Hochauflösende Bildgebung von Kerndynamik in Live-Zellen unter Uniaxialer Tensile-Straße
2. Juni 2019
Mit Hilfe eines zuvor entwickelten Geräts zur mechanischen Belastung von Anbauzellen beschreibt dieser Beitrag eine neu gestaltete Substratum-Geometrie und ein maßgeschneidertes Gerät zur hochauflösenden Einzeller-Abbildung von angespannten Zellen mit einem 100x Öl-Immersionsziel.
Wir haben bereits ein Gerät entwickelt, um mechanische Dehnungaufhalten auf haftende Zellen anzuwenden. In der aktuellen Arbeit haben wir die Geometrie des Substratums neu gestaltet und das Setup für die hochauflösende Bildgebung dieser Stammzellen angepasst. Der Hauptvorteil dieses Zell-Stretching-Systems ist, dass es eine hochauflösende subzelluläre Bildgebung bei 100-fachen der Stammzellen bietet.
Die Substratum-Fertigung demonstriert Vicki, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor. Beginnen Sie mit dem Entwerfen einer Single-Well-Polydimethylsiloxan-Form, indem Sie dem begleitenden Textprotokoll folgen. Als nächstes mischen Sie 20 Teile einer Polydimethylsiloxan-Basis mit einem Teilhärtungsmittel in einem Einwegbecher.
Nach dem Mischen die Polydimethylsiloxan-Mischung in einen Vakuum-Engasser bei 0,8 bar für 30 Minuten legen, um die Blasen aus der Mischung zu entfernen. Dann gießen Sie die Polydimethylsiloxan-Mischung in die Form und die Schale. Entfernen Sie in dieser Phase alle zusätzlichen Blasen, indem Sie sie 30 Minuten lang bei 0,8 bar Vakuum wieder entgasen.
Wenn die Entgasung abgeschlossen ist, backen Sie die Proben bei 80 Grad Celsius auf einem Nivellierungstisch für zwei Stunden. Als nächstes entfernen Sie die Proben vorsichtig aus dem Ofen und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen. Schneiden Sie die Kanten mit einer Klinge und schälen Sie das ausgehärtete Polydimethylsiloxan vorsichtig heraus.
Zeichnen Sie auf dem Polydimethylsiloxan mit einem Durchmesser von 150 Millimetern ein zwei Zentimeter mal zwei Zentimeter großes Gitter mit einem Marker. Zeichnen Sie innerhalb jedes Quadrats einen Zentimeter mal einen Zentimeter Quadrat, so dass auf allen Seiten ein Rand von 0,5 Zentimetern übrig bleibt. Verwenden Sie eine Klinge, um sorgfältig entlang der Linien zu schneiden und quadratische Fächer zu erhalten.
Als nächstes reinigen Sie die Proben, indem Sie sie vier Stunden lang in 100% Aceton, für weitere vier Stunden 100% Ethanol und dann vier Stunden lang in autoklaviertem Wasser gießen. Legen Sie die gereinigten Proben auf Paraffinfolienunterlagepapier in eine Kunststoffschale mit einem Durchmesser von 150 Millimetern und trocknen Sie die Probe vier Stunden lang in einem 80-Grad-Celsius-Ofen. Wenn Sie fertig sind, versiegeln Sie die Gerichte mit Paraffinfolie und lagern Sie sie bis zur weiteren Verwendung in einem Kühlraum.
Bereiten Sie Vorläuferzellen vor und suspendieren Sie sie im Proliferationsmedium. Säen Sie diese Zellen mit einer Dichte von 35.000 Zellen pro Quadratzentimeter auf PDL-beschichtete Kunststoffoberflächen. Passen Sie das Volumen des Proliferationsmediums auf drei Milliliter pro zehn Zentimeter Quadratfläche an.
Ein geringeres Medienvolumen kann zu Zellverklumpung führen, die durch Oberflächenspannungskräfte entsteht, während ein höheres Medienvolumen in den Schalen dazu führen kann, dass die Medien überschwappen. Am dritten Tag nach der Aussaat die Zellen ernten und mit einem Hämozytometer zählen. Dann Samen 35 000 Zellen pro Polydimethylsiloxan-Platte mit 700 Mikroliter Proliferationsmedium.
Als Nächstes fügen Sie ein Plasmisches Konstrukt hinzu, um die Histon-H2B-Komplexe der Zelle mit grünem fluoreszierendem Protein zu beschriften, indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen. Montieren Sie nach 24 Stunden die Polydimethylsiloxan-Proben mit Zellen, die auf der uniaxialen Dehnungsvorrichtung gedehnt werden sollen. Ändern Sie dann das Medium in allen Proben in Differenzierungsmedium.
Messen Sie die untrainierte Zellkompartimentlänge und drehen Sie die Bühnenmikrometerschraube, um die Zellfachlänge um die gewünschte Dehnung zu erhöhen. Lassen Sie die gestreckten und ungestreckten Polydimethylsiloxan-Proben im Inkubator bei 37 Grad Celsius bis zur Bildgebung. Bereiten Sie den Mikroskop-Inkubator für die Live-Bildgebung vor, indem Sie die Inkubatortemperatur auf 37 Grad Celsius einstellen.
Als nächstes bringen Sie ein 100-faches Öl-Immersionsziel in die zentrale Position, da die objektive Drehung später nicht mehr zugänglich sein wird. Sobald sie in Position sind, schrauben Sie das Objektiv ab und schrauben Es mit einem Objektivring wieder zusammen, damit das Ziel näher an die Zellen gebracht werden kann. Fügen Sie dann einen Tropfen Öl zum Ziel hinzu.
Mit einem kundenspezifisch bedruckten Halter den Halter mit Vakuumfett am Rand des Fensters beschichten und eine Nummer Null Dicke Glasabdeckung auf die Oberseite des Halters legen. Kleben Sie das Kunststofffenster auf die Mikroskopbühne. Als nächstes schrauben Sie eine Z-Übersetzungsstufe auf die Mikroskopstufe und bewegen Sie sie in die oberste Z-Position.
Entfernen Sie 500 Mikroliter des Mediums von der zu bebilderten gestreckten Polydimethylsiloxanplatte, und fügen Sie dieses Medium auf den Glasdeckel im weißen Kunststofffenster ein. Verwenden Sie dann eine sterile Pinzette, um das quadratische Fach vorsichtig von der Polydimethylsiloxan-Platte zu lösen. Halten Sie die Dehnungsvorrichtung in einer aufrechten Position, so dass die Zellen nach oben, über dem weißen Kunststofffenster und vorsichtig invertieren sie die Dehnungsvorrichtung, so dass jedes zusätzliche Medium direkt in der Mitte der Glasabdeckung mit nach unten gerichteten Zellen abfallen kann.
Legen Sie den unteren Teil des Zuggeräts mit doppelseitigem Klebeband auf die Z-Übersetzungsstufe, um ihn an Ort und Stelle zu halten. Beim Blick durch das Okular unter hellem Feld, sehr langsam bringen Sie das Dehnungsgerät nach unten und bewegen Sie das Ziel nach oben, um sich auf die Zellen zu konzentrieren. Führen Sie diesen Fokussierungsschritt langsam durch, indem Sie zwischen dem Absenken der Z-Übersetzungsstufe und der Erhöhung des Ziels wechseln.
Wenn die Z-Übersetzungsstufe zu stark absinkt, könnten die Zellen komprimieren und damit absterben. Wenn wir das Ziel zu hoch anheben, könnte es den Glasdeckel brechen und das Medium auslaufen lassen. Scannen Sie die Polydimethylsiloxan-Platte in X- und Y-Richtung, um eine Zelle zu finden, die einen fluoreszierenden Kern hat, mit Epifloreszenz bei 488 Nanometern Anregung.
Stellen Sie außerdem sicher, dass die Zelle über eine geeignete Morphologie verfügt, wenn Sie die Probe unter hellem Feld betrachten. Zeichnen Sie Weitfeld- oder Offenelochbilder des Kerns mit 488 Nanometern Wellenlängenanregung und der Zelle mit Hellfeldanregung in 30-Sekunden-Intervallen pro Frame für eine Gesamtdauer von mindestens 30 Minuten auf. Die neu gestaltete Geometrie des Polydimethylsiloxan-Substrats und das in diesem Video gezeigte Bildgebungs-Setup minimiert den Abstand zwischen den Zellen und dem Objektiv.
Dies ermöglicht eine Zeitraffer-Bildgebung von fluoreszierend markierten Zellkernen mit einem 100-fachen Öl-Immersion-Objektiv. Um die nuklearen Schwankungen zu messen, planen Sie zuerst das Kerngebiet im Vergleich zur Zeit. Dann detrendieren Sie die Daten mit einem Polynom dritter Ordnung.
Und schließlich, diagramm Restschwankungen und berechnen Standardabweichung der Restschwankungen. Die nuklearen Schwankungen der Oligodendrozytor-Vorläuferzellen nach chemischer Induktion der Differenzierung mit und ohne 10%Zugstamm zeigen, dass bei chemischer Induktion allein die Amplitude von Kernschwankungen bei 48 Stunden, aber nicht bei 24 Stunden signifikant abnahm. Auf der anderen Seite zeigte die chemische Induktion zusammen mit einem 10%stensiven Stamm einen signifikanten Rückgang nach 24 Stunden, der ohne weitere Reduktion bei 48 Stunden konstant blieb.
Das Wichtigste, was man sich merken sollte, ist, dass der Arbeitsabstand des gewählten Ziels gleich oder größer sein sollte als die Tiefe des Zellfachs plus die Dicke des Deckels. Das Substratum kann neu gestaltet werden, um ein Raster zu integrieren, das die Bildgebung derselben Zelle vor und nach der Anwendung des Stammes erleichtern würde, da ein Vorher-Nachher-Dataset-Typ das Rauschen reduziert, das durch experimentelle Fehler entsteht. Mit diesem bildgebenden Setup können viele subzelluläre Phänomene innerhalb anhaftender Lebendzellen, wie die Proteinlokalisierung oder die Dynamik zellulärer Komponenten, innerhalb von Sekunden nach der Anwendung der mechanischen Dehnung abbilden.
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Übersicht
Diese Studie stellt eine neu gestaltete Substratgeometrie und eine angepasste Vorrichtung zur Anwendung mechanischer Dehnung auf adhärente Zellen vor. Die Einrichtung ermöglicht die hochauflösende Einzelzell-Bildgebung unter Verwendung eines 100x-Ölimmersionsobjektivs.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Anwendung mechanischer Dehnung
- Hochauflösende Bildgebung
Hintergrund
- Mechanische Dehnung kann das zelluläre Verhalten beeinflussen.
- Die hochauflösende Bildgebung ist entscheidend für die Untersuchung zellulärer Reaktionen.
- Bisherige Vorrichtungen zur Aufbringung von Dehnung weisen Einschränkungen auf.
- Die Neugestaltung des Substrats kann die Bildgebungsfähigkeiten verbessern.
Zweck der Studie
- Verbesserung des Designs einer Vorrichtung zur Aufbringung mechanischer Dehnung.
- Ermöglichung der hochauflösenden Bildgebung von gedehnten Zellen.
- Veranschaulichung der Herstellung eines neuen Substrats.
Verwendete Methoden
- Neugestaltung der Substratgeometrie.
- Anpassung der Abbildungsvorrichtung.
- Verwendung eines 100x-Ölimmersionsobjektivs zur Abbildung.
- Protokoll zur Herstellung einer Polydimethylsiloxan-Form.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Neugestaltung der Substratgeometrie.
- Hochauflösende Abbildung mit dem neuen Aufbau erreicht.
- Nachweis einer wirksamen Anwendung mechanischer Dehnung.
- Protokoll zur Herstellung der Form bereitgestellt.
Schlussfolgerungen
- Das neue Gerät verbessert die Untersuchung zellulärer Reaktionen auf mechanische Dehnung.
- Mithilfe der hochauflösenden Bildgebung ist eine detaillierte Analyse belasteter Zellen möglich.
- Zukünftige Studien können auf dieser verbesserten Methodik aufbauen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Diese Methode ermöglicht die hochauflösende Bildgebung lebender Zellen unter mechanischer Belastung und unterstützt damit mechanistische Untersuchungen zellulärer Reaktionen, die für das Gewebeengineering und die regenerative Medizin relevant sind. Durch die ermöglichte subzelluläre Visualisierung während aufgebrachter Zugspannung trägt sie dazu bei, Zielhypothesen im Zusammenhang mit Mechanotransduktionswegen risikoärmer zu gestalten. Der Ansatz bietet eine prädiktive Aussagekraft zur Identifizierung von Substanzen, die die belastungsinduzierte Differenzierung in Vorläuferzellpopulationen modulieren.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Visualisierung nuklearer Dynamiken in lebenden oligodendrozytären Vorläuferzellen unter mechanischer Belastung.
- Operativer Wert: Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung durch zeitraffende Aufnahmen fluoreszenzmarkierter Kerne, um die Belastung mit phänotypischen Veränderungen zu korrelieren.
- Prädiktiver Wert: Steigert das Vertrauen in die Zielinteraktion, indem mechanische Reize mit nuklearen Fluktuationen verknüpft werden, die mit Differenzierungsvorgängen assoziiert sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Verbindungsscreening vor, indem eine reproduzierbare Plattform zur Abbildung von Belastungen etabliert wird.
- Quantitative Ausgaben: Erzeugt messbare Daten zur Kernfläche und deren Schwankungen über die Zeit, wodurch ein objektiver Vergleich zwischen verschiedenen Bedingungen ermöglicht wird.
- Skalierbarkeit: Verwendet ein substratintegriertes Rasterdesign, um die Verfolgung identischer Zellen vor und nach Belastung zu erleichtern, wodurch experimentelle Störgrößen reduziert und die Robustheit des Assays verbessert werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert die Differenzierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, ein Prozess, der für demyelinisierende Erkrankungen wie multiple Sklerose von Bedeutung ist.
- Translationale Kontinuität: Verbindet entdeckungsphasenbezogene mechanobiologische Beobachtungen mit präklinischer Validierung, indem quantifizierbare, bildbasierte Endpunkte bereitgestellt werden.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Unterstützt Go/No-Go-Kriterien, indem spannungsabhängige Veränderungen in der nukleären Dynamik identifiziert werden, die Differenzierungsresultate vorhersagen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Kontinuum von der Entdeckung bis zur präklinischen Phase ein, ermöglicht Hypothesentests in der frühen Entdeckungsphase und unterstützt die Assay-Entwicklung zur Leitsubstanz-Identifizierung durch quantifizierbare, bildgebende Messgrößen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen durch die Visualisierung zeitgleicher nukleärer Reaktionen auf mechanische Belastung in lebenden Zellen.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch standardisierte, reproduzierbare Abbildung subzellulärer Dynamiken unter kontrollierten Belastungsbedingungen.
- Analytik: Bietet quantitative Messungen nukleärer Fluktuationen mittels Zeitrafferaufnahmen und Restanalysen und erleichtert damit den Vergleich verschiedener Bedingungen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Forschung, indem es ein krankheitsrelevantes System zur Untersuchung der Mechanotransduktion in Vorläuferzellen bereitstellt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Dient als wiederverwendbare Bildgebungsplattform, die über die nukleäre Dynamik hinaus auf verschiedene adhärente Zelltypen und subzelluläre Zielstrukturen anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unklarheiten in spannungsinduzierten Differenzierungswegen verringert werden.
- Operationaler Wert: Bietet Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch ein gitterbasiertes Substrat und einen konsistenten Aufbau der Bildgebung.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem ein frühzeitiges Absichern von Mechanobiologie-Zielen vor kostspieligen präklinischen Investitionen ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem Verbindungen identifiziert werden, die spannungsabhängige nukleare Dynamiken in Vorläuferzellen modulieren.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Zellkultur, fluoreszenter Markierung und Live-Cell-Imaging unter mechanischer Belastung.
- Hängt von der Verfügbarkeit von 100x-Ölimmersionsobjektiven, Vakuum-Entgasern und auf dem Mikroskoptisch montierten Dehnungsapparaturen ab.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg, um eine konsistente Anwendung der Dehnung und der Bildaufnahmeparameter in verschiedenen Laboren zu gewährleisten.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen beim Übergang vom gitterbasierten Substrat auf verschiedene Zelltypen oder Kultivierungsformate.
- Umfasst praktische Einschränkungen, wie beispielsweise die Notwendigkeit einer präzisen Fokuskontrolle, um Zellkompression oder Beschädigungen der Deckgläser während der Bildaufnahme zu vermeiden.
