Name: Chromogene In-Situ-Hybridisierung ist ein Tool für hpV-bezogene Kopf- und Halskrebsdiagnose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Erfahren Sie, wie HPV RNA CISH aktive HPV-Infektionen in Tumorgewebe detektiert und visualisiert. Diese Methode ermöglicht präzise räumliche Auflösung und unterstützt die Diagnose HPV-assoziierter Kopf-Hals-Tumoren.

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Die Autoren danken der Abteilung für Pathologie von Hopital Européen Georges Pompidou und Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel und Giséle Legall); die Histologie-Plattform von PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre); Virginia Clark für Sprachbearbeitung; Alexandra Elbakyan für ihren Beitrag.

Das Protokoll folgt ethischen Richtlinien und wurde vom Ethikausschuss (Comité-de-Protection-des-Personnes Ile-de-France-II, #2015-09-04) gebilligt.
1. Herstellung der Materialien
<ol><li>
Vorbereitung des 1x Waschpuffers
	<ol>
<li>Bereiten Sie 3 L 1x Waschpuffer vor, indem Sie einem großen Carboy 2,94 l destilliertes Wasser und eine Flasche (60 ml) Waschpuffer (50x) (siehe Materialtabelle)hinzufügen. Gut mischen. HINWEIS: Der 1x Waschpuffer kann im Voraus vorbereitet und bei Raumtemperatur bis zu 1 Monat gelagert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Herstellung von Gegenfärbungsreagenzien
	<ol>
<li>50% Hämatoxylin vorbereiten.<ol>
<li>In einer Dunstabzugshaube 100 ml Gills Hämatoxylin I (siehe Materialtabelle)zu 100 ml destilliertem Wasser in einer Färbeschale geben. HINWEIS: Die 50% Hämatoxylin-Färbungslösung kann bis zu 1 Woche lang wiederverwendet werden.</li>
		</ol>
</li>
		<li>0,02% (w/v) Ammoniakwasser (bluing reagenz) vorbereiten.</li>
		<li>In der Dunstabzugshaube 1,43 ml 1 N Ammoniumhydroxid zu 250 ml destilliertem Wasser in einem abgestuften Zylinder oder einem anderen Behälter geben. Versiegeln Sie den Zylinder mit Paraffinfolie. Mischen Sie seinen Inhalt gut für 3x–5x. HINWEIS: Für die Assay-Quantifizierung ist es wichtig, Ammoniumhydroxid zu verwenden. Die Reagenzien können im Voraus hergestellt werden. Stellen Sie sicher, dass alle Container abgedeckt bleiben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung von 1x Ziel-Retrieval-Reagenz
	<ol>
<li>In einem großen Becherstück 70 ml 10x Zielabrufreagenz (siehe Materialtabelle)zu 630 ml destilliertem Wasser hinzufügen.</li>
		<li>Legen Sie das Becherglas mit einem Magnetrührer auf eine Heizplatte. Bedecken Sie es mit Aluminiumfolie.</li>
		<li>Den Inhalt bei 100 °C 10–15 min aufkochen. HINWEIS: Lassen Sie es nicht mehr als 30 min kochen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reagenz-Gleichgewicht
	<ol>
<li>Stellen Sie sicher, dass der Hybridisierungsofen eingeschaltet und bei 40 °C ist. Nassbefeuchtungspapier an der Unterseite des Fachs legen. HINWEIS: Für die Schritte 3.4 bis 4.2 wird ein Hybridisierungsofen (siehe Materialtabelle)benötigt.</li>
		<li>Entfernen Sie die Amplifikationsreagenzien (AMP1–AMP6, siehe Materialtabelle) aus dem Kühlschrank und halten Sie sie bei Raumtemperatur, mindestens 30 min vor dem entsprechenden Inkubationsschritt.</li>
		<li>Vor jedem Gebrauch die Ziel- und/oder Steuersonden mindestens 10 min bei 40 °C im Ofen oder in einem Wasserbad oder Inkubator erwärmen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Haftungsverbesserung und Deparaffinierung in der Dunstabzugshaube
HINWEIS: Starten Sie das Protokoll mit 3–5 m dicken histologischen Proben, die auf unbefleckten Dias montiert sind.
<ol><li>Um die Haftung zu verbessern, backen Sie die Dias bei 60 °C für 1 h oder bei 40 °C über Nacht im Ofen.</li>
	<li>Laden Sie das Diagestell mit ungefärbten histologischen Dias auf. Tauchen Sie das Schieberegal für 5 min in frisches Xylol in einer Färbeschale enthalten, mit gelegentlicher Erregung. mit frischem Xylol wiederholen.</li>
	<li>Tauchen Sie das Schieberegal für 3 min in frisches 100% Ethanol in einer Färbeschale enthalten, mit ständiger Rührung. Mit frischem 100% Ethanol wiederholen.</li>
	<li>Lassen Sie die Dias 2 min bei Raumtemperatur trocknen. HINWEIS: Verwenden Sie deparaffinisierungsreagenzien nicht zur Dehydrierung der Dias nach dem Test wieder.</li>
</ol>3. Gewebevorbehandlung
HINWEIS: Diese Schritte folgen der "Standard"-Vorbehandlungsempfehlung gemäß den Anweisungen des Herstellers für Kopf- und Nackenproben. Das Timing der Abschnitte 3.1 und 3.2 muss möglicherweise je nach manipuliertem Gewebe angepasst werden.
<ol><li>
Blockade der Peroxidase-Aktivität
	<ol>
<li>Fügen Sie jedem Dia 4–6 Tropfen Wasserstoffperoxid (siehe Materialtabelle)hinzu und inkubieren Sie sie 10 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Waschen Sie die Dias 2x für 2 min in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bruch von RNA/Gewebegrenzen
	<ol>
<li>Mit einer Kralle die Aluminiumfolie aus dem siedenden1x Ziel-Retrieval-Reagenz (TTR1x) aus Abschnitt 1.3 entfernen und das Rühren abbrechen. Tauchen Sie das Schiebegestell 15 min lang langsam und sehr vorsichtig ein. Bedecken Sie den Becher erneut mit der Aluminiumfolie. HINWEIS: Das Simmern muss während dieses Schritts bestehen bleiben. VORSICHT: Verwenden Sie die Kralle, um die Aluminiumfolie und das Schiebeträger zu manipulieren, um Brandverletzungen zu vermeiden. Achten Sie darauf, die richtige persönliche Schutzausrüstung wie Handschuhe und einen Labormantel zu tragen.</li>
		<li>Mit der Kralle das heiße Schieberegal sofort in ein destilliertes Wasserbad geben und 2 min waschen. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Proben im TTR1x nicht abkühlen.</li>
		<li>Waschen Sie die Rutschen in frischem 100% Ethanol für 2 min.</li>
		<li>Lassen Sie die Dias bei Raumtemperatur für 2 min trocknen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Barriere-Erstellung
	<ol>
<li>Mit einem hydrophoben Barrierestift (siehe Materialtabelle)ziehen Sie eine Barriere um die Probe. Lassen Sie es mindestens 5 min austrocknen. HINWEIS: Lassen Sie die Barriere wirklich austrocknen. Wenn es während des Eingriffs abnutzt, zögern Sie nicht, es wieder zu zeichnen. Vermeiden Sie es, das Gewebe mit dem Stift zu berühren. Das Protokoll kann hier über Nacht angehalten werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protease-Verdauung
	<ol>
<li>Legen Sie die Dias auf das Schiebegestell und fügen Sie pro Probe 4 Tropfen Protease Plus hinzu (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Bedecken Sie die Feuchtigkeitskontrollwanne mit einem Deckel und legen Sie es 30 min bei 40 °C in den Hybridisierungsofen ein. HINWEIS: Um Verdunstung zu verhindern, stellen Sie sicher, dass der Drehknopf vollständig in die Verriegelungsposition gedreht ist.</li>
		<li>Entfernen Sie das Fach aus dem Ofen und entfernen Sie das Schiebegestell.</li>
		<li>Eine Rutsche nach der anderen, schnell entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit und legen Sie die Rutsche in einem Schiebeträger in einer Färbeschale mit destilliertem Wasser gefüllt.</li>
		<li>Waschen Sie die Dias 2x für 2 min in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur. Rühren Sie ständig.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Ausführen des Assays
HINWEIS: Lassen Sie die Abschnitte zwischen den Inkubationsschritten nicht austrocknen.
<ol><li>
Hybridisierung der HPV-Sonde HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Sonden vorgewärmt sind, um alle Niederschläge vor der Verwendung aufzulösen. Für diesen Schritt kann anstelle der HPV-Sondeauch Peptidyl-Prolyl-Isomerase B (PPIB) zur Positivkontrolle oder Dihydrodipicolinat-Reduktase (DAPB) zur Negativkontrolle verwendet werden (siehe Materialtabelle).<ol>
<li>Tippen und/oder flicken Sie die Dias, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und legen Sie sie in das Schiebeträger. Fügen Sie 4 Tropfen HPV-Sonde hinzu, um jeden Abschnitt vollständig abzudecken.</li>
		<li>Bedecken Sie das Fach mit einem Deckel und legen Sie es für 2 h bei 40 °Cin den Ofen ein. HINWEIS: Um Verdunstung zu verhindern, stellen Sie sicher, dass der Dreh-Nob vollständig in die Verriegelungsposition gedreht ist.</li>
		<li>Entfernen Sie das Fach aus dem Ofen und entfernen Sie das Schiebegestell.</li>
		<li>Eine Folie nach der anderen, schnell entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit und legen Sie die Rutsche in einem Schiebeträger in einer Färbeschale mit 1x Waschpuffer gefüllt.</li>
		<li>Waschen Sie die Dias in 1x Waschpuffer für 2 min bei Raumtemperatur mit konstanter Rührung. Wiederholen Sie dies mit einem frischen 1x Waschpuffer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hybridisierung von AMP1, AMP2, AMP3 und AMP4 HINWEIS: Zu diesen Schritten gehören die Hybridisierung im Hybridisierungsofen und AMP1-AMP4 aus dem gekauften Kit (siehe Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Tippen und/oder flicken, um überschüssige Flüssigkeit aus den Dias zu entfernen und in das Schiebegestell zu legen. Fügen Sie 4 Tropfen AMP1 hinzu, um jeden Abschnitt vollständig abzudecken.</li>
		<li>Bedecken Sie das Fach mit einem Deckel und legen Sie es 30 min bei 40 °Cin den Ofen.</li>
		<li>Entfernen Sie das Fach aus dem Ofen und entfernen Sie das Schiebegestell.</li>
		<li>Eine Folie nach der anderen, schnell entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit und legen Sie die Rutsche in einem Schiebeträger in einer Färbeschale mit 1x Waschpuffer gefüllt.</li>
		<li>Waschen Sie die Dias in 1x Waschpuffer für 2 min bei Raumtemperatur mit konstanter Rührung. Wiederholen Sie dies mit einem frischen 1x Waschpuffer.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.2.1–4.2.5, aber verwenden Sie 4 Tropfen AMP2 anstelle von AMP1 und brüten Sie 15 min bei 40 °C. Waschen Sie die Dias 2x für 2 min, beide Male in frischem Waschpuffer.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.2.1–4.2.5, aber verwenden Sie 4 Tropfen AMP3 anstelle von AMP1 und brüten Sie 30 min bei 40 °C. Waschen Sie die Dias 2x für 2 min, beide Male in frischem Waschpuffer.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.2.1–4.2.5, aber verwenden Sie 4 Tropfen AMP4 anstelle von AMP1 und brüten Sie 15 min bei 40 °C. Waschen Sie die Dias 2x für 2 min, beide Male in frischem Waschpuffer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hybridisierung von AMP5 und AMP6 HINWEIS: Diese Schritte beinhalten keine Hybridisierung im Ofen, sondern Hybridisierung bei Raumtemperatur. AMP5 und AMP6 stammen aus dem gekauften Kit (siehe Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Tippen und/oder flicken Sie die Dias, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und legen Sie sie in das Schiebeträger. Fügen Sie 4 Tropfen AMP5 hinzu, um jeden Abschnitt vollständig abzudecken.</li>
		<li>Bedecken Sie das Tablett mit einem Deckel und brüten Sie für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Eine Folie nach der anderen, schnell entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit und legen Sie es in einem Schieberegal in einer Färbeschale mit 1x Waschpuffer gefüllt.</li>
		<li>Waschen Sie die Dias in 1x Waschpuffer für 2 min bei Raumtemperatur mit konstanter Rührung. Wiederholen Sie dies mit einem frischen 1x Waschpuffer.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.3.1–4.3.4, aber verwenden Sie 4 Tropfen AMP6 anstelle von AMP5 und brüten Sie 15 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Dias 2x für 2 min, beide Male in frischem Waschpuffer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Signaldetektion mit 3,3'-Diaminobenzidin
VORSICHT: Diaminobenzidin (DAB) ist giftig. Befolgen Sie geeignete Vorsichtsmaßnahmen und Sicherheitsrichtlinien bei der Entsorgung und Handhabung dieser Chemikalie.
<ol><li>Mischen Sie gleiche Volumina von DAB-A und DAB-B (siehe Materialtabelle) in einem Rohr in angemessener Größe, indem Sie die gleiche Anzahl von Tropfen jeder Lösung austeilen. Machen Sie pro Abschnitt 120 L DAB-Substrat (2 Tropfen pro Reagenz/Gesamtmenge von 4). Mischen Sie es gut für 3x–5x.</li>
	<li>Nehmen Sie jede Folie nacheinander aus dem Schiebeträger und tippen sie und/oder flicken Sie, um die überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, bevor Sie sie in das Schiebeträger legen.</li>
	<li>Pipette 120 L DAB auf jeden Gewebeabschnitt. Stellen Sie sicher, dass die Abschnitte abgedeckt sind, und brüten Sie für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entsorgen Sie den verbleibenden DAB gemäß der örtlichen Regelung und legen Sie die Rutsche in ein Schieberegal ein, das in eine mit Leitungswasser gefüllte Färbeschale getaucht ist.</li>
</ol>6. Gegenfärbung
<ol><li>Bewegen Sie das Schiebegestell in eine Färbeschale mit 50% Hämatoxylin-Färbungslösung und lassen Sie es 30 s bei Raumtemperatur ruhen. Beachten Sie, dass die Folien violett werden.</li>
	<li>Übertragen Sie das Schieberegal sofort zurück auf eine Färbeschale mit Leitungswasser und waschen Sie die Dias 3x–5x, indem Sie das Rack nach oben und unten bewegen.</li>
	<li>Wiederholen Sie den Waschschritt mit frischem Leitungswasser, bis die Rutschen frei sind, während die Abschnitte violett bleiben.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Leitungswasser in der Färbeschale durch 0,02% Ammoniakwasser. Bewegen Sie das Rack 2x–3x nach oben und unten. Beachten Sie, dass der Gewebeabschnitt blau werden sollte.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Ammoniakwasser durch Leitungswasser. Waschen Sie die Dias 3x–5x.</li>
</ol>7. Dehydrierung
<ol><li>Bewegen Sie das Schiebegestell in eine Färbeschale mit 70% Ethanol in der Dunstabzugshaube und lassen Sie es 2 min bei gelegentlicher Rührung ruhen.</li>
	<li>Bewegen Sie das Schiebegestell zu einer ersten Färbeschale, die 100% Ethanol enthält, und lassen Sie es 2 min bei gelegentlicher Rührung ruhen.</li>
	<li>Bewegen Sie das Schiebegestell in eine zweite Färbeschale mit 100% Ethanol und lassen Sie es 2 min bei gelegentlicher Rührung ruhen.</li>
	<li>Bewegen Sie das Schiebegestell in eine Färbeschale, die Xylol enthält, und lassen Sie es 5 min bei gelegentlicher Rührung ruhen.</li>
</ol>8. Schiebemontage
<ol><li>Entfernen Sie die Dias aus dem Schiebeträger und legen Sie sie flach mit den Abschnitten nach oben in der Dunstabzugshaube.</li>
	<li>Montieren Sie jeweils einen Schlitten nach dem anderen, indem Sie jedem Schieberegler 1 Tropfen eines Xylol-basierten Montagemediums hinzufügen und einen 24 mm x 50 mm Abdeckungsslip sorgfältig über den Querschnitt legen. Vermeiden Sie es, Luftblasen einzufangen.</li>
	<li>Die Rutschen werden für 5 min lufttrocknend.</li>
</ol>9. Stichprobenbewertung
<ol><li>Untersuchen Sie die Gewebeabschnitte unter einem Standard-Hellfeldmikroskop mit 20x-40-facher Vergrößerung.</li>
</ol>

<ol><li>Lowy, D. R., Schiller, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+HPV-associated+cancer+globally%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Prevention+Research.%28Philadelphia%2C+PA%29%22%5BJournal%5D)">Reducing HPV-associated cancer globally.</a> Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).</li>
<li>Laban, S., Hoffmann, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Papillomavirus+Immunity+in+Oropharyngeal+Cancer%3A+Time+to+Change+the+Game%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game?</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).</li>
<li>Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+intact+HPV16+E6%2FE7+gene+expression+in+head+and+neck+cancers+with+unaltered+p53+status+and+perturbed+pRb+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control.</a> Oncogene. 21 (10), 1510-1517 (2002).</li>
<li>Ndiaye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPV+DNA%2C+E6%2FE7+mRNA%2C+and+p16INK4a+detection+in+head+and+neck+cancers%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Oncology. 15 (12), 1319-1331 (2014).</li>
<li>Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HR-HPV+E6%2FE7+mRNA+In+Situ+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 41 (5), 607-615 (2017).</li>
<li>Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+chromogenic+in+situ+hybridization+assay+with+clinical+automated+platform+is+a+sensitive+method+in+detecting+high-risk+human+papillomavirus+in+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma.</a> Human Pathology. 63, 184-189 (2017).</li>
<li>Mirghani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+HPV+driven+oropharyngeal+cancers%3A+Comparing+p16+based+algorithms+with+the+RNAscope+HPV-test%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test.</a> Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Papillomavirus+Testing+in+Head+and+Neck+Carcinomas%3A+Guideline+From+the+College+of+American+Pathologists%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (5), 559-597 (2018).</li>
<li>Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPV+E6%2FE7+mRNA+In+Situ+Hybridization+in+the+Diagnosis+of+Cervical+Low-grade+Squamous+Intraepithelial+Lesions+%28LSIL%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL).</a> The American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 192-200 (2018).</li>
<li>El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEl-Naggar%2C+A+%22WHO+Classification+of+Head+and+Neck+Tumours%22">WHO Classification of Head and Neck Tumours</a>. , International Agency for Research on Cancer. Lyon, France. (2017).</li>
<li>Ang, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+papillomavirus+and+survival+of+patients+with+oropharyngeal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (1), 24-35 (2010).</li>
<li>Badoual, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1-expressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+HPV-associated+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer.</a> Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).</li>
<li>Outh-Gauer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunotherapy+in+head+and+neck+cancers%3A+a+new+challenge+for+immunologists%2C+pathologists+and+clinicians%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treatment+Reviews%22%5BJournal%5D)">Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians.</a> Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).</li>
<li>Mirghani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+HPV-driven+head+and+neck+cancer+with+a+single+test+in+routine+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice.</a> Modern Pathology. 28 (12), 1518-1527 (2015).</li>
<li>Bishop, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Transcriptionally+Active+High-risk+HPV+in+Patients+With+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+as+Visualized+by+a+Novel+E6%2FE7+mRNA+In+Situ+Hybridization+Method%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1874-1882 (2012).</li>
<li>Hsieh, M. -S., Lee, Y. -H., Jin, Y. -T., Huang, W. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+SOX10+expression+in+human+papillomavirus-related+multiphenotypic+sinonasal+carcinoma%3A+report+of+6+new+cases+validated+by+high-risk+human+papillomavirus+mRNA+in+situ+hybridization+test%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test.</a> Human Pathology. 82, 264-272 (2018).</li>
<li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Prognostic+Value+of+HPV16+E6+mRNA+Compared+With+In+Situ+Hybridization+for+Human+Oropharyngeal+Squamous+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (36), 6213-6221 (2009).</li>
<li>Kuo, K. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biomarkers+of+human+papillomavirus+infection+in+tonsillar+squamous+cell+carcinoma%E2%80%94molecular+basis+and+predicting+favorable+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma—molecular basis and predicting favorable outcome.</a> Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).</li>
<li>Augustin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+efficacy+of+the+four+tests+%28p16+immunochemistry%2C+PCR%2C+DNA+and+RNA+In+situ+Hybridization%29+to+evaluate+a+Human+Papillomavirus+infection+in+head+and+neck+cancers%3A+a+cohort+of+348+French+squamous+cell+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas.</a> Human Pathology. , (2018).</li>
<li>Jung, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+clinical+relevance+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+%28HPV%29+infection+in+oropharynx+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma.</a> International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).</li>
<li>Augustin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPV+RNA+CISH+score+identifies+two+prognostic+groups+in+a+p16+positive+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma+population%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population.</a> Modern Pathology. , (2018).</li>
<li>Evans, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPV+E6%2FE7+RNA+In+Situ+Hybridization+Signal+Patterns+as+Biomarkers+of+Three-Tier+Cervical+Intraepithelial+Neoplasia+Grade%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade.</a> PLOS ONE. 9 (3), e91142(2014).</li>
<li>Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+HPV+infection+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%3A+a+practical+proposal%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv%22%5BJournal%5D)">Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal.</a> Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).</li>
<li>Bingham, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope+in+situ+hybridization+confirms+mRNA+integrity+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+cancer+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples.</a> Oncotarget. , (2017).</li>
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CB: Boards, Seminare: MSD, BMS, Astrazeneca, Roche

HPV RNA CISH, das mit einem gekauften Kit durchgeführt wird, ist ein leistungsstarkes Werkzeug für den Nachweis viraler Transkripte und weist auf eine aktive HPV-Infektion hin. Manuell ausgeführt, sind die Schritte des Protokolls insgesamt einfach zu befolgen, und das gekaufte Kit ist bequem. Diese Technik ermöglicht die Färbung von 19 histologischen Proben plus einem Steuerschlitten auf einmal, und der Test dauert etwa 8 h. Es ist wichtig, die Proben nicht zwischen den Stufen austrocknen zu lassen, sofern nicht anders a...

HPV RNA CISH ist ein leistungsfähiges Werkzeug zum Nachweis einer aktiven HPV-Infektion, die sich bei gutartigen oder bösartigen Läsionen an verschiedenen Orten wie dem Oropharynx oder dem Gebärmutterhals als entscheidend erweisen kann. Der Nachweis einer aktiven HPV-Infektion kann die Diagnose einer HPV-induzierten Läsion unterstützen und dadurch ihre Behandlung und Prognose beeinflussen.
HPV ist die häufigste sexuell übertragbare Infektion, und über 100 virale Genotypen wurden beschrieben1. Schematisch sind genotyparme Genotypen wie die Genotypen 6 und 11 dafür bekannt, Genitalwarzen, rezidivierende Atmungspapillomatose und andere gutartige Läsionen zu induzieren, während Hochrisiko-Genotypen wie die Genotypen 16 und auch 18 für die meisten Gebärmutterhalskrebserkrankungen verantwortlich sind. und Analkrebs und spielen eine Rolle bei der HNSCC-Onkogenese in variablen Anteilen, wie sie in den regionalen epidemiologischen Daten2berücksichtigt werden.
Für den Nachweis von HPV-Infektionen stehen mehrere Tools zur Verfügung. Da eine HPV-Infektion mit hohem Risiko zur Expression der viralen onkogenen Proteine E6 und E73führt, wird der Nachweis von E6- und E7-Transkripten weithin als Goldstandard für die aktive HPV-Infektionsidentifikationangesehen 4. HPV RNA CISH kann an FFPE-Proben durchgeführt werden, die ganz einfach von Patienten mit verschiedenen HPV-bedingten Erkrankungen gewonnen werden können. Seine Leistung wurde bei der plattenepitheliale Neoplasie im Gebärmutterhals, im Anus und in der Vagina sowie bei invasivem Plattenepithelkarzinom im Gebärmutterhals,anus und im oberen aerodigestiven Trakt 5 bewertet: es erreicht eine Empfindlichkeit von über 98% HPV DNA-Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-positive Fälle. Dies ist etwas besser als p16 Immunostaining (93%) und HPV-DNA-In-situ-Hybridisierung (DNA ISH: 97%), die häufiger verwendet werden. In einer anderen Kohorte von 57 Patienten mit Plattenepithelkarzinom (SCC) aus dem Kopf- und Nackenbereich, dem Genitalbereich, der Haut und den Harnwegen erreichte HPV RNA CISH eine bessere Empfindlichkeit (100% versus 88%) Spezifität (87% versus 74%)6.
P16 Immunostaining ist ein indirekter Marker, der eine Unterbrechung des Zellzyklus widerspiegelt, die (aber nicht ausschließlich) durch hpV-Infektionen verursacht werden kann4,7. Dieser kostengünstige Test besitzt eine gute Empfindlichkeit und einen negativen Vorhersagewert und wird als Ersatzmarker für eine hochriskante HPV-Infektion bei Oropharynxkrebs (OPC) vom College of American Pathologists (CAP) und von der Union for International empfohlen. Krebsbekämpfung (UICC)8.
Obwohl sich dieses Papier ausschließlich auf den Nachweis von HPV in HNSCC konzentriert, ist HPV RNA CISH klinisch relevant unter verschiedenen anderen Bedingungen, die eine HPV-Infektion beinhalten. Zum Beispiel kann diese Technik die Genauigkeit der Diagnose von niedriggradigen plattenförmigen intraepithelialen Läsionen des Gebärmutterhalses (LSIL, früher bekannt als zervikale intraepitheliale Neoplasie, Grad 1 [CIN1]) für morphologisch mehrdeutige Fälleverbessern 9. In Bezug auf oropharyngeale SCC ermöglicht HPV RNA CISH die Identifizierung von HPV-bezogenem SCC, das in der jüngsten achten Ausgabe der TNM-Klassifikation von Kopf- und Halskrebs (der Union für internationalen Krebs) als von HPV-unabhängigem oropharyngealem SCC bezeichnet wird. Steuerung [UICC])10. Da HPV-bezogenes SCC eine bessere Prognose mit längerem Überleben und verbesserter Strahlentherapie und Chemotherapie-Empfindlichkeit aufweist als HPV-unabhängige SCC11,12,13, kann der Nachweis einer HPV-Infektion Patientenmanagement14,15. Außerdem kann HPV RNA CISH zur Diagnose von HPV-bezogenem multiphänotypischem sinonasatypischem Karzinom mit einem höheren Signal als HPV DNA CISH16verwendet werden. Mehrere multivariate Analysen deuten darauf hin, dass der Nachweis von E6- und E7-Transkripten mit einerbesseren Prognose bei oropharyngealen SCC insgesamt 7,15,17,18 und Untergruppe p16-positiver oropharyngealer SCC19,20.
Hier stellen wir Ihnen das Protokoll für manuelle HPV RNA CISH vor, das auf FFPE-Dias mit einem vom Hersteller erhaltenen Kit durchgeführt wird.

<table><tbody><tr><td>Hämatoxylinlösung, Gill Nr. 1</td><td>Merck</td><td>GHS132</td><td></td></tr><tr><td>HybEZ Ofen (110 V)</td><td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td><td>321710</td><td></td></tr><tr><td>HybEZ Objektträgergestell</td><td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td><td></td><td></td>300104</tr><tr><td>ImmEdge Hydrophober Barrierestift</td><td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td><td></td><td></td>310018</tr><tr><td>RNAscope 2.5 HD-Detektionsreagenzien-BROWN</td><td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td><td>322310</td><td>Dieses Kit enthält die Amplifikationsreagenzien AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 und AMP6 sowie die Detektionsreagenzien DAB-A und DAB-B</td></tr><tr><td>RNAscope 3-Plex Negative Control Probe</td><td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td><td>320871</td><td>DAPB</td></tr><tr><td>RNAscope 3-Plex Positivkontrollsonde</td><td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td><td>320861</td><td>PPIB</td></tr><tr><td>RNAscope H202 & Protease Plus Reagenz</td><td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td><td>322330</td><td>Wasserstoffperoxyd x2 und Protease Plus x 1</td></tr><tr><td>RNAscope-Sonde - HPV16/18</td><td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td><td></td><td></td>311121</tr><tr><td>RNAscope Target Retrieval Reagenzien</td><td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td><td>322000</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Waschpuffer-Reagenzien</td><td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td><td>310091</td><td>Waschpuffer 50X x4</td></tr></tbody></table>

chromogene in-situ-hybridisierung ist ein tool für hpv-bezogene kopf- und halskrebsdiagnose

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

Die Infektion mit dem humanen Papillomavirus (HPV) ist ein wichtiger Risikofaktor für einen Subtyp des oropharyngealen Plattenepithelkarzinoms (OPSCC), das tendenziell mit einem besseren Ergebnis als alkohol- und tabakbedingte OPSCC in Verbindung gebracht wird. Die chromogene In-situ-Hybridisierung (CISH) der HPV-viralen RNA könnte die semiquantitative Auswertung viraler Transkripte der onkogenen Proteine E6 und E7 und eine In-situ-Visualisierung mit einer guten räumlichen Auflösung ermöglichen. Diese Technik ermöglicht die Diagnose einer aktiven Infektion mit der Visualisierung der HPV-Transkription in den tumoralen HPV-infizierten Zellen. Ein Vorteil dieser Technik ist die Vermeidung von Kontaminationen durch nichtneoplastische HPV-infizierte Zellen, die an den Tumor angrenzen. Insgesamt, seine guten DiagnoseLeistungen haben es als der Goldstandard für aktive HPV-Infektion Identifizierung betrachtet. Da die virale Proteininteraktion von E6 und E7 mit den Zellproteinen pRb und p53 für die Zelltransformation obligatorisch ist, ist HPV RNA CISH funktionell relevant und reflektiert akut eine aktive onkogene HPV-Infektion. Diese Technik ist auch klinisch relevant, da "niedrige" oder "hohe" HPV-Transkriptionsspiegel zur Identifizierung von zwei Prognosegruppen unter HPV-bezogenen p16-positiven Kopf- und Halskrebspatienten beitrugen. Hier stellen wir Ihnen das Protokoll für manuelle HPV-RNA-CISH vor, das auf formalinfixierten Paraffin-embedded (FFPE)-Dias mit einem vom Hersteller erhaltenen Kit durchgeführt wird. Anstelle chromogener Offenbarung kann die RNA-In-situ-Hybridisierung auch mit fluoreszierender Offenbarung (RNA FISH) durchgeführt werden. Es kann auch mit konventioneller Immunostainierung kombiniert werden.

Wie hier beschrieben, kann bei Kopf- und Halsplattenzellkrebs ein Fall in Gegenwart von brauner punktiformer Färbung im Zytoplasma oder in den Kernen von Tumorzellen als positiv betrachtet werden. In den meisten Studien wird das Signal entweder als "positiv" oder "nicht erkannt"14betrachtet. Es wurden Methoden zur Semiquantifizierung des Signals berichtet, aber es fehlt die Standardisierung zwischen den Teams. Zum Beispiel wurden die Signale in einigen Studien mit 1+ mit 1–3 Punkten pro Tumorzelle...

Die chromogene In-situ-Hybridisierung des humanen Papillomavirus (HPV) rna gilt als einer der Goldstandards für den aktiven Nachweis der Infektion durch das humane Papillomavirus in Tumoren. Es ermöglicht die Visualisierung der HPV E6-E7 mRNA-Expression mit Lokalisierung und semiquantitativer Auswertung seines Signals.

Chromogene In-Situ-Hybridisierung ist ein Tool für hpV-bezogene Kopf- und Halskrebsdiagnose

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...

HPV RNA CISH ermöglicht den Nachweis einer aktiven menschlichen Papilloma-Virusinfektion. Da die In-situ-Hybridisierung auf HPV-RNA abzielt, ermöglicht diese Technik die Visualisierung einer aktiven Transkription des Virus. Es hat eine präzise räumliche Auflösung und gute Diagnoseleistungen.Der Nachweis von HPV kann die Diagnose mehrerer HPV-bedingter Läsionen unterstützen, wie z. B. oropharyngeale Plattenepithelkarzinom oder zervikale Neoplasie. Es kann auch einen Einfluss auf die Prognose haben. Nach der Vorbereitung von Puffern und Gegenfärbungsreagenzien ein x Ziel-Retrieval-Reagenz in einem großen Becher vorzubereiten, indem 70 Milliliter 10-faches Zielabrufreagenz zu 630 Milliliter destilliertem Wasser hinzugefügt werden.Legen Sie das Becherglas auf eine Heizplatte mit Magnetrührer und bedecken Sie ihn mit Aluminiumfolie. Kochen Sie seinen Inhalt bei 100 Grad Celsius für 10 bis 15 Minuten, um sicherzustellen, dass es nicht länger als 30 Minuten kochen. Um die Peroxidase-Aktivität auf Dias mit zuvor deparaffinierten und im Diaregal platzierten Gewebeabschnitten zu blockieren, fügen Sie vier bis sechs Tropfen, gerade genug, um die Probe zu bedecken, Wasserstoffperoxid zu jedem Dia hinzu und inkubieren Sie sie für 10 Minuten bei Raumtemperatur.Waschen Sie die Dias zweimal für zwei Minuten in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur. Um DIE GRENZEN des RNA-Gewebes in den RNA-Gewebeabschnitten zu brechen, entfernen Sie zuerst die Aluminiumfolie mit einer Kralle aus der siedeten x TRR und hören Sie auf zu rühren. Tauchen Sie das Schiebegestell langsam und sehr sorgfältig ein.Den Becher wieder mit der Aluminiumfolie bedecken und 15 Minuten bebrüten. Verwenden Sie die Kralle, um das heiße Schieberegal sofort in ein destilliertes Wasserbad zu übertragen und zwei Minuten lang zu waschen. Waschen Sie die Dias dann in frischem 100%Ethanol für zwei Minuten, und lassen Sie sie bei Raumtemperatur für zwei Minuten trocknen.Als Nächstes verwenden Sie einen hydrophoben Barrierestift, um eine Barriere um jede Probe zu ziehen, und lassen Sie sie für mindestens fünf Minuten austrocknen. Zur Protease-Verdauung die Dias in das feuchtigkeitsgesteuerte Tablett legen und pro Probe etwa vier Tropfen Protease Plus hinzufügen. Bedecken Sie das Fach mit einem Deckel und legen Sie es 30 Minuten bei 40 Grad Celsius in den Hybridisierungsofen ein.Entfernen Sie das Fach aus dem Ofen, und entfernen Sie das Schiebegestell. Arbeiten Sie eine Rutsche nach der anderen, entfernen Sie schnell überschüssige Flüssigkeit, und legen Sie die Rutsche in das Schieberegal in einer Färbeschale mit destilliertem Wasser gefüllt untergetaucht. Waschen Sie die Dias zweimal für zwei Minuten in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur mit konstanter Rührung.Um die Hybridisierung zu starten, tippen und streichen Sie die Dias, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und legen Sie sie wieder in das Schiebeträger. Entfernen Sie die vorgewärmte HPV-Sonde aus dem Ofen, und fügen Sie etwa vier Tropfen hinzu, um jeden Abschnitt vollständig abzudecken. Bedecken Sie das Tablett mit dem Deckel, und legen Sie es in den Ofen für zwei Stunden bei 40 Grad Celsius.Nach Abschluss der Inkubation das Fach aus dem Ofen nehmen und das Schiebegestell entfernen. Eine Folie nach der anderen, schnell entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, und legen Sie die Rutsche in der Schiebestange in einer Färbeschale gefüllt mit einem x Waschpuffer gefüllt, waschen Sie die Dias für zwei Minuten bei Raumtemperatur mit konstanter Rührung, und wiederholen Sie mit frischen ein x Waschpuffer. Tippen und flicken, um überschüssige Flüssigkeit aus den Dias zu entfernen, und legen Sie sie wieder in das Schiebegestell.Fügen Sie etwa vier Tropfen Raumtemperatur AMP1 pro Abschnitt hinzu, um jeden Abschnitt vollständig abzudecken. Bedecken Sie das Tablett mit dem Deckel und legen Sie es 30 Minuten bei 40 Grad Celsius in den Ofen ein. Nachdem Sie das Fach aus dem Ofen entfernt haben, entfernen Sie das Schiebeträger.Arbeiten Sie eine Rutsche nach der anderen, entfernen Sie schnell überschüssige Flüssigkeit, und legen Sie die Rutsche in der Schiebestange in einer Färbeschale gefüllt mit einem x Waschpuffer, waschen für zwei Minuten bei Raumtemperatur mit konstanter Rührung, und wiederholen Sie mit frischen ein x Waschpuffer. Geben Sie die gleiche Anzahl von Tropfen jeder DAB-A- und DAB-B-Lösung in einem entsprechend großen Rohr aus, um ca. 120 Mikroliter DAB-Substrat pro Abschnitt und Wirbel herzustellen. Nehmen Sie jede Folie nacheinander aus dem Schiebeträger, tippen und flicken Sie, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und legen Sie sie wieder in das Schiebegestell.Pipette ca. 120 Mikroliter DAB-Mischung auf jeden Gewebeabschnitt, um sicherzustellen, dass die Abschnitte abgedeckt sind. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und mit der Gegenfärbung fortfahren. Legen Sie einen Tropfen Montagemedium pro Glaslatte, und legen Sie dann die Lamellen auf die Rutschen und lassen Sie sie lufttrocknen.Nach einigen Stunden mit der Auswertung mit einem optischen Mikroskop, wie im Manuskript beschrieben, gehen Sie fort. Wie hier im Kopf- und Halsplattenepithelkarzinom beschrieben, definierte das Vorhandensein von braunen punktförmigen Färbungen im Zytoplasma oder in den Kernen von Tumorzellen einen positiven Fall. Die Ergebnisse wurden in zwei Scores unterteilt, RNA CISH high und low score as observed with a 20x objective.DIE Färbung des RNA-CISH-Scores wird bei weniger als 50 % der Tumorzellen als niedrig angesehen und deckt weniger als 80 % der Zelloberfläche ab. Auf der anderen Seite ist der RNA-CISH-Score hoch, wenn er in mehr als 50% der gefärbten Krebszellen beobachtet wird, oder mit der Färbefläche von mehr als 80% in mehr als 30% der Tumorzellen. Man sollte die Dias nie für die Hybridisierung austrocknen lassen.Vergessen Sie nicht, die Sonde vorzuheizen. Führen Sie für jede Probe eine positive und negative Kontrolle durch, um die Qualität der RNA zu bewerten.

chromogenic-situ-hybridization-as-tool-for-hpv-related-head-neck

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Chromosomics: Erkennung von numerischen und strukturellen Veränderungen in alle 24 menschlichen Chromosomen gleichzeitig unter Verwendung eines neuartigen OctoChrome FISH-Test

Ein quantitatives Verfahren zur Analyse von Chromosomenreplikation Timing beschrieben. Das Verfahren nutzt BrdU Inkorporation in Kombination mit...

Chromosome Replizieren Timing mit Fluorescent Kombiniert<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung

In diesem Video wurden die mit MCPyV-Virionen infizierten Zellen einer in situ Hybridisierungskettenreaktion unterzogen, um MCPyV-spezifische Genome nachzuweisen. Darüber hinaus wurde die DNA-HCR-Technik mit FISH kombiniert, um die MCPyV-DNA in infizierten menschlichen Hautzellen sichtbar zu machen.

HCR-DNA FISH: Eine Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierungstechnik zum Nachweis viraler DNA in infizierten Zellen

Dieses Video zeigt die Schritte bei der Vorbehandlung von FFPE-Gewebeproben für die chromogene RNA-In-situ-Hybridisierung. Der Vorbehandlungsprozess trägt dazu bei, die Integrität der Nukleinsäuren in den Zellen und die gesamte Gewebemorphologie zu erhalten.

FFPE-Gewebevorbehandlung für RNA CISH: Ein Verfahren zur Verarbeitung von Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten für die chromogene In-situ-Hybridisierung von RNA

Dieses Video beschreibt eine sequentielle Hybridisierungsstrategie, bei der mRNA-Sonden mit spezifischer Ziel-mRNA hybridisiert werden. Nach der Sondenhybridisierung wird eine Signalamplifikation durchgeführt, um die Auflösung durch Reduzierung des Signal-Rausch-Verhältnisses während des RNA-CISH histologischer Proben zu verbessern.

Sondenhybridisierung und Signalamplifikation in RNA in situ Hybridisierung: Eine Technik zum Nachweis spezifischer RNA-Sequenzen in Gewebeschnitten

Dieses Video stellt das Protokoll für die Signaldetektion während der chromogenen RNA-in-situ-Hybridisierung vor. Mit dieser Technik kann eine aktive onkogene Infektion visuell in einer intakten Gewebeprobe diagnostiziert werden.

RNA-CISH-Signaldetektion: Eine Technik zum Nachweis chromogener Signale während der RNA-In-situ-Hybridisierung in intakten Gewebeproben

Wir haben eine Fluoreszenz-in situ-Hybridisierungsprotokoll für den Nachweis eines persistenten DNA-Virus-Genom in Gewebeschnitten von Tiermodellen. Dieses Protokoll ermöglicht das Studium Infektionsprozess von codetection des viralen Genoms, dessen RNA-Produkte, und viralen oder zellulären Proteinen in einzelnen Zellen.

Nachweis der Transkripte von Genom und einem Persistent DNA-Virus in einem neuronalen Gewebe Fluorescent In situ Hybridisierung Kombination mit Immunfärbung

Das Vorhandensein von Hochrisiko-HPV im Kopf-und Halstumorgewebe ist mit den positiven Ergebnissen assoziiert. Die neu entwickelte RNA in situ Hybridisierung Technik namens RNAscope ermöglicht die direkte Visualisierung von HPV E6/E7 mRNA in FFPE-Gewebeschnitten.

RNAscope für<em&gt; In situ</em&gt; Erkennung von transkriptionell aktiven Human Papillomavirus in Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom

Multiparameter-Fluoreszenz-Immunhistochemie kann verwendet werden, um die Anzahl, die relative Verteilung und die Lokalisierung von Immunzellpopulationen in der Tumor-Mikroumgebung zu bestimmen. Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung dieser Technik zur Analyse von T-Zell-Subpopulationen bei oropharyngealen Krebs.

Vier-Farb-Fluoreszenz-Immunhistochemie von T-Zell-Subpopulationen im Archiv Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete menschliche Oropharynx-Plattenepithelkarzinom-Proben

Wir beschreiben ein Protokoll, das fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) verwendet, um mehrere herpesvirale RNAs in lytisch infizierten menschlichen Zellen zu visualisieren, entweder in Suspension oder anhaftend. Dieses Protokoll enthält die Quantifizierung der Fluoreszenz, die ein nukleozytoplasmatisches Verhältnis erzeugt, und kann für die gleichzeitige Visualisierung von Wirts- und viralen Proteinen mit Immunfluoreszenz (IF) erweitert werden.

Quantitative Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) und Immunfluoreszenz (IF) spezifischer Genprodukte in KSHV-infizierten Zellen

Erfahren Sie, wie HPV RNA CISH aktive HPV-Infektionen in Tumorgewebe detektiert und visualisiert. Diese Methode ermöglicht präzise räumliche Auflösung und unterstützt die Diagnose HPV-assoziierter Kopf-Hals-Tumoren.

Chromogene In-Situ-Hybridisierung ist ein Tool für hpV-bezogene Kopf- und Halskrebsdiagnose

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