Name: Excitation-Scanning Hyperspektrale Bildgebungsmikroskopie zur effizienten Unterscheidung von Fluoreszenzsignalen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Lernen Sie die Anregungs-Scanning-Hyperspektralbildgebung zur effizienten Trennung mehrerer Fluoreszenzsignale in einer Probe. Diese Methode erhöht die Geschwindigkeit und Empfindlichkeit gegenüber traditionellen Verfahren.

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Die Autoren möchten die Unterstützung von NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163 und dem Abraham Mitchell Cancer Research Fund würdigen.

Drs. Leavesley und Rich geben finanzielles Interesse an einem Start-up-Unternehmen, SpectraCyte LLC, bekannt, das gegründet wurde, um die spektrale Bildgebungstechnologie zu kommerzialisieren.

Die optimale Nutzung einer hyperspektralen Bildgebung scannt mit der Konstruktion des Lichtweges. Insbesondere die Wahl der Lichtquelle, Filter (tunable und dichroic), Filter-Switching-Methode und Kamera bestimmen den verfügbaren Spektralbereich, mögliche Scangeschwindigkeit, Detektorempfindlichkeit und räumliche Probenahme. Quecksilberlichtbogenlampen bieten viele Anregungswellenlängenspitzen, bieten jedoch keinen flachen Spektralausgang und erfordern eine signifikante Signalreduktion an den Ausgangsspitzen, um die Spek...

Spektrale Bildgebung kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden und wird durch mehrere Begriffe1,2,3,4bezeichnet. Im Allgemeinen bezieht sich die Spektralbildgebung auf Daten, die in mindestens zwei räumlichen Dimensionen und einer Spektraldimension erfasst wurden. Multispektrale und hyperspektrale Bildgebung unterscheiden sich am häufigsten durch die Anzahl der Wellenlängenbänder oder ob die Spektralbänder zusammenhängend sind1. Für diese Anwendung werden hyperspektrale Daten definiert als Spektraldaten, die mit zusammenhängenden Wellenlängenbändern erfasst werden, die durch den Abstand der mittleren Wellenlängen erreicht werden, nicht weniger als die Hälfte der vollen Breite bei halbmaximaler Breite (FWHM) jedes Bandpassfilters, der für die Anregung verwendet wird (d. h. 5 nm Wellenlängenabstand für Bandpassfilter mit 14-20 nm Bandbreiten). Die Kontinuität der Datenbänder ermöglicht ein Oversampling des Datensatzes, wodurch sichergestellt wird, dass die Nyquist-Kriterien beim Sampling der Spektraldomäne erfüllt sind.
Hyperspektrale Bildgebung wurde von der NASA in den 1970er und 1980er Jahren in Verbindung mit dem ersten Landsat-Satelliten5,6entwickelt. Das Sammeln von Daten aus mehreren zusammenhängenden Spektralbändern ermöglichte die Erzeugung eines Strahlungsspektrums jedes Pixels. Die Identifizierung und Definition des Strahlungsspektrums einzelner Komponenten ermöglichte es, Oberflächenmaterialien nicht nur anhand ihrer charakteristischen Spektren zu erkennen, sondern auch intervenierende Signale, wie z.B. Schwankungen des Signals durch atmosphärischen Bedingungen. Das Konzept der Detektion von Materialien anhand ihrer charakteristischen Spektren wurde 1996 auf biologische Systeme angewandt, als Schröck et al. Kombinationen von fünf verschiedenen Fluorophoren und ihren bekannten Spektren verwendeten, um markierte Chromosomen in einem Prozess zu unterscheiden, der als spektrale Karyotypisierung7. Diese Technik wurde im Jahr 2000 von Tsurui et al. für die Fluoreszenzbildgebung von Gewebeproben ausgearbeitet, wobei sieben fluoreszierende Farbstoffe und Singularwertzersetzung verwendet wurden, um eine spektrale Trennung jedes Pixels in lineare Kombinationen von Spektren in der Referenzzuteilung zu erreichen. Bibliothek8. Ähnlich wie ihre Fernerkundungs-Gegenstücke kann der Beitrag jedes bekannten Fluorophors aus dem hyperspektralen Bild berechnet werden, wobei a priori Informationen über das Spektrum jedes Fluorophors gegeben sind.
Hyperspektrale Bildgebung wurde auch in den Bereichen Landwirtschaft9, Astronomie10, Biomedizin11, chemische Bildgebung12, Umweltanwendungen13, Augenpflege14, Lebensmittelwissenschaft15, Forensische Wissenschaft16,17, medizinische Wissenschaft18, Mineralogie19, und Überwachung20. Eine wesentliche Einschränkung der aktuellen hyperspektralen Bildgebungssysteme des Fluoreszenzmikroskops besteht darin, dass die standardmäßige hyperspektrale Bildgebungstechnologie Fluoreszenzsignale in schmalen Bändern isoliert, indem sie zuerst das Anregungslicht filtert, um die Anregung der Probe zu steuern, 2) weitere Filterung emittiertes Licht, um die Fluoreszenzemission in schmale Bänder zu trennen, die später mathematisch getrennt werden können21. Durch das Filtern sowohl der Anregungsbeleuchtung als auch der emittierten Fluoreszenz wird die Menge des verfügbaren Signals reduziert, was das Signal-Rausch-Verhältnis senkt und lange Erfassungszeiten erfordert. Das niedrige Signal und die langen Erfassungszeiten begrenzen die Anwendbarkeit der hyperspektralen Bildgebung als Diagnostisches Werkzeug.
Es wurde eine bildgebende Modalität entwickelt, die hyperspektrale Bildgebung nutzt, aber das verfügbare Signal steigert und dadurch die erforderliche Erfassungszeit21,22reduziert. Diese neue Modalität, die hyperspektrale Bildgebung beim Anregungsscannen genannt wird, erfasst spektrale Bilddaten, indem sie die Anregungswellenlänge variiert und ein breites Spektrum emittierten Lichts sammelt. Es wurde bereits gezeigt, dass diese Technik im Vergleich zu Emissionsscantechniken21,22Größenordnungen im Signal-Rausch-Verhältnis erhöht. Die Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses ist weitgehend auf den weiträumigen (ca. 600 nm) von Emissionslicht, der erkannt wird, während spezifität durch Filterung nur des Anregungslichts anstelle der Fluoreszenzemission gewährleistet wird. Dadurch erreicht das gesamte emittierte Licht (für jede Anregungswellenlänge) den Detektor21. Darüber hinaus kann diese Technik verwendet werden, um Autofluoreszenz von exogenen Etiketten zu unterscheiden. Darüber hinaus reduziert die Möglichkeit, die Erfassungszeit durch erhöhtes nachweisbares Signal zu reduzieren, die Gefahr von Photobleichungen und ermöglicht Spektralscans mit einer Erfassungsrate, die für die spektrale Video-Bildgebung akzeptabel ist.
Ziel dieses Protokolls ist es, als Datenerfassungsleitfaden für die anregend-scannende hyperspektrale Bildgebungsmikroskopie zu dienen. Darüber hinaus sind Beschreibungen enthalten, die helfen, den Lichtpfad und die Hardware zu verstehen. Ebenfalls beschrieben ist die Implementierung von Open-Source-Software für ein anregendes hyperspektrales Bildgebungsmikroskop. Schließlich werden Beschreibungen bereitgestellt, wie das System auf einen NIST-nachverfolgbaren Standard kalibriert, Software- und Hardwareeinstellungen für genaue Ergebnisse angepasst und das erkannte Signal in Beiträge einzelner Komponenten entgemischt werden kann.

<table><tbody><tr><td>Glatte Muskelzellen der Atemwege</td><td>National Disease Research Interchange (NDRI)</td><td>Isoliert aus menschlichem Lungengewebe, gewonnen aus NDRI</td><td>Hochgradig autofluoreszierende, kalziumempfindliche Zellen</td></tr><tr><td>Automated Shutter</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>SHB1</td><td>Fernsteuerbarer Verschluss zur Minimierung von Photobleaching</td></tr><tr><td>Automatisierter Tisch</td><td>Prior Scientific H177P1T4</td><td></td><td>Fernsteuerbarer Tisch für die automatische Aufnahme mehrerer Sichtfelder oder zusammengesetzter Bilder.</td></tr><tr><td>Automated Table Controller (XY)</td><td>Prior Scientific</td><td>Proscan III (H31XYZE-US)</td><td>Zur Anbindung des automatisierten Tisches an Computer und Joystick</td></tr><tr><td>Puffer</td><td>Eigenhergestellt</td><td>145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-Glucose, 1 mM MgCl2 und 1 mM CaCl2, bei pH 7,3</td><td></td></tr><tr><td>Zellkammer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Attofluor-Zellkammer, A7816</td><td>Deckglashalter aus chirurgischem Edelstahl und einem Gummi-O-Ring zur Abdichtung von Medien und zur Verhinderung von Proben- und/oder Objektivkontaminationen</td></tr><tr><td>Anregungsfilter</td><td>Semrock Inc.</td><td>TBP01-378/16</td><td>Mittlerer Wellenlängenbereich (340-378 nm), Bandbreite (Minimum 16 nm, nominale FWHM 20 nm), Brechungsindex (1,88)</td></tr><tr><td></td><td>Semrock Inc.</td><td>TBP01-402/16</td><td>Mittlerer Wellenlängenbereich (360-400 nm), Bandbreite (Minimum 16 nm, nominale FWHM 20 nm), Brechungsindex (1,8)</td></tr><tr><td></td><td>Semrock Inc.</td><td>TBP01-449/15</td><td>Mittlerer Wellenlängenbereich (400-448,8 nm), Bandbreite (Minimum 15 nm, nominale FWHM 20 nm), Brechungsindex (1,8)</td></tr><tr><td></td><td>Semrock Inc.</td><td>TBP01-501/15</td><td>Mittlerer Wellenlängenbereich (448,8-501,5 nm), Bandbreite (Minimum 15 nm, nominale FWHM 20 nm), Brechungsindex (1,84)</td></tr><tr><td></td><td>Semrock Inc.</td><td>TBP01-561/14</td><td>Mittlerer Wellenlängenbereich (501,5-561 nm), Bandbreite (Minimum 14 nm, nominale FWHM 20 nm), Brechungsindex (1,83)</td></tr><tr><td>Fluoreszenzfilter Würfel dichroitischer Strahlteiler</td><td>Semrock Inc.</td><td>FF495-Di03</td><td>Trennt Anregungs- und Emissionslicht bei 495 nm (>98 % Reflexion zwischen 350-488 nm, >93 % Transmission zwischen 502-950 nm), Filter Effektivindex (1,78)</td></tr><tr><td>Fluoreszenzfilter Würfel Langpassfilter</td><td>Semrock Inc.</td><td>FF01 496/LP-25</td><td>Ermöglicht den Durchgang von Licht länger als 496 nm ( >93% durchschnittliche Transmission zwischen 503,2-1100 nm), Brechungsindex (1,86)</td></tr><tr><td>GCaMP Sonde</td><td></td><td>Addgen G-CaMP3; Plasmid #22692</td><td>Ein genetisch kodierter Calcium-Indikator auf Basis einer einzigen Wellenlänge GCaMP2</td></tr><tr><td>Integrating Sphere</td><td>Ocean Optics</td><td>FOIS-1</td><td>Wird für die genaue Messung der Weitwinkelbeleuchtung</td></tr><tr><td>verwendet Inverses Fluoreszenzmikroskop Die inversen</td> Mikroskope <td>TE2000</td> von <td>Nikon Instruments</td><td>ermöglichen die direkte Anregung der Probe, ohne dass Schichten von Medien und/oder Gewebe durchdrungen werden müssen.</td></tr><tr><td>Mitotracker Green</td><td>FM ThermoFisher</td><td>Scientific M7514</td><td>Labels Mitochondrien</td></tr><tr><td>NIST-Traceable Calibration Lamp</td><td>Ocean Optics</td><td>LS-1-CAL-INT</td><td>Eine Lampe mit bekanntem Spektrum für den Einsatz als Standard</td></tr><tr><td>NIST-Traceable Fluorescein</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F36915</td><td>Zur Überprüfung der angemessenen spektralen Empfindlichkeit des Systems</td></tr><tr><td>NucBlue</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37605</td><td>Markierung von Zellkernen</td></tr><tr><td>Objektiv (10X)</td><td>Nikon Instruments</td><td>Plan Apo &lambda; 10X/0.45 &infin;/0.17 MRD00105</td><td>Nützlich für große Sichtfelder</td></tr><tr><td>Objektiv (20X)</td><td>Nikon Instruments</td><td>Plan Apo &lambda; 20X/0.75 &infin;/0.17 MRD00205</td><td>Am häufigsten für Gewebeproben</td></tr><tr><td>verwendet Objektiv (60X)</td><td>Nikon Instruments</td><td>Plan Apo VC 60X/1.2 WI &infin;/0.15-0.18 WD 0.27</td><td>Am häufigsten verwendet für Zellproben</td></tr><tr><td>sCMOS-Kamera</td><td>Photometrie</td><td>Prime 95B (Rev A8-062802018)</td><td>Zur Aufnahme hochempfindlicher digitaler Bilder</td></tr><tr><td>Spektrometer</td><td>Ocean Optics</td><td>QE65000</td><td>Wird zur Messung der spektralen Ausgabe des Anregungs-Scanning-Spektralsystems verwendet</td></tr><tr><td>Abstimmbarer Filterwechsler</td><td>Sutter Instrument</td><td>Lambda VF-5</td><td>Motorisierte Einheit zur automatischen Abstimmung des Anregungsfilters/ </td></tr><tr><td>schaltende Xenon-Bogenlampe</td><td>Sunoptic Technologies</td><td>Titan 300HP Lichtquelle</td><td>Lichtquelle mit relativ gleichmäßiger spektraler Leistung</td></tr></tbody></table>

excitation-scanning hyperspektrale bildgebungsmikroskopie zur effizienten unterscheidung von fluoreszenzsignalen

Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals

Mehrere Techniken basieren auf dem Nachweis von Fluoreszenzsignalen, um Phänomene zu identifizieren oder zu untersuchen oder Funktionen aufzuklären. Die Trennung dieser Fluoreszenzsignale erwies sich bis zum Aufkommen der hyperspektralen Bildgebung als umständlich, bei der Fluoreszenzquellen voneinander sowie von Hintergrundsignalen und Autofluoreszenz getrennt werden können (angesichts der Kenntnis ihrer spektralen Unterschriften). Die traditionelle hyperspektrale Bildgebung beim Emissionsscannen leidet jedoch unter langsamen Erfassungszeiten und niedrigen Signal-Rausch-Verhältnissen aufgrund der notwendigen Filterung sowohl von Anregungs- als auch von Emissionslicht. Es wurde bereits gezeigt, dass die hyperspektrale Bildgebung beim Anregungsscannen die erforderliche Erfassungszeit reduziert und gleichzeitig das Signal-Rausch-Verhältnis der erfassten Daten erhöht. Mit kommerziell erhältlichen Geräten beschreibt dieses Protokoll, wie ein hyperspektrales Mikroskopkopiesystem für die Anregung, das Scannen von Hyperspektralbildern zusammenbaut, kalibriert und verwendet wird, um Signale von mehreren Fluoreszenzquellen in einer einzigen Probe zu trennen. Obwohl diese Technik für die mikroskopische Bildgebung von Zellen und Geweben sehr anwendbar ist, kann sie auch für jede Art von Experiment mit Fluoreszenz nützlich sein, bei dem es möglich ist, Anregungswellenlängen zu variieren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: chemische Bildgebung, Umweltanwendungen, Augenpflege, Lebensmittelwissenschaft, Forensik, Medizin und Mineralogie.

Mehrere wichtige Schritte aus diesem Protokoll sind notwendig, um die Sammlung von Daten sicherzustellen, die sowohl genau als auch ohne Bildgebung und spektrale Artefakte sind. Das Überspringen dieser Schritte kann dazu führen, dass Daten signifikant erscheinen, aber nicht mit einem anderen spektralen Bildgebungssystem überprüft oder reproduziert werden können, wodurch alle Schlussfolgerungen, die mit diesen Daten gemacht wurden, effektiv zunichte gemacht werden. Zu diesen wichtigen Schr...

Spektrale Bildgebung hat sich zu einer zuverlässigen Lösung für die Identifizierung und Trennung mehrerer Fluoreszenzsignale in einer einzigen Probe und kann Signale von Interesse leicht von Hintergrund- oder Autofluoreszenz unterscheiden. Die hyperspektrale Bildgebung beim Erregungsscannen verbessert diese Technik, indem die erforderliche Bildaufnahmezeit verringert und gleichzeitig das Signal-Rausch-Verhältnis erhöht wird.

Excitation-Scanning Hyperspektrale Bildgebungsmikroskopie zur effizienten Unterscheidung von Fluoreszenzsignalen

Several techniques rely on detection of fluorescence signals to identify or study phenomena or to elucidate functions. Separation of these fluorescence ...

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es eine Methode beschreibt, die verwendet werden kann, um mehrere fluoreszierende Signale in einer einzigen Probe zu trennen. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden kann das Anregungsscannen die Geschwindigkeit des Experiments erhöhen und die Empfindlichkeit der Daten verbessern. Durch die Verwendung verschiedener Beleuchtungsquellen, wie z. B. eines Superkontinuumlasers, kann diese Methode auf Spinnscheiben- oder Laserscanning-Konfokalmikroskopsysteme anwendbar sein.Bei der Durchführung von Anregungsscans, der spektralen Bildgebungsmikroskopie, ist es wichtig zu überprüfen, ob der Anregungsspitzenwert jedes fluoreszierenden Etiketts bei einer anderen Wellenlänge auftritt. Richten Sie zunächst ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop und eine Kamera ein, wie im Textprotokoll beschrieben. Dann laden Sie die Probe auf die Bühne.Wählen Sie im Dropdown-Menü des Mikromanager-Hauptfensters 475 Nanometer für die erstmalige Probenanzeige aus. Doppelklicken Sie dann auf das Feld neben der Belichtung und geben Sie 100 ein, um die Belichtungszeit auf 100 Millisekunden einzustellen. Klicken Sie schließlich auf Live, um das Beispiel anzuzeigen.Klicken Sie nun

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Research

Forschung

JoVE Journal

Engineering

Ingenieurwesen

Wir demonstrieren die Verwendung von Fluoreszenz-Photoaktivierungs-Lokalisierungsmikroskopie (FPALM), um gleichzeitig mehrere Arten von fluoreszenzmarkierten Molekülen in Zellen abzubilden. Die beschriebenen Techniken ermöglichen die Lokalisierung von Tausenden bis Hunderttausenden einzelner fluoreszierend markierter Proteine mit einer Genauigkeit von Dutzenden von Nanometern innerhalb einzelner Zellen.

Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie

Wir präsentieren eine Open-Source hohe Content-Analyse (HCA) Instrument unter Verwendung von automatisierten Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) zur Untersuchung von Protein-Interaktionen mit Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) basiert Ablesungen. Die Datenerfassung für dieses openFLIM-HCA Instrument wird von der Software in μManager geschrieben gesteuert und Datenanalyse wird in FLIMfit unternommen.

Open Source High Content Analyse Unter Verwendung Automatische Fluorescence Lifetime Imaging Mikroskopie

Amyloid-Ablagerungen ist ein Markenzeichen von verschiedenen Krankheiten und viele andere Organe befällt. Dieses Papier beschreibt die Anwendung der leuchtenden konjugierte Oligothiophene Fluoreszenz Färbung in Kombination mit Fluoreszenz-Mikroskopie-Techniken. Diese Färbung Methode darstellt, ein leistungsstarkes Tool für die Erkennung und Erforschung von Proteinaggregaten in klinischen und wissenschaftlichen Einrichtungen.

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Hier stellen wir ein Protokoll vor, um lumineszierende hyperspektrale Bildgebungsdaten zu erhalten und optische Anisotropie-Features von Lanthanid-basierten Einzelkristallen mit einem Hyperspektral Imaging System zu analysieren.

Hyperspektrale Bildgebung als Werkzeug zur Untersuchung der optischen Anisotropie in Lanthanid-basierten molekularen Einzelkristallen

Dieses Papier vergleicht direkt die Auflösung, Empfindlichkeit und Bildkontraste der stimulierten Raman-Streuung (SRS) und der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS), die in dieselbe Mikroskopplattform integriert sind. Die Ergebnisse zeigen, dass CARS eine bessere räumliche Auflösung hat, SRS bessere Kontraste und spektrale Auflösung liefert und beide Methoden eine ähnliche Empfindlichkeit aufweisen.

Direkter Vergleich der hyperspektralen stimulierten Raman-Streuung und der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streumikroskopie für die chemische Bildgebung

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Multimodale nichtlineare hyperspektrale chemische Bildgebung mit Line-Scanning-Schwingungssummen-Frequenz-Generierungsmikroskopie

Unter Verwendung einer multimodalen Plattform, die markierungsfreie optische Bildgebungsmodalitäten kombiniert, haben wir ein Protokoll zur Visualisierung und Quantifizierung der zellulären Dynamik und des Stoffwechsels entwickelt. Durch Bildgebung mittels Multiphotonenfluoreszenz, Erzeugung der zweiten Harmonischen und stimulierte Raman-Streumikroskopie können wir einen ganzheitlichen Überblick über die zelluläre und molekulare Umgebung erhalten.

Multimodale optische Bildgebungsplattform zur Untersuchung des zellulären Stoffwechsels

Spectral Iterative Bleaching Extends Multiplexity (IBEX) baut auf der Basis-IBEX-Technik auf, indem es Heparin-Blocking hinzufügt, um unspezifische Bindungen zu minimieren, und die spektrale Detektion mit computergestützter Entmischung nutzt, um die Autofluoreszenz zu unterdrücken. Dieser Ansatz beschleunigt die Bildaufnahme bei gleichzeitiger Reduzierung von Hintergrundquellen und ermöglicht robuste mehrstufige räumliche Proteomanalysen mit hohen Parametern.

High-Plex-Bildgebung mittels spektral-konfokaler Mikroskopie zur Minimierung unspezifischer Gewebefluoreszenz

Ein dynamisches Phantom mit mehreren Kompartimenten wird verwendet, um einige biologische Aspekte zu simulieren, die für Stoffwechselstudien mit hyperpolarisierten Magnetresonanzmitteln von Interesse sind.

Die Verwendung eines Mehrfach Dynamische einzelner Enzym-Phantom für Studien von hyperpolarisiertem Magnetic Resonance Agents

Lernen Sie die Anregungs-Scanning-Hyperspektralbildgebung zur effizienten Trennung mehrerer Fluoreszenzsignale in einer Probe. Diese Methode erhöht die Geschwindigkeit und Empfindlichkeit gegenüber traditionellen Verfahren.

Excitation-Scanning Hyperspektrale Bildgebungsmikroskopie zur effizienten Unterscheidung von Fluoreszenzsignalen

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