Name: Excitation-Scanning Hyperspektrale Bildgebungsmikroskopie zur effizienten Unterscheidung von Fluoreszenzsignalen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Lernen Sie die Anregungs-Scanning-Hyperspektralbildgebung zur effizienten Trennung mehrerer Fluoreszenzsignale in einer Probe. Diese Methode erhöht die Geschwindigkeit und Empfindlichkeit gegenüber traditionellen Verfahren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren möchten die Unterstützung von NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163 und dem Abraham Mitchell Cancer Research Fund würdigen.

Drs. Leavesley und Rich geben finanzielles Interesse an einem Start-up-Unternehmen, SpectraCyte LLC, bekannt, das gegründet wurde, um die spektrale Bildgebungstechnologie zu kommerzialisieren.

Die optimale Nutzung einer hyperspektralen Bildgebung scannt mit der Konstruktion des Lichtweges. Insbesondere die Wahl der Lichtquelle, Filter (tunable und dichroic), Filter-Switching-Methode und Kamera bestimmen den verfügbaren Spektralbereich, mögliche Scangeschwindigkeit, Detektorempfindlichkeit und räumliche Probenahme. Quecksilberlichtbogenlampen bieten viele Anregungswellenlängenspitzen, bieten jedoch keinen flachen Spektralausgang und erfordern eine signifikante Signalreduktion an den Ausgangsspitzen, um die Spek...

Spektrale Bildgebung kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden und wird durch mehrere Begriffe1,2,3,4bezeichnet. Im Allgemeinen bezieht sich die Spektralbildgebung auf Daten, die in mindestens zwei räumlichen Dimensionen und einer Spektraldimension erfasst wurden. Multispektrale und hyperspektrale Bildgebung unterscheiden sich am häufigsten durch die Anzahl der Wellenlängenbänder oder ob die Spektralbänder zusammenhängend sind1. Für diese Anwendung werden hyperspektrale Daten definiert als Spektraldaten, die mit zusammenhängenden Wellenlängenbändern erfasst werden, die durch den Abstand der mittleren Wellenlängen erreicht werden, nicht weniger als die Hälfte der vollen Breite bei halbmaximaler Breite (FWHM) jedes Bandpassfilters, der für die Anregung verwendet wird (d. h. 5 nm Wellenlängenabstand für Bandpassfilter mit 14-20 nm Bandbreiten). Die Kontinuität der Datenbänder ermöglicht ein Oversampling des Datensatzes, wodurch sichergestellt wird, dass die Nyquist-Kriterien beim Sampling der Spektraldomäne erfüllt sind.
Hyperspektrale Bildgebung wurde von der NASA in den 1970er und 1980er Jahren in Verbindung mit dem ersten Landsat-Satelliten5,6entwickelt. Das Sammeln von Daten aus mehreren zusammenhängenden Spektralbändern ermöglichte die Erzeugung eines Strahlungsspektrums jedes Pixels. Die Identifizierung und Definition des Strahlungsspektrums einzelner Komponenten ermöglichte es, Oberflächenmaterialien nicht nur anhand ihrer charakteristischen Spektren zu erkennen, sondern auch intervenierende Signale, wie z.B. Schwankungen des Signals durch atmosphärischen Bedingungen. Das Konzept der Detektion von Materialien anhand ihrer charakteristischen Spektren wurde 1996 auf biologische Systeme angewandt, als Schröck et al. Kombinationen von fünf verschiedenen Fluorophoren und ihren bekannten Spektren verwendeten, um markierte Chromosomen in einem Prozess zu unterscheiden, der als spektrale Karyotypisierung7. Diese Technik wurde im Jahr 2000 von Tsurui et al. für die Fluoreszenzbildgebung von Gewebeproben ausgearbeitet, wobei sieben fluoreszierende Farbstoffe und Singularwertzersetzung verwendet wurden, um eine spektrale Trennung jedes Pixels in lineare Kombinationen von Spektren in der Referenzzuteilung zu erreichen. Bibliothek8. Ähnlich wie ihre Fernerkundungs-Gegenstücke kann der Beitrag jedes bekannten Fluorophors aus dem hyperspektralen Bild berechnet werden, wobei a priori Informationen über das Spektrum jedes Fluorophors gegeben sind.
Hyperspektrale Bildgebung wurde auch in den Bereichen Landwirtschaft9, Astronomie10, Biomedizin11, chemische Bildgebung12, Umweltanwendungen13, Augenpflege14, Lebensmittelwissenschaft15, Forensische Wissenschaft16,17, medizinische Wissenschaft18, Mineralogie19, und Überwachung20. Eine wesentliche Einschränkung der aktuellen hyperspektralen Bildgebungssysteme des Fluoreszenzmikroskops besteht darin, dass die standardmäßige hyperspektrale Bildgebungstechnologie Fluoreszenzsignale in schmalen Bändern isoliert, indem sie zuerst das Anregungslicht filtert, um die Anregung der Probe zu steuern, 2) weitere Filterung emittiertes Licht, um die Fluoreszenzemission in schmale Bänder zu trennen, die später mathematisch getrennt werden können21. Durch das Filtern sowohl der Anregungsbeleuchtung als auch der emittierten Fluoreszenz wird die Menge des verfügbaren Signals reduziert, was das Signal-Rausch-Verhältnis senkt und lange Erfassungszeiten erfordert. Das niedrige Signal und die langen Erfassungszeiten begrenzen die Anwendbarkeit der hyperspektralen Bildgebung als Diagnostisches Werkzeug.
Es wurde eine bildgebende Modalität entwickelt, die hyperspektrale Bildgebung nutzt, aber das verfügbare Signal steigert und dadurch die erforderliche Erfassungszeit21,22reduziert. Diese neue Modalität, die hyperspektrale Bildgebung beim Anregungsscannen genannt wird, erfasst spektrale Bilddaten, indem sie die Anregungswellenlänge variiert und ein breites Spektrum emittierten Lichts sammelt. Es wurde bereits gezeigt, dass diese Technik im Vergleich zu Emissionsscantechniken21,22Größenordnungen im Signal-Rausch-Verhältnis erhöht. Die Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses ist weitgehend auf den weiträumigen (ca. 600 nm) von Emissionslicht, der erkannt wird, während spezifität durch Filterung nur des Anregungslichts anstelle der Fluoreszenzemission gewährleistet wird. Dadurch erreicht das gesamte emittierte Licht (für jede Anregungswellenlänge) den Detektor21. Darüber hinaus kann diese Technik verwendet werden, um Autofluoreszenz von exogenen Etiketten zu unterscheiden. Darüber hinaus reduziert die Möglichkeit, die Erfassungszeit durch erhöhtes nachweisbares Signal zu reduzieren, die Gefahr von Photobleichungen und ermöglicht Spektralscans mit einer Erfassungsrate, die für die spektrale Video-Bildgebung akzeptabel ist.
Ziel dieses Protokolls ist es, als Datenerfassungsleitfaden für die anregend-scannende hyperspektrale Bildgebungsmikroskopie zu dienen. Darüber hinaus sind Beschreibungen enthalten, die helfen, den Lichtpfad und die Hardware zu verstehen. Ebenfalls beschrieben ist die Implementierung von Open-Source-Software für ein anregendes hyperspektrales Bildgebungsmikroskop. Schließlich werden Beschreibungen bereitgestellt, wie das System auf einen NIST-nachverfolgbaren Standard kalibriert, Software- und Hardwareeinstellungen für genaue Ergebnisse angepasst und das erkannte Signal in Beiträge einzelner Komponenten entgemischt werden kann.

<table><tbody><tr><td>Glatte Muskelzellen der Atemwege</td><td>National Disease Research Interchange (NDRI)</td><td>Isoliert aus menschlichem Lungengewebe, gewonnen aus NDRI</td><td>Hochgradig autofluoreszierende, kalziumempfindliche Zellen</td></tr><tr><td>Automated Shutter</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>SHB1</td><td>Fernsteuerbarer Verschluss zur Minimierung von Photobleaching</td></tr><tr><td>Automatisierter Tisch</td><td>Prior Scientific H177P1T4</td><td></td><td>Fernsteuerbarer Tisch für die automatische Aufnahme mehrerer Sichtfelder oder zusammengesetzter Bilder.</td></tr><tr><td>Automated Table Controller (XY)</td><td>Prior Scientific</td><td>Proscan III (H31XYZE-US)</td><td>Zur Anbindung des automatisierten Tisches an Computer und Joystick</td></tr><tr><td>Puffer</td><td>Eigenhergestellt</td><td>145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-Glucose, 1 mM MgCl2 und 1 mM CaCl2, bei pH 7,3</td><td></td></tr><tr><td>Zellkammer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Attofluor-Zellkammer, A7816</td><td>Deckglashalter aus chirurgischem Edelstahl und einem Gummi-O-Ring zur Abdichtung von Medien und zur Verhinderung von Proben- und/oder Objektivkontaminationen</td></tr><tr><td>Anregungsfilter</td><td>Semrock Inc.</td><td>TBP01-378/16</td><td>Mittlerer Wellenlängenbereich (340-378 nm), Bandbreite (Minimum 16 nm, nominale FWHM 20 nm), Brechungsindex (1,88)</td></tr><tr><td></td><td>Semrock Inc.</td><td>TBP01-402/16</td><td>Mittlerer Wellenlängenbereich (360-400 nm), Bandbreite (Minimum 16 nm, nominale FWHM 20 nm), Brechungsindex (1,8)</td></tr><tr><td></td><td>Semrock Inc.</td><td>TBP01-449/15</td><td>Mittlerer Wellenlängenbereich (400-448,8 nm), Bandbreite (Minimum 15 nm, nominale FWHM 20 nm), Brechungsindex (1,8)</td></tr><tr><td></td><td>Semrock Inc.</td><td>TBP01-501/15</td><td>Mittlerer Wellenlängenbereich (448,8-501,5 nm), Bandbreite (Minimum 15 nm, nominale FWHM 20 nm), Brechungsindex (1,84)</td></tr><tr><td></td><td>Semrock Inc.</td><td>TBP01-561/14</td><td>Mittlerer Wellenlängenbereich (501,5-561 nm), Bandbreite (Minimum 14 nm, nominale FWHM 20 nm), Brechungsindex (1,83)</td></tr><tr><td>Fluoreszenzfilter Würfel dichroitischer Strahlteiler</td><td>Semrock Inc.</td><td>FF495-Di03</td><td>Trennt Anregungs- und Emissionslicht bei 495 nm (>98 % Reflexion zwischen 350-488 nm, >93 % Transmission zwischen 502-950 nm), Filter Effektivindex (1,78)</td></tr><tr><td>Fluoreszenzfilter Würfel Langpassfilter</td><td>Semrock Inc.</td><td>FF01 496/LP-25</td><td>Ermöglicht den Durchgang von Licht länger als 496 nm ( >93% durchschnittliche Transmission zwischen 503,2-1100 nm), Brechungsindex (1,86)</td></tr><tr><td>GCaMP Sonde</td><td></td><td>Addgen G-CaMP3; Plasmid #22692</td><td>Ein genetisch kodierter Calcium-Indikator auf Basis einer einzigen Wellenlänge GCaMP2</td></tr><tr><td>Integrating Sphere</td><td>Ocean Optics</td><td>FOIS-1</td><td>Wird für die genaue Messung der Weitwinkelbeleuchtung</td></tr><tr><td>verwendet Inverses Fluoreszenzmikroskop Die inversen</td> Mikroskope <td>TE2000</td> von <td>Nikon Instruments</td><td>ermöglichen die direkte Anregung der Probe, ohne dass Schichten von Medien und/oder Gewebe durchdrungen werden müssen.</td></tr><tr><td>Mitotracker Green</td><td>FM ThermoFisher</td><td>Scientific M7514</td><td>Labels Mitochondrien</td></tr><tr><td>NIST-Traceable Calibration Lamp</td><td>Ocean Optics</td><td>LS-1-CAL-INT</td><td>Eine Lampe mit bekanntem Spektrum für den Einsatz als Standard</td></tr><tr><td>NIST-Traceable Fluorescein</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F36915</td><td>Zur Überprüfung der angemessenen spektralen Empfindlichkeit des Systems</td></tr><tr><td>NucBlue</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37605</td><td>Markierung von Zellkernen</td></tr><tr><td>Objektiv (10X)</td><td>Nikon Instruments</td><td>Plan Apo &lambda; 10X/0.45 &infin;/0.17 MRD00105</td><td>Nützlich für große Sichtfelder</td></tr><tr><td>Objektiv (20X)</td><td>Nikon Instruments</td><td>Plan Apo &lambda; 20X/0.75 &infin;/0.17 MRD00205</td><td>Am häufigsten für Gewebeproben</td></tr><tr><td>verwendet Objektiv (60X)</td><td>Nikon Instruments</td><td>Plan Apo VC 60X/1.2 WI &infin;/0.15-0.18 WD 0.27</td><td>Am häufigsten verwendet für Zellproben</td></tr><tr><td>sCMOS-Kamera</td><td>Photometrie</td><td>Prime 95B (Rev A8-062802018)</td><td>Zur Aufnahme hochempfindlicher digitaler Bilder</td></tr><tr><td>Spektrometer</td><td>Ocean Optics</td><td>QE65000</td><td>Wird zur Messung der spektralen Ausgabe des Anregungs-Scanning-Spektralsystems verwendet</td></tr><tr><td>Abstimmbarer Filterwechsler</td><td>Sutter Instrument</td><td>Lambda VF-5</td><td>Motorisierte Einheit zur automatischen Abstimmung des Anregungsfilters/ </td></tr><tr><td>schaltende Xenon-Bogenlampe</td><td>Sunoptic Technologies</td><td>Titan 300HP Lichtquelle</td><td>Lichtquelle mit relativ gleichmäßiger spektraler Leistung</td></tr></tbody></table>

excitation-scanning hyperspektrale bildgebungsmikroskopie zur effizienten unterscheidung von fluoreszenzsignalen

Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals

Mehrere Techniken basieren auf dem Nachweis von Fluoreszenzsignalen, um Phänomene zu identifizieren oder zu untersuchen oder Funktionen aufzuklären. Die Trennung dieser Fluoreszenzsignale erwies sich bis zum Aufkommen der hyperspektralen Bildgebung als umständlich, bei der Fluoreszenzquellen voneinander sowie von Hintergrundsignalen und Autofluoreszenz getrennt werden können (angesichts der Kenntnis ihrer spektralen Unterschriften). Die traditionelle hyperspektrale Bildgebung beim Emissionsscannen leidet jedoch unter langsamen Erfassungszeiten und niedrigen Signal-Rausch-Verhältnissen aufgrund der notwendigen Filterung sowohl von Anregungs- als auch von Emissionslicht. Es wurde bereits gezeigt, dass die hyperspektrale Bildgebung beim Anregungsscannen die erforderliche Erfassungszeit reduziert und gleichzeitig das Signal-Rausch-Verhältnis der erfassten Daten erhöht. Mit kommerziell erhältlichen Geräten beschreibt dieses Protokoll, wie ein hyperspektrales Mikroskopkopiesystem für die Anregung, das Scannen von Hyperspektralbildern zusammenbaut, kalibriert und verwendet wird, um Signale von mehreren Fluoreszenzquellen in einer einzigen Probe zu trennen. Obwohl diese Technik für die mikroskopische Bildgebung von Zellen und Geweben sehr anwendbar ist, kann sie auch für jede Art von Experiment mit Fluoreszenz nützlich sein, bei dem es möglich ist, Anregungswellenlängen zu variieren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: chemische Bildgebung, Umweltanwendungen, Augenpflege, Lebensmittelwissenschaft, Forensik, Medizin und Mineralogie.

Mehrere wichtige Schritte aus diesem Protokoll sind notwendig, um die Sammlung von Daten sicherzustellen, die sowohl genau als auch ohne Bildgebung und spektrale Artefakte sind. Das Überspringen dieser Schritte kann dazu führen, dass Daten signifikant erscheinen, aber nicht mit einem anderen spektralen Bildgebungssystem überprüft oder reproduziert werden können, wodurch alle Schlussfolgerungen, die mit diesen Daten gemacht wurden, effektiv zunichte gemacht werden. Zu diesen wichtigen Schr...

Spektrale Bildgebung hat sich zu einer zuverlässigen Lösung für die Identifizierung und Trennung mehrerer Fluoreszenzsignale in einer einzigen Probe und kann Signale von Interesse leicht von Hintergrund- oder Autofluoreszenz unterscheiden. Die hyperspektrale Bildgebung beim Erregungsscannen verbessert diese Technik, indem die erforderliche Bildaufnahmezeit verringert und gleichzeitig das Signal-Rausch-Verhältnis erhöht wird.

Excitation-Scanning Hyperspektrale Bildgebungsmikroskopie zur effizienten Unterscheidung von Fluoreszenzsignalen

Several techniques rely on detection of fluorescence signals to identify or study phenomena or to elucidate functions. Separation of these fluorescence ...

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es eine Methode beschreibt, die verwendet werden kann, um mehrere fluoreszierende Signale in einer einzigen Probe zu trennen. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden kann das Anregungsscannen die Geschwindigkeit des Experiments erhöhen und die Empfindlichkeit der Daten verbessern. Durch die Verwendung verschiedener Beleuchtungsquellen, wie z. B. eines Superkontinuumlasers, kann diese Methode auf Spinnscheiben- oder Laserscanning-Konfokalmikroskopsysteme anwendbar sein.Bei der Durchführung von Anregungsscans, der spektralen Bildgebungsmikroskopie, ist es wichtig zu überprüfen, ob der Anregungsspitzenwert jedes fluoreszierenden Etiketts bei einer anderen Wellenlänge auftritt. Richten Sie zunächst ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop und eine Kamera ein, wie im Textprotokoll beschrieben. Dann laden Sie die Probe auf die Bühne.Wählen Sie im Dropdown-Menü des Mikromanager-Hauptfensters 475 Nanometer für die erstmalige Probenanzeige aus. Doppelklicken Sie dann auf das Feld neben der Belichtung und geben Sie 100 ein, um die Belichtungszeit auf 100 Millisekunden einzustellen. Klicken Sie schließlich auf Live, um das Beispiel anzuzeigen.Klicken Sie nun auf Auto. Die Schaltfläche für den automatischen Intensitätsbereich, um die minimalen und maximalen Werte in aussagekräftige visuelle Bereiche zu bringen. Verwenden Sie als Nächstes die Fokusknöpfe des Mikroskops, um die Probe zu fokussieren.Passen Sie nach dem Fokus die Position des Beispiels so an, dass sich die Kante in der Mitte des Sichtfelds befindet. Dann feinabstimmen den Fokus. Das Beispiel steht im Fokus, wenn die Kanten-Features im Bild scharf erscheinen.Öffnen Sie nun das mehrdimensionale Erfassungstool. Klicken Sie im Menü auf die Ladetaste, und wählen Sie eine voreingestellte Einstellung aus, die einen geeigneten Wellenlängenbereich für die Spektralerfassung enthält. Nachdem die Erfassungseinstellungen bestätigt wurden, wechseln Sie zu einem leeren Bereich der Probe, und klicken Sie auf Abrufen, um einen Spektralbildstapel zu sammeln, der Hintergrund und Rauschen enthält, der später für die Subtraktion verwendet werden soll.Bewegen Sie sich dann in der Stichprobe, um die hellsten Bereiche zu finden. Proben haben wahrscheinlich eine intensivere Fluoreszenz afern vom Rand der Probe. Sobald sich der hellste Bereich befindet, nehmen Sie einen einzelnen Bildstapel.Laden Sie das aufgenommene Bild in Bild J, und verwenden Sie die Messfunktion von Bild J, um zu bestätigen, dass keine Wellenlängen überbelichtete Pixel enthalten. Wenn eine reduzierte Belichtungszeit aufgrund einer Überbelichtung erforderlich ist, sollte das Hintergrundbild auch mit einer neuen Belichtungszeit zurückgenommen werden. Wenn eines der Bilder die Aufwärtserkennungsgrenze der Kamera enthält, passen Sie die Belichtungszeit des Spektralscans an, um sicherzustellen, dass das maximale Signal im gesamten Spektralbereich den Dynamikbereich der Kamera nicht überschreitet.Wenn nun eine angemessene Belichtungszeit ermittelt wird, legen Sie eine unbeschriftete Probe auf die Bühne. Erfassen Sie spektrale Bilddaten aus der nicht beschrifteten Probe, um festzustellen, ob eine zugrunde liegende Autofluoresenz vorhanden ist. Legen Sie dann eine einbeschriftete Probe auf die Bühne.Erfassen Sie spektrale Bilddaten aus jedem der einzeln beschrifteten Samples, um sie als Spektralsteuerelemente zum Erstellen einer Spektralbibliothek zu verwenden. Führen Sie den Scan für jede Kontrollprobe mit einer identischen Belichtungszeit des Wellenlängenbereichs und Kameraeinstellungen durch. Legen Sie als Nächstes ein Dia mit der experimentellen Probe auf das Mikroskop.Wählen Sie ein Sichtfeld aus, das zellenentsprechend beschriftet hat, und erfassen Sie die Spektralbilddaten aus der Stichprobe mithilfe der ermittelten Erfassungseinstellungen. Korrigieren Sie Bilder auf eine flache spektrale Reaktion, indem Sie das Hintergrundspektrum vom Beispielbild subtrahieren und das Bild mit dem Korrekturkoeffizienten multiplizieren. Hier wird ein MATLAB-Skript verwendet, um die Bilder schnell zu verarbeiten.Generieren Sie als Nächstes die Spektralbibliothek. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, normalisieren Sie jedes Endelement auf das Wellenlängenband der größten Intensität, indem Sie bestimmen, welches Wellenlängenband den intensivsten Wert hat, und die Messung bei jedem Wellenlängenband durch diesen Maximalwert dividieren. Speichern Sie dann die Spektraldaten als dat-Datei.Wenn sie abgeschlossen sind, entvermischen Sie die Spektralbilddaten. Der Unmixing-Schritt erzeugt ein Häufigkeitsbild für jedes fluoreszierende Etikett, wobei Die Häufigkeit die Menge des relativen Fluoreszenzsignals im Bild vom prospektiven Etikett ist. Öffnen Sie anschließend jedes ungemischte Bild, um die Verteilung reiner Komponenten visuell zu überprüfen.Vergleichen Sie die Größe des Fehlerbildes mit der Größe der nicht gemischten Bilder. Wenn die Größe des Fehlerbildes den ungemischten Häufigkeitsbildern ähnelt, werden Signale in den Spektralbilddaten möglicherweise nicht genau berücksichtigt. Überprüfen Sie schließlich, ob keine nicht identifizierten Residuenstrukturen vorhanden sind, indem Sie das Fehlerbild mit den nicht gemischten Bildern vergleichen.Bei korrekter Verarbeitung ermöglicht der spektrale Unmixprozess die Trennung eines Spektralbildstapels in die jeweiligen Beiträge von jedem Fluoreszenzetikett. Hier ein ungemischter Spektralbildmitmittmit, der auf die glatte Muskelzellautofluoreszenz der Atemwege hinweist, eine GCaMP-Sonde und ein mitochondriales Etikett. Es gibt einen hohen Fehler, der mit den kerntechnischen und perinuklearen Regionen der Zellen verbunden ist, was darauf hindeutet, dass die gemessenen Spektren dieser Regionen nicht gut durch die Spektren in der Spektralbibliothek berücksichtigt werden.Reine Spektren, die aus beschrifteten Zellen gesammelt werden, die auch autofluoreszierend sind, werden wahrscheinlich das Spektralprofil für die reine Komponente kontaminieren. Hier kann man den Unterschied der Unmischung mit reinen Spektren sehen, die mit Autofluoreszenz kontaminiert sind, im Vergleich zu den korrigierten reinen Spektren nach skalierter Subtraktion. Die richtige Datenerfassung ist bei der Abbildung empfindlicher Proben unerlässlich, da sie im Gegensatz zum Hintergrund und den Steuerelementen, die möglicherweise neu abgebildet werden, nur eine einzelne Bildgebungssitzung überstehen.Stellen Sie sicher, dass die richtigen Hardware- und Erfassungseinstellungen so weit wie möglich vorgegeben sind. Als nächster Schritt können Videos, die aus Zeitrafferdaten erstellt wurden, die mit diesem System erfasst wurden, verwendet werden, um fluoreszierende Quellen an diskreten Orten im Laufe der Zeit zu verfolgen, z. B. durch die Lokalisierung des zweiten Messenger-Signals. Achten Sie darauf, wenn Sie leistungsstarke Lichtquellen verwenden, um Augeneinwirkung zu vermeiden.Achten Sie auch darauf, beim Umgang mit biologischen Etiketten die richtigen Handschuhe zu tragen.

excitation-scanning-hyperspectral-imaging-microscopy-to-efficiently

Research

Forschung

JoVE Journal

Engineering

Ingenieurwesen

Wir demonstrieren die Verwendung von Fluoreszenz-Photoaktivierungs-Lokalisierungsmikroskopie (FPALM), um gleichzeitig mehrere Arten von fluoreszenzmarkierten Molekülen in Zellen abzubilden. Die beschriebenen Techniken ermöglichen die Lokalisierung von Tausenden bis Hunderttausenden einzelner fluoreszierend markierter Proteine mit einer Genauigkeit von Dutzenden von Nanometern innerhalb einzelner Zellen.

Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie

Amyloid-Ablagerungen ist ein Markenzeichen von verschiedenen Krankheiten und viele andere Organe befällt. Dieses Papier beschreibt die Anwendung der leuchtenden konjugierte Oligothiophene Fluoreszenz Färbung in Kombination mit Fluoreszenz-Mikroskopie-Techniken. Diese Färbung Methode darstellt, ein leistungsstarkes Tool für die Erkennung und Erforschung von Proteinaggregaten in klinischen und wissenschaftlichen Einrichtungen.

Imaging-Amyloid Gewebe gebeizt mit lumineszierenden konjugierte Oligothiophenes von hyperspektralen konfokalen Mikroskopie und Fluoreszenz Lifetime Imaging

Hier präsentieren wir Ihnen eine praktische Anleitung für eine integrierte Mikroskopie Bausystem, das konventionelle Epi-fluoreszierende Bildgebung, Einzelmolekül-Erkennung-basierte Höchstauflösung Bildgebung und Multi-Color Einzelmolekül-Erkennung übergeht, einschließlich Einzelmolekül-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer imaging, in einer Aufspannung auf kostengünstige Weise.

Durchführung von mehreren Imaging-Modi mit einem Fluoreszenzmikroskop

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um lumineszierende hyperspektrale Bildgebungsdaten zu erhalten und optische Anisotropie-Features von Lanthanid-basierten Einzelkristallen mit einem Hyperspektral Imaging System zu analysieren.

Hyperspektrale Bildgebung als Werkzeug zur Untersuchung der optischen Anisotropie in Lanthanid-basierten molekularen Einzelkristallen

Dieser Artikel stellt die Integration eines spektralfokussierenden Moduls und eines Dual-Output-Pulslasers vor, der eine schnelle hyperspektrale Bildgebung von Goldnanopartikeln und Krebszellen ermöglicht. Diese Arbeit zielt darauf ab, die Details multimodaler nichtlinearer optischer Techniken auf einem Standard-Laserscanning-Mikroskop zu demonstrieren.

Biomolekulare Bildgebung der zellulären Aufnahme von Nanopartikeln mittels multimodaler nichtlinearer optischer Mikroskopie

Dieses Papier vergleicht direkt die Auflösung, Empfindlichkeit und Bildkontraste der stimulierten Raman-Streuung (SRS) und der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS), die in dieselbe Mikroskopplattform integriert sind. Die Ergebnisse zeigen, dass CARS eine bessere räumliche Auflösung hat, SRS bessere Kontraste und spektrale Auflösung liefert und beide Methoden eine ähnliche Empfindlichkeit aufweisen.

Direkter Vergleich der hyperspektralen stimulierten Raman-Streuung und der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streumikroskopie für die chemische Bildgebung

Es wurde ein multimodales, schnelles hyperspektrales Bildgebungssystem entwickelt, um breitbandige VSFG-Bilder (Vibrational Sum-Frequency Generation) zusammen mit Hellfeld-Bildgebungsmodalitäten der zweiten harmonischen Erzeugung (SHG) zu erhalten. Da die Infrarotfrequenz mit molekularen Schwingungen in Resonanz steht, werden mikroskopische strukturelle und mesoskopische morphologische Erkenntnisse über symmetriefähige Proben enthüllt.

Multimodale nichtlineare hyperspektrale chemische Bildgebung mit Line-Scanning-Schwingungssummen-Frequenz-Generierungsmikroskopie

Unter Verwendung einer multimodalen Plattform, die markierungsfreie optische Bildgebungsmodalitäten kombiniert, haben wir ein Protokoll zur Visualisierung und Quantifizierung der zellulären Dynamik und des Stoffwechsels entwickelt. Durch Bildgebung mittels Multiphotonenfluoreszenz, Erzeugung der zweiten Harmonischen und stimulierte Raman-Streumikroskopie können wir einen ganzheitlichen Überblick über die zelluläre und molekulare Umgebung erhalten.

Multimodale optische Bildgebungsplattform zur Untersuchung des zellulären Stoffwechsels

Spectral Iterative Bleaching Extends Multiplexity (IBEX) baut auf der Basis-IBEX-Technik auf, indem es Heparin-Blocking hinzufügt, um unspezifische Bindungen zu minimieren, und die spektrale Detektion mit computergestützter Entmischung nutzt, um die Autofluoreszenz zu unterdrücken. Dieser Ansatz beschleunigt die Bildaufnahme bei gleichzeitiger Reduzierung von Hintergrundquellen und ermöglicht robuste mehrstufige räumliche Proteomanalysen mit hohen Parametern.

High-Plex-Bildgebung mittels spektral-konfokaler Mikroskopie zur Minimierung unspezifischer Gewebefluoreszenz

Ein dynamisches Phantom mit mehreren Kompartimenten wird verwendet, um einige biologische Aspekte zu simulieren, die für Stoffwechselstudien mit hyperpolarisierten Magnetresonanzmitteln von Interesse sind.

Die Verwendung eines Mehrfach Dynamische einzelner Enzym-Phantom für Studien von hyperpolarisiertem Magnetic Resonance Agents

Lernen Sie die Anregungs-Scanning-Hyperspektralbildgebung zur effizienten Trennung mehrerer Fluoreszenzsignale in einer Probe. Diese Methode erhöht die Geschwindigkeit und Empfindlichkeit gegenüber traditionellen Verfahren.

Excitation-Scanning Hyperspektrale Bildgebungsmikroskopie zur effizienten Unterscheidung von Fluoreszenzsignalen

Weitere Videos entdecken