Ionenaustausch-Chromatographie (IEX) gekoppelt an Multiwinkel Lichtstreuung (MALS) für Protein Trennung und Charakterisierung

Dieses Protokoll stellt Ionenaustausch-MALs vor, eine neuartige Methode zur Kontrolle und Charakterisierung der Proteinqualität, qualitätskontrolle, die für die Konsistenz und Integrität der Ergebnisse in der biowissenschaftlichen Forschung und pharmazeutischen Produktentwicklung unerlässlich ist. Ionenaustausch MALS bestimmt Proteinreinheit, OligomereZustand, Homogenität, Identität, Konformation, Struktur, Post-Translation-Modifikationen und andere Eigenschaften. Die Messungen sind zerstörungsfrei und werden in Lösung unter nahezu physiologischen Pufferbedingungen durchgeführt.

Diese Methode bestimmt genau die Molmasse von Proteinen oder Peptiden, den oligomeren Zustand und den Konjugationsgrad, zum Beispiel Glykoproteine. Es kann auch auf Membranproteine angewendet werden. IEX trennt Makromoleküle durch ihre Oberflächenladung.

Anionenaustausch, AIEX und Kationenaustausch, CIEX, Matrizen binden negativ bzw. positiv geladene Varianten. Mit einer feinen Trennung zwischen Proteinpopulationen, die eine relativ enge Masse oder Form haben, ermittelt IEX-MALS erfolgreich die Molmasse jedes einzelnen Proteinzustandes in einer Gemischprobe. Verwenden Sie zunächst einen 0,1-Mikrometer-Filter, um alle Reagenzien, einschließlich der Wasch- und Elutionspuffer, zu filtern.

Filtern Sie die ersten 50 bis 100 Milliliter Puffer in eine Abfallflasche, um Partikel aus den Trockenfiltern zu entfernen. In einer sauberen, sterilen Flasche, die gründlich mit gefiltertem Wasser gewaschen und verkappt wurde, um das Eindringen von Staub zu verhindern, filtern Sie den Rest des Puffers. Mit pH-acht Tris Puffer und 50-Millimolar-Natriumchlorid, verdünnen Sie eine BSA-Probe auf sechs Milligramm pro Milliliter, so dass der pH-Wert und die Ionenstärke die Bindung an die Ionenaustauschsäule ermöglichen.

Verwenden Sie eine Spritze, um mindestens 0,3 bis 0,5 Milligramm BSA in eine Ein-Milliliter-Säule zu injizieren, um eine hochwertige MALS-Analyse zu erreichen. Öffnen Sie zum Starten eines MalS-Experiments mit Ionenaustausch neu, "Experimentieren aus Methode" in der MALS-Software, und wählen Sie die Online-Methode aus dem Ordner Light Scattering-Systemmethoden aus. Wenn das DLS-Modul verfügbar ist und DLS-Daten erfasst werden sollen, wählen Sie die Online-Methode aus dem Unterordner Lichtstreuung, Mit QELS aus.

Um die Parameter festzulegen, legen Sie unter dem Abschnitt Konfiguration zunächst die Durchflussrate des Durchlaufs im Abschnitt Generische Pumpe auf die im FPLC verwendete Durchflussrate von 1,5 Milliliter pro Minute fest. Geben Sie unter dem Abschnitt Lösungsmittel die Pufferparameter ein oder überprüfen Sie sie. Geben Sie im Abschnitt Injektor den Proteinnamen als BSA, das Brechungsindexinkrement als 0,185 Milliliter pro Gramm und den UV-Aussterbekoeffizienten bei der Wellenlänge von 280 Nanometern als 0,66 Liter pro Gramm pro Zentimeter ein.

Geben Sie in der Registerkarte Probe die Konzentration der Proteinprobe mit sechs Milligramm pro Milliliter ein, und legen Sie dann das Probenvolumen für die Injektion ebenfalls als 170 Mikroliter ein. Wählen Sie im Abschnitt Prozeduren auf der Registerkarte Basissammlung das Kontrollkästchen Auslösen bei automatischer Injektion aus, und legen Sie die Dauer des Durchlaufs auf 70 Milliliter fest, sodass die Datenerfassung mindestens fünf Minuten lang fortgesetzt wird, nachdem der Gradient seinen endgültigen Wert erreicht hat. Erstellen Sie dann in der FPLC-Software ein neues Experiment auf der Registerkarte Methoden-Editor.

Erstellen Sie für das erste Experiment einen linearen Gradienten von Salz oder pH, während für die optimierte Methode ein spezifischerer Gradient oder ein stufenweises Programm gemäß dem Manuskript erstellt wird. Fügen Sie ein Impulssignal in die Methode ein, die die Datenerfassung in der MALS-Software auslöst. Öffnen Sie dann das Pumpenventil und waschen Sie es mit 0,5-Mol-Natriumhydroxid, um stark gebundene Verunreinigungen zu entfernen, gefolgt von einer Neutralisationspufferwäsche.

Dann waschen Sie die Säule mit Tris Puffer pH 8, das A-Ventil mit Waschpuffer und das B-Ventil mit Elutionspuffer. Verwenden Sie den Waschpuffer mit der niedrigen Salzkonzentration als Endwäsche, um die Säule zu spülen, um die Bindung des Proteins an die Säulenmatrix zu ermöglichen. Vor der Probeninjektion, nach dem Waschen und am Ende der Elution muss die lichtstreuende Grundlinie stabilisiert werden, um ein geringes Rauschen und eine völlig reine Verdünnung zu gewährleisten.

Legen Sie die Proteinprobe mit einer Spritze in die Schleife. Starten Sie das Experiment zuerst in der MALS-Software, indem Sie auf die Schaltfläche Ausführen und dann in der FPLC-Software klicken. Die Daten werden nach Empfang des Impulssignals vom FPLC-Instrument über den MALS-Detektor erfasst.

Wenn der Ionenaustausch MALS manuell mit einem kontinuierlichen Durchflussmodus anstelle einer eigenständigen Methode ausgeführt wird, wenden Sie dieselben Parameter der Ausführung und Anweisungen wie zuvor beschrieben an. Nachdem die endgültige Methode überprüft und ausgeführt wurde, führen Sie genau dieselbe Methode mithilfe einer leeren Injektion durch Laden des Puffers anstelle der Probe aus. Es ist wichtig, dass das Timing zwischen dem Auto-Injektionsimpuls und dem Gradienten des Leerlaufs mit dem des Probenlaufs identisch ist.

Um mit der Analyse zu beginnen, verwenden Sie unter dem Abschnitt Prozeduren in der MALS-Software die Registerkarte Despiking und den Normal-Pegel, um die Chromatogramme zu glätten. Wenn sie viel Lärm aufweisen, stellen Sie den Pegel auf Heavy ein. Definieren Sie in der Baseline-Ansicht die Basislinie für alle Signale, einschließlich LS-, UV- und RI-Detektoren.

Definieren Sie in der Ansicht "Spitzen" die Spitzen für die Analyse. Überprüfen Sie die korrekten Werte des RI-Inkrementwerts dn/dc und des UV-Aussterbekoeffizienten für das Protein unter jedem Peak. Analysieren Sie unter der Molar-Masse und dem Radius aus der Lichtstreuungsansicht die Molmasse und den Radius mit dem Zimm-Modell und dem Anpassungsgrad Null.

Wenn QELS verfügbar ist, beachten Sie unter der Rh aus QUELS-Ansicht Rh-Werte und die Qualität der Anpassung der Korrelationsfunktion. Das RI-Signal ändert sich während des Ionenaustausch-MALS-Laufs aufgrund der Erhöhung der Salzkonzentration signifikant. Um das Basissignal von der Leerinjektion zu subtrahieren, öffnen Sie sowohl die Protein- als auch die Leerionenaustausch-MALS-Experimente.

Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Proteinexperimentnamen, wählen Sie Methode anwenden aus, und wählen Sie den Ordner Baseline Subtraction aus dem Dateidialogfeld aus. Wählen Sie die Online-Methode für die standardmäßige Molarenmassenanalyse aus. Klicken Sie in der Ansicht Baseline Subtraction auf Leer importieren, um die Signale des Leerlaufs zu importieren.

Überprüfen Sie unter Instrumente alle Zusubtrahierenden Detektoren. Um das Ionenaustausch-MALS-System mit BSA-Monomer zu kalibrieren, richten Sie unter Prozeduren und Konfigurationsansicht die Spitzen aus. Geben Sie in der Normalisierungsansicht 3,0 Nanometer als Rg-Wert ein, um die Normalisierung durchzuführen.

Wählen Sie dann unter Bandverbreiterung in derselben Registerkarte Konfiguration die Spitze aus und verwenden Sie die Schaltfläche "Anpassung durchführen", um die UV- und LS-Signale an das RI-Signal anzupassen. Das Diagramm der Ergebnisse wird in der Ansicht Ergebnisanpassung angezeigt. Ändern Sie die Achsenskalen und andere Diagrammparameter, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Diagramm klicken, Bearbeiten auswählen und dann auf die Schaltfläche Erweitert klicken.

Um weitere Anzeigeoptionen zu erhalten, wählen Sie die Registerkarte EASI Graph aus, und wählen Sie oben im Fenster im Dropdown-Menü "Anzeige" Molar Mass oder Rh Q aus. Alle Ergebnisse, einschließlich Molmasse, Radius, Reinheitsgrad und andere, sind in der Berichtsansicht im Abschnitt Ergebnisse verfügbar. Verwenden Sie die Schaltfläche Berichts-Designer, um dem Bericht weitere Ergebnisse oder Parameter sowie Zahlen hinzuzufügen. In diesem Experiment wurde BSA an Ionenaustausch-MALS mit einer analytischen Anionenaustausch-Analysesäule analysiert.

Die Chromatogramme zeigten den UV bei 280 Nanometern, die Lichtstreuung in einem 90-Grad-Winkel, den Brechungsindex und die Leitfähigkeitskurven zusammen mit der Molmasse jedes Peaks. Ein breiter linearer Gradient, bestehend aus 30 Säulenvolumina von 75-Millimolar bis 350-Millimolar-Natriumchlorid, trennte BSA-Monomere von Dimern und höheren Oligomeren. Die nachgelagerte MALS-Analyse ergab eine berechnete Monomer-Molarenmasse von 66,8 Kilodaltonen und eine berechnete Dimer-Molarmasse von 130 Kilodaltonen.

Basierend auf der Pufferleitfähigkeit an den eluierten Peaks wurde der Gradient in ein anderes Programm geändert, einen langen Schritt von 175-Millimolar-Natriumchlorid, gefolgt von einem linearen Gradienten von 175-Millimolar zu 500-Millimolar-Natriumchlorid. Der neue Gradient verbesserte die Auflösung erheblich und führte zu einer ausgezeichneten Trennung zwischen BSA-Monomer und höheren oligomeren Arten. Ein stufenweises Programm von 200-Millimolar und 250-Millimolar-Natriumchlorid wurde angewendet, um sich auch auf die hocholigomeren Arten zu konzentrieren.

Es führte zu einer ausgezeichneten Trennung zwischen BSA-Monomer, Dimer und Trimer. Nach diesem Verfahren können Methoden wie Massenspektrometrie, SDS-PAGE-Aktivität und Stabilitätstests an jeder durch Ionenaustausch getrennten Variante durchgeführt werden, um jede Variante zu identifizieren und weiter zu charakterisieren. Wir fanden heraus, dass Ionenaustausch-MALS die Leistungsfähigkeit der MALS-Analyse auf Proben ausdehnt, die von SEC-MALS nicht vollständig analysiert werden können.

Trennung durch Ladung lösen verschiedene Arten, die in SEC coelute.