetzter Zellpellets vor und nach der Beschallung enthält, zeigen deutliche Unterschiede.

Ohne Beschallung bleibt die Zellstruktur intakt, was darauf hinweist, dass das Chromatin in den Kernen vorhanden ist. Eine kurze Beschallung bricht die Zellstruktur. Vernetztes Chromatin wurde aus VCaP-Zellen hergestellt und mit verschiedenen Mengen MNase verdaut.

Ohne MNase wurde ein Abstrichmuster mit einem sehr hohen Molekulargewicht angezeigt. Die Zugabe von MNase gab ein Leitermuster, das zeigt, dass MNase Internukleosom verdaut. Nur der Zustand, der Chromatinfragmente bis zu 900 bp produzierte, kann als ordnungsgemäße Verdauung angesehen werden, während ein unangemessenes Verdauungsmuster eine Überverdauung zeigt, die hauptsächlich zu einer Mononukleosomproduktion führte.

Verdauungsmuster von Chromatin in VCaP-Zellen zeigen eine ordnungsgemäße Verdauung von Chromatin. Die höchste Belegung von H3K4methyl3 wurde um 0,5 Kilobase und eine Kilobasis vor dem AR-TSS beobachtet. Regionen mit 19 Kilobase und acht kb vor und 12 Kilobase flussabwärts von AR-TSS hatten jedoch nur eine geringe Auslastung von H3K4methyl3, was darauf hindeutet, dass diese als negative Regionen genutzt werden können.

Die Bestimmung des Verdauungszustands der MNase ist von größter Bedeutung. Bewahren Sie die Zellzahl, das Puffervolumen und die Enzymmenge in jedem Experiment auf. Die Bedingung muss für jeden Zelltyp identifiziert werden.

Wir können eine ChIP-Sequenzierung für die globale Belegung der Faktoren und Chromatin-Konformationsaufnahmen durchführen, um die Wechselwirkungen zwischen distalen genomischen Läsionen zu bestimmen. Diese Methode könnte Prozessmechanismen der Transkription aufdecken. ChIP-Assay ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Transkriptionsregulierung, aber es ist umständlich und nicht reproduzierbar.

Unsere Methode ermutigt Forscher, den Test routinemäßig und einfach durchzuführen.