Dreidimensionales Pattern von Ingenieurbiofilmen mit einem Do-it-yourself-Bioprinter

3D-Bioprinting mit Bakterien ist eine neu entwickelte Technik. Dieses Protokoll bietet eine einfache Möglichkeit, technische Biofilme 3D mit Bakterien gedruckt zu konstruieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, 3D-gedruckte Biofilme mit einem kostengünstigen selbstgebauten 3D-Drucker herzustellen.

Eine mögliche Anwendung unseres 3D-Druckers ist die Erstellung reproduzierbarer Modellbiofilme, mit denen neue antibakterielle Therapien entwickelt werden können. Unser 3D-Druckansatz kann auf jede Art von Bakterien angewendet werden, die mit unserem Alginat-basierten Bioink kompatibel sind. Die Vorbereitung des Bioinks und der Drucksubstrate sind ziemlich Standardverfahren, während der 3D-Druckprozess, insbesondere die Kalibrierung der Z-Achse, ein entscheidender Schritt ist, der einige Spractice erfordert.

Die Kalibrierung der eingestellten Zugriffshöhe beeinflusst die Auflösung unseres 3D-Druckers und ist stark von persönlichen Erfahrungen abhängig. Dieses Verfahren erfordert manuelle Anpassungen, und es ist schwierig, in einem schriftlichen Format beschrieben zu werden. Schließen Sie eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze an eine Länge von Silikonschläuchen an und montieren Sie die Pipettenspitze als Ersatz für den Originalextruder auf den Extruderkopf des 3D-Druckers.

Als nächstes vier Milliliter einer fünf mollaren Calciumchloridlösung zu 400 Millilitern von 1%Agar in Luria-Bertani-Brühe gelöst hinzufügen, und ergänzen Sie es mit den entsprechenden Antibiotika und Induktoren. Dann 20 Milliliter der LB-Agarlösung in jede 150-Millimeter-mal 15-Millimeter-Petrischale geben. Trocknen Sie die Schale für 30 Minuten bei Raumtemperatur, mit dem Deckel halb geöffnet.

Bereiten Sie eine 3%Natriumalginat-Lösung vor und erhitzen Sie sie dreimal bis zum Siedepunkt, um die Lösung zu sterilisieren. Dann lagern Sie die sterile Lösung bei vier Grad Celsius, bis sie verwendet wird. Um die bakterielle Komponente des Bioinks vorzubereiten, wachsen E.coli-Bakterien, die Plasmide für die konstitutive GFP-Expression in 50 Milliliterlb-Medium tragen, das Antibiotika enthält.

Schütteln Sie die Kultur bei 250 RPM und 37 Grad Celsius über Nacht. Nach dem über Nacht Wachstum der Kultur, pellet die Bakterien für fünf Minuten bei 3, 220 mal Schwerkraft und dann entfernen Sie den Überstand. Setzen Sie das Bakterienpellet in 10 Milliliter LB Medium, und fügen Sie 10 Milliliter 3%Natriumalginat.

Schließen Sie den 3D-Drucker an einen Computer an, und öffnen Sie die 3D-Drucksoftware. Klicken Sie auf die Schaltfläche Home für die X-, Y- und Z-Achse, um den Druckkopf an seine Heimatposition zu verschieben. Legen Sie für jeden Druck ein vorbereitetes Drucksubstrat auf eine bestimmte Stelle auf dem Druckbett.

Heben Sie den Druckkopf unter manueller Kontrolle auf eine Höhe von über 22 Millimetern an, damit er während der Bewegung nicht mit der Kante der Petrischale kollidiert. Positionieren Sie den Druckkopf über der Oberseite der Platte, und bewegen Sie ihn nach unten, bis die Pipettenspitze die Druckfläche kontaktiert. Weisen Sie diese Z-Achsenposition als Z1, die Höhe der Druckfläche, zu.

Heben Sie anschließend den Druckkopf an und bewegen Sie ihn manuell außerhalb des Plattenbereichs. Wenn der Arbeitsabstand zwischen Druckkopf und Plattenoberfläche als Z2 definiert ist, geben Sie die Höhe der Druckfläche plus den Arbeitsabstand als Z-Wert während des Druckvorgangs in das Druckprogramm ein. Laden Sie eine vorprogrammierte G-Code-Datei mit Befehlen zum Drucken der gewünschten Form.

In jeder Befehlszeile kann die Position des Druckkopfes in den X-, Y- und Z-Achsen geändert werden. Achten Sie darauf, den Z-Wert während aller Druckschritte als Höhe der Druckfläche plus Arbeitsabstand einzugeben. Laden Sie die flüssige Bioink in Spritzen und montieren Sie sie in die Spritzenpumpe des 3D-Biodruckers.

Legen Sie dann die Extrusionsgeschwindigkeit auf 0,3 Milliliter pro Stunde fest. Drucken Sie den Bioink auf das Drucksubstrat, indem Sie auf die Schaltfläche Drucken klicken. Warten Sie, bis die Spritzenpumpe gestartet wird, bis der Druckvorgang begonnen hat und bevor der Druckkopf mit der Druckoberfläche in Berührung kommt.

Steuern Sie während des Druckvorgangs die Druckkopfbewegung vollständig durch die Software. Stoppen Sie die Spritzenpumpe, sobald der Druckkopf am letzten Druckpunkt ankommt, da sonst überschüssige swertige Bioink auf das Drucksubstrat fällt und die Druckauflösung reduziert wird. Für den Aufbau von 3D-Strukturen werden alle Bewegungen des Druckkopfes im G-Code-Editor gesteuert.

Um die Druckhöhe für die zweite Ebene zu erhöhen, geben Sie die Druckhöhe der ersten Ebene ein, und erhöhen Sie den Z-Wert im Code um 0,2 Millimeter. Erhöhen Sie anschließend den Z-Wert um 0,1 Millimeter, wenn Sie auf eine höhere Ebene wechseln. Inkubieren Sie die gedruckten Proben drei bis sechs Tage bei Raumtemperatur, um die Herstellung der Biofilmkomponenten wie Curlifasern zu ermöglichen.

Legen Sie dann die Platte auf einen Fluoreszenzscanner und bebildern Sie die Platten. Um die Alginatmatrix aufzulösen, 20 Milliliter einer 0,5-molaren Natriumcitratlösung bei pH 7 auf das gedruckte Substrat geben. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für zwei Stunden, während sie bei 30 Umdrehungen pro Minute schüttelt.

Dann entsorgen Sie die Flüssigkeit und stellen Sie die Platten wieder ab, um sie mit den Bildern der Platten vor und nach der Citratbehandlung zu vergleichen. Der 3D-Bioprinter kann Bakterien erzeugen, die Hydrogele in einer Vielzahl von zweidimensionalen und dreidimensionalen Formen verkapseln. Anhand dieser gedruckten Formen kann dann beurteilt werden, ob die Bildung von Biofilm erfolgreich war oder ob die Alginatmatrix mit einer Natriumcitratlösung vollständig gelöst wird.

Bei Bioink ohne das induzierbare Curli-Produktionsplasmid wurde das gedruckte Muster nach der Natriumcitratbehandlung vollständig aufgelöst, was bedeutet, dass sich kein Biofilm-Curli-Netzwerk gebildet hatte. Die Bakterien, die das induzierbare Curli-Produktionsplasmid enthielten, wurden nach der Natriumcitratbehandlung nicht aufgelöst, was darauf hindeutet, dass die gedruckten Bakterien in der Lage waren, ein Curli-Netzwerk zu bilden, das so groß genug war, um das gedruckte Muster von Bakterien zu stabilisieren. Um mehrschichtige Strukturen zu konstruieren, können zusätzliche Ebenen gedruckt werden, indem der G-Code-Editor gesteuert wird.

Durch die Erhöhung der Anzahl der gedruckten Schichten in einer Stichprobe stieg die Breite und Höhe der gedruckten Strukturen inkrementell an. Als E.coli zur induzierten Herstellung von Curli-Proteinen in mehrschichtige Strukturen gedruckt wurde, löste die Natriumcitratbehandlung die Proben nicht auf, während mehrschichtige Strukturen, die keine Curli produzierenden E.coli enthielten, aufgelöst wurden. Die wichtigsten Teile des 3D-Druckverfahrens sind die Kalibrierung der Z-Achse und die Koordination des Druckens und Startens der Spritzenpumpe.

Der für diesen Prozess entwickelte Bioink ist ziemlich weich, mit geringer Zähigkeit. Weitere Änderungen an der Bioink könnten vorgenommen werden, um die mechanische Stabilität zu gewährleisten und zu verbessern. Diese 3D-Drucktechnik ermöglicht die Herstellung von Biofilmen mit hervorragenden mechanischen Eigenschaften, die die Herstellung biomimetischer Materialien ermöglichen können.

Tragen Sie beim Umgang mit diesen Bakterien einen angemessenen Schutz, z. B. Handschuhe.