Name: Strahlenbehandlung von organischen Kulturen aus Submandibulären und Parotid-Salivarienmodels Schlüssel in Vivo-Leiten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Lernen Sie die Strahlenbehandlung von organotypischen Speicheldrüsenkulturen zur Untersuchung von Zell-zu-Zell-Interaktionen. Diese Methode ermöglicht die schnelle Testung therapeutischer Verbindungen und reduziert den Tierverbrauch.

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Diese Arbeit wurde unter anderem durch die Pilotförderung unterstützt, die das Office of Research and Discovery and National Institutes of Health (R01 DE023534) an Kirsten Limesand zur Verfügung stellte. Der Cancer Biology Training Grant, T32CA009213, hat Wen Yu Wong unterstützt. Die Autoren danken M. Rice für seinen wertvollen technischen Beitrag.

1. Zubereitung von Vibrationen
<ol><li>Sprühbare, abnehmbare Bauteile des Vibratoms inklusive Puffertablett, Messerbefestigung, Acharo-Blockform und Laborfolie mit 70% Ethanol, dann UV-Sterilize für mindestens 30 min.</li>
	<li>Legen und sichern Sie ein zusätzliches Blatt Laborfolie über das Puffertablett, um zu verhindern, dass Eis hereinfällt.</li>
	<li>Füllen Sie die Eiskammer mit zerkleinertem Eis, entfernen Sie die Laborfolie aus dem Puffertablett und füllen Sie das Puffertablett mit 100 ml eiskalter 1x Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS), ergänzt um 1% Penicillin-Streptomycin-Ampicillin (PSA).</li>
	<li>Legen Sie eine Edelstahl-Rasierklinge in den Messerhalter. Mit dem Schraubenzieher können Sie den Winkel der Klinge anziehen und verändern.</li>
</ol>2. Zubereitung der Gewebeprobe im Agrose-Block und Abtrennung mit dem Vibratom
<ol><li>Autoklave alle notwendigen Trenn-und Trennwerkzeuge, einschließlich Zangen, Scheren und Pinsel.</li>
	<li>Bereiten Sie 3% niedrige Schmelzpunkt auf, die in sterilen 1x PBS und Mikrowelle entwickelt wurden, bis sich der Acharose in Lösung auflöst. Achten Sie darauf, dass die Lösung nicht überkocht und wirbeln Sie die Flasche regelmäßig mischen. Achtung: Verhindern Sie, dass sich der schmelzarme Awanz verfestigt, indem Sie ihn in einem warmen Wasserbad halten. Der schmelzarme Achrot ist bei 37 ° C flüssig und setzt bei 25 ° C. Das Wasserbad sollte jedoch unter 40 ° C liegen, um den Acharoten bei physiologischer Temperatur um das Gewebe zu gießen.</li>
	<li>Isolieren Speicheldrüsen und platzieren Sie das zersekelte Gewebe in 2 mL eiskalte 1x PBS, ergänzt mit 1% PSA in einem sterilen, 30 mm Kulturgericht.</li>
	<li>Mit Hilfe von Autoklaven-Zangen, entfernen Sie Speicheldrüsen von 1x PBS + 1% PSA-Lösung und Position am Boden einer Einbettung Form. Füllen Sie die Form mit Flüssigkeit 3% niedriger Schmelzpunkt, um das Gewebe zu bedecken.</li>
	<li>Stellen Sie das Gewebe mit Hilfe der Zangen in die Mitte des Blocks ein und positionieren Sie die Speicheldrüse in der entsprechenden Ebene. Die besten Querschnitte für die submandibulären und parotiden Drüsen befinden sich in der vertikalen Ebene.</li>
	<li>Platz agarose Block auf Eis für 10 Minuten zu härten.</li>
	<li>Führen Sie vorsichtig eine Rasierklinge um den äußeren Rand des Agrotes, um sich zu lockern und den Block aus Schritt 1.1 auf den UV-sterilisierten Laborfilm ausrutschen zu lassen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Rasierklinge, um eine Acharo-Kiste mit der Speicheldrüse auszuschneiden. Achten Sie darauf, dass die Ebene des Abschnitts gerade und parallel zur gegenüberliegenden Seite des Blocks ist (die Oberfläche, die abgeklebt wird). Da die Acharose das Gewebe nicht infiltrieren, schneiden Sie nicht zu viel Agirete um das Gewebe ab, so dass das Gewebe gut unterstützt wird.</li>
	<li>Verwenden Sie Superkleber, um den Block an der Schnittfläche zu befestigen.</li>
	<li>Ausschnitt bei 50 μm oder 90 μm Dicke durch Vibratome bei einer Geschwindigkeit von 0,75 mm und einer Frequenz von 100 Hz. Hinweis: Das Setzen des Vibratoms auf die höchste Frequenz und die niedrigste Messergeschwindigkeit liefert die optimalsten Scheiben.</li>
	<li>Sammeln Sie Abschnitte in einem 24-Brunnen-Gewebekultur-Gericht mit ~ 1 mL eiskalten PBS pro gut mit einer autoklavierten, natürlichen Haarpinsel, indem Sie die Bürste in 70% Ethanol zwischen Scheiben Sammlungen, um Sterilität zu erhalten.</li>
</ol>3. Kulturabschnitte
<ol><li>Autoklave eine Mikro-Spachtel und Zangen.</li>
	<li>Machen Sie Stock-Vibratome Kulturmedien mit oder ohne fetales Rinderserum (FBS): DMEM/F12 Medien ergänzt mit 1% PSA, 5 μg/mL Transferrin, 1,1 μM Hydrocortison, 0,1 μM Retinosäure, 5 μg/mL Insulin, 80 ng/mL epidermalen Wachstumsfaktor, 5 mM L-Glutamin, 50 μg/mL Gentamicin-Sulfat und 10 μL/mL Spurenelemente-Gemisch. Fügen Sie eine angemessene Menge an FBS hinzu, um 0%, 2,5%, 5,0% oder 10% Lösungen zu machen.</li>
	<li>Vor der Abspaltung 300 μL vorgewärmtes Medium hinzufügen und in jeden Brunnen einer 24-Well-Gewebekulturplatte einen 12 mm Durchmesser mit einer Porengröße einlegen. Die Medien sollten den Membranboden erreichen, um eine Flüssigluft-Schnittstelle für die Kultur zu schaffen.</li>
	<li>Die Speichelabschnitte mit dem Mikrospachtel und der Kultur bei 37 ° C in befeuchteten 5% CO 2 und 95% Luftatmosphäre Inkubator auf die Membraneinlage legen.<ol>
<li>Etwa 300 μL Primärkulturmedien in den Brunnen und ein paar Tropfen in die Membraneinsätze (ca. 40 μL) jeden zweiten Tag oder bei Bedarf. Die richtige Kultivierung zeigte, dass die Zellen überleben und bis zu 30 Tage ab vivo gewartet werden können.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Bestrahlung von Speicheldrüsenabschnitten
<ol><li>Behandeln Sie die Abschnitte mit einer einzigen Strahlendosis (5 Gy) mit dem Kobalt-60 (oder gleichwertigen) Bestrahler.<ol>
<li>Transport von Abschnitten zur Bestrahleranlage mit einem überdachten Styroporbehälter zur Vermeidung von Temperaturschwankungen. Darüber hinaus muss beim Transport zurück in den Inkubator des Labors darauf geachtet werden, dass die Medien nicht auf den Kulturdeckel zupraschen und zu einer Verunreinigung führen.</li>
		<li>Platzieren Sie die 24-Well-Platte mit Speicheldrüsenabschnitten 80 cm von der Strahlungsquelle entfernt, in der Mitte eines 32 "x 32"-Strahlungsfeldes. Die Berechnungen der Strahlendosis und die entsprechende Zeit im Bestrahler variieren je nach Instrument und Kobalt-60-Zerfall.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Überwachung und Kultivierung dieser Abschnitte, wie sie in Abschnitt 3 beschrieben sind, wird weiter überwacht und kultiviert.</li>
</ol>5. Haltbarkeit
<ol><li>Aspirieren Sie alte Medien und waschen Sie Scheiben zweimal mit sterilen, vorgewärmten 1x PBS.</li>
	<li>Stapelabschnitte mit trypanblauem Farbstoff.<ol>
<li>Verwenden Sie einen Mikrospachtel, um die Scheibe von der Kultur auf eine Glasscheibe zu verschieben.</li>
		<li>Fügen Sie der Vibratomscheibe 0,4% Trypusblaue Lösung mit genügend Volumen hinzu, um das Gewebe zu bedecken (10 – 20 μL).</li>
		<li>Inkubieren Sie Scheiben bei Raumtemperatur (RT) im Trypan-Blau für 1 – 2 min für den Farbstoff, um in das Gewebe einzudringen. Nicht lebensfähige Zellen werden blau gefärbt und lebensfähige Zellen werden nicht befleckt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stapelabschnitte mit Calcein, AM-Live-Zell-Farbstoff.<ol>
<li>Fügen Sie genügend Fleckenvolumen hinzu, um den Abschnitt in einem Brunnen einer 24-Wellplatte (200 – 300 μL) abzudecken.</li>
		<li>Inkubate Scheiben bei RT für 15 Minuten, um Farbstoffdurchdringen zu ermöglichen.</li>
		<li>Den Abschnitt vorsichtig vom Brunnen entfernen und auf eine Glasscheibe legen. Mount Scheiben mit 1 Tropfen Montageband.</li>
		<li>Bildausschnitte auf einem Leuchtstoffmikroskop mit Erredung/Emissionswellenlängen von 488 nm und 515 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Antikörper-Färbung Vibratome Abschnitte
Hinweis: Im Folgenden finden Sie ein allgemeines Antikörper-Färbung, das speziell für Ki-67 spezifisch ist; Dieses Protokoll kann jedoch mit jedem Antikörper verwendet werden. Alle Waschungen werden bei RT durchgeführt, sofern nicht anders vermerkt.
<ol><li>In der Multi-well-Gewebekulturschale die Medien absaugen und mindestens 2x mit sterilen 1x PBS waschen.</li>
	<li>Fixierte Abschnitte mit 4% Paraformaldehyd (PFA) über Nacht bei 4 ° C.</li>
	<li>4% PFA absaugen und 3x mit PBT waschen [1x PBS, 1% Rinder-Serum Albumin (BSA), 0,1% Triton X-100]. Hinweis: Abschnitte können bei 4 ° C in 1x PBS gelagert und zu einem späteren Zeitpunkt verfärbt werden. Die maximale Lagerzeit, die in diesem Manuskript getestet wurde, betrug 3 Wochen. Eine längere Speicherzeit muss der einzelne Nutzer optimieren, wenn dies gewünscht wird.</li>
	<li>Durchlässige Abschnitte mit 0,3% Triton X-100 in 1x PBS für 30 min. Hinweis: Dieser Schritt kann modifiziert und optimiert werden, um eine spezifische Antikörper-Färbung und Durchlässigkeit zu ermöglichen.</li>
	<li>Die Durchlässigkeit.</li>
	<li>Wasch 3x für 5 min mit 1x PBS, 1% BSA und 0,1% Triton X-100 (PBT).</li>
	<li>Blockieren Sie die Scheiben mit Blockiermittel mit 1% normalem Ziegenserum für 1 h.</li>
	<li>Die Scheiben 3x für 5 min mit PBT waschen.</li>
	<li>Die Scheiben über Nacht bei 4 ° C mit 500 μL anti-Ki67 Kaninchen monoklonalen Antikörper verdünnt in 1% BSA in 1x PBS. NOTE: Für die Phalloidin-Färbung, überspringen Schritt 6.9 und fahren Sie mit dem Protokoll für die spezifische Phalloidin verwendet. Für DNA-Gegenfleck, überspringen Sie zu Schritt 6.15.</li>
	<li>Aspirate anti-Ki67 Kaninchen monoklonalen Antikörper.</li>
	<li>Die Scheiben 6x für 5 min in 1x PBS waschen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Scheiben in 500 μL fluoresziertem konjugierten sekundären Antikörper, die mit dem Anti-Ki67-Antikörper kompatibel sind, der in 1% BSA in 1x PBS bei RT für 1,5 h aus Licht bedeckt ist. Hinweis: Auf Basis des verwendeten sekundären Antikörpers kann die Inkubationszeit mit dem sekundären Antikörper durch den einzelnen Nutzer weiter optimiert werden. Außerdem ist der sekundäre Antikörper lichtempfindlich. Alle nachfolgenden Waschungen müssen im Dunkeln durchgeführt werden.</li>
	<li>Aspirate sekundäre Antikörper.</li>
	<li>Waschscheiben für 3 x für 5 min mit 1x PBS.</li>
	<li>Die Scheiben 5 min in deionisiertem Wasser waschen.</li>
	<li>Gegenfleckscheiben mit DAPI (1μg/mL) für 20 min bei RT.</li>
	<li>Scheiben (einmal) für 5 min in deionisiertem Wasser waschen.</li>
	<li>Teigscheiben mit einem Tropfen (~ 40 μL) von Montagebrädern. Um überschüssige Blasen zu vermeiden, legen Sie den Koppel langsam auf das Montagemutter auf der Rutsche, beginnend mit einem 45 °-Winkel.<ol>
<li>Um zu verhindern, dass die dicken Abschnitte mit dem Kofenlip zerkleinert werden, montieren Sie jede Scheibe mit einem Abstandshalter. Ein Abstandshalter kann erzeugt werden, indem man einen Rand aus Vakuumfett in ein Quadrat um den Gewebeabschnitt legt.</li>
		<li>Beim Verlegen des Kerklips können die Kanten des Kerkel mit Vakuumfett versiegelt werden. Drücken Sie mit dem Daumen auf die Kanten des Kegenlippens, um ihn fest auf die Rutsche zu kleben. Alternativ können Sie die Keillippe mit klarem Nagellack auf die Mikroskope schieben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Bildgebung von Vibratome
<ol><li>Bild der gebeizten Folien innerhalb von 5 Tagen nach der Färbung.</li>
	<li>Mit einem konfokalen Mikroskop erhalten Sie optische Abschnitte der gebeizten Vibratome. Mit einem konfokalen Mikroskop erhalten Sie einen z-Stack in definierter Schrittgröße oder nehmen Sie je nach experimentellem Design des Nutzers einzelne Bilder. Bilder können nach einer konfokalen Sammlung auf jedem Computerbildschirm untersucht werden. Hinweis: Aufgrund der Dicke der Vibratome wird empfohlen, Details innerhalb der Proben mit einem konfokalen Mikroskop oder einem Bereich mit z-Stack-Fähigkeit zu visualisieren. Für die Bilder, die in diesem Manuskript verwendet werden, wurde ein 63x-Ölobjekt verwendet; Dies kann jedoch vom einzelnen Nutzer und dem jeweiligen Umfang angepasst und weiter modifiziert werden. Empfohlene Pixelauflösung für jeden Objektiv-und Zoomfaktor mit der vermuteten Nyquist-Probenahme von 2,5 Pixeln in X und Y für die kleinste optisch auflösbare Struktur wurde verwendet. Einige Kommentatoren schlagen jedoch 2,3 Pixel vor, andere vermuten 2,8 Pixel. Weitere Informationen zu diesen Berechnungen finden Sie im Handbuch der Biologischen Konfokalen Mikroskopie22 .</li>
</ol>

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<li>Nedvetsky, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasympathetic+innervation+regulates+tubulogenesis+in+the+developing+salivary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland.</a> Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).</li>
<li>Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+regulation+of+salivary+gland+epithelial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning.</a> Development. 144 (2), 211-220 (2017).</li>
<li>Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zonula+occludens-1%2C+occludin+and+E-cadherin+expression+and+organization+in+salivary+glands+with+Sjogren%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Jounral+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren's syndrome.</a> Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).</li>
<li>Daley, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Btbd7+is+essential+for+region-specific+epithelial+cell+dynamics+and+branching+morphogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo.</a> Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).</li>
<li>Nam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-Irradiated+Human+Submandibular+Glands+Display+High+Collagen+Deposition%2C+Disorganized+Cell+Junctions%2C+and+an+Increased+Number+of+Adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Speicheldrüsenforschung hat eine Reihe von Kulturmodellen genutzt, darunter verewigte 2-D-Kulturen, primäre 2-D-Kulturen, 3-D-Salisphere-Kulturen und 3-D-Organkulturen von embryonalen Explanten, um Fragen zur zugrunde liegenden Biologie und Physiologie zu klären. Diese Kulturmodelle haben in einer Vielzahl von Forschungsfragen aufschlussreiche Informationen geliefert und werden auch in Zukunft wichtige Werkzeuge in der Speichelforschung sein. Zu den Grenzen dieser Kulturmodelle gehören die Modulation der p53-Aktivitä...

Die richtige Speicheldrüsenfunktion ist für die Mundgesundheit von entscheidender Bedeutung und wird nach der Kopf-und Nackenkrebsbehandlung mit der Strahlentherapie1 verändert. 2017 wurden in den USA 2 knapp 50.000 neue Fälle von Kopf-und Nackenkrebsgemeldet. Aufgrund der gewebeschädigenden und häufig irreversiblen Auswirkungen der Strahlentherapie auf umgebende normale Gewebe wie Speicheldrüsen sind die Patienten oft mit schweren Nebenwirkungen und verminderter Lebensqualität2,3, 4. Platz Häufige Komplikationen, die durch Strahlenschäden verursacht werden, manifestieren sich in Symptomen wie Xerostomie (das subjektive Gefühl des trockenen Mundes), Zahnkaries, Beeinträchtigung der Fähigkeit zu kauen und zu schlucken,Sprachbeeinträchtigungen und kompromittierten Mundmikrobiomes 2, 3 , 4. Diese Symptome können kollektiv zu Unterernährung und Beeinträchtigung des Überlebens bei betroffenen Personen führen 5. Während die Speicheldrüsenfunktionsstörungen in dieser Population gut dokumentiert sind, wurden die zugrundeliegenden Mechanismen der Schädigung von Akinarzellen bestritten, und es gibt kaum Integration zwischen den verschiedenen Tiermodellen6,7.
Die aktuellen Methoden zur Untersuchung der Speicheldrüsenfunktion und der strahlenbedingten Schädigung umfassen die Verwendung von In-vivo-Modellen, verewigten Zelllinien, zweidimensionalen (2-D) Primärzellkulturen und dreidimensionalen (3-D) Salisphere-Kulturen8, 9,10,11,12. Traditionell sind Zellkulturmodelle aus verewigten Zelllinien und 2-D-Kulturen einschichtige Zellen, die auf flachen Oberflächen kultiviert werden und für schnelles, einfaches und kostengünstiges Experimentieren wertvoll sind. Künstliche Zellkultur-Bedingungen können jedoch den Differenzierungsstatus und die physiologischen Reaktionen von Zellen verändern, die verschiedenen Bedingungen ausgesetzt sind, und die Ergebnisse können oft nicht auf ganze Organorganismus-Modelle14,15übersetzen. Darüber hinaus benötigen verewigte Zellkulturen eine Modulation der p53-Aktivität, was für die Reaktion der Speicheldrüse auf DNA-Schäden16,17entscheidendist.
3-D Salisphere Kulturen sind für Stamm-und Vorläuferzellen in der frühen Zeit Punkte in der Kultur angereichert und waren nützlich, um die Radiosensibilität dieser Untergruppe von Speicheldrüsenzellen9,18zuverstehen. Eine kritische Einschränkung all dieser Kulturmodelle ist, dass sie bei der Visualisierung der 3-D-Struktur der Speicheldrüse, einschließlich der extrazellulären Matrix (ECM) und Zellzellinteraktionen über verschiedene Schichten, die bei der Modulation von Speichelvarianten entscheidend sind, wirkungslos sind. Sekretion15. Die Notwendigkeit einer Methode, die das Verhalten des Gewebes als Ganzes umfasst, aber auch unter Laborbedingungen manipuliert werden kann, um die Auswirkungen der Behandlung zu untersuchen, ist notwendig, um die zugrunde liegenden Mechanismen der strahleninduzierten Speicheldrüse weiter zu entdecken. fehlfunktion.
Die Lebendgeweb-Sektionierung und-kultur wurde bereits19,20 dokumentiertund wird häufig zur Untersuchung von Gehirngewebeinteraktionen21verwendet. In früheren Studien wurde Parotid (PAR) Speicheldrüsengewebe von Mäusen auf etwa 50 μm abgetrennt und für bis zu 48 Stunden kultiviert, und die Analyse der Lebensfähigkeit, des Zelltodes und der Funktion wurde danach19durchgeführt. Su et al. (2016) erweiterte diese Methodik durch die Kultivierung der menschlichen submandibulären Drüsen (SMGs), die für 14 Tage auf 35 μm oder50 μm verteilt sind. 20 Tage lang wurden sie mit 35 μm oder 50 μm abgetrennt. Die vorgeschlagene Methode ist insofern ein Fortschritt, als sie sowohl parotide als auch submandibuläre Speicheldrüsen umfasst, die mit 50 μm und 90 μm abgetrennt sind und die Kulturen 30 Tage lang auswerten. Die Fähigkeit, einen Bereich der Gewebedicke zu schneiden, ist wichtig bei der Bewertung von Zellzell-und Zell-ECM-Interaktionen, die für zelluläre Prozesse relevant sind, einschließlich apical-Basolateralpolarität und Innervation für die Sekretion. Darüber hinaus wurden die Speicheldrüsenscheiben bestrahlt, während sie in der Kultur die Machbarkeit dieses Kulturmodells zur Untersuchung von strahlenbedingten Speicheldrüsenschäden feststellen konnten.
Der Zweck dieses Speicheldrüsen-organotypischen Kulturprotokolls ist es, die maximale Zeit der Kulturlebensfähigkeit zu bewerten und zelluläre Veränderungen nach der Behandlung ex vivo zu charakterisieren. Um die maximalen Zeitabschnitte zu bestimmen, die nach der Trennung lebensfähig sind, wurden trypan-Blau-Färbung, lebende Zellfärbung und immunhistochemische Färbung für den Zelltod durchgeführt. Die konfokale Mikroskopie und die immunfluoreszierende Färbung wurden eingesetzt, um bestimmte Zellpopulationen, morphologische Strukturen und Proliferationsniveaus zu bewerten. Auch die Gewebeschnittkulturen waren ionisierender Strahlung ausgesetzt, um die Auswirkungen der Strahlung auf verschiedene Marker in diesem 3-D-Modell zu bestimmen. Die Induktion des Zelltodes, die Zytoskelettstörung, der Verlust von Differenzierungsmarkern und die Kompensationsvermehrung in bestrahlten Ex-vivo-Kulturen wurden mit früheren Studien von in vivo-Modellen verglichen. Diese Methodik bietet ein Mittel, um die Rolle von Zellzellinteraktionen nach Strahlenschäden zu untersuchen und stellt ein experimentelles Modell zur Verfügung, um die Wirksamkeit therapeutischer Interventionen (Genmanipulationen oder pharmakologische Wirkstoffe) effizient zu bewerten. ), die für in vivo Modellen weniger geeignet sein können.

<table><tbody><tr><td>Vibratome VT1000S</td><td>Leica Biosystems</td><td>N/A</td><td>Vibratom zum Trennen</td></tr> von <tr><td>Doppelschneidigen Edelstahl-Rasierklingen</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP165-25</td><td>Low-melt</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6543</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B</td><td>Lonza</td><td>17-745H</td><td>PSA</td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>CellTreat</td><td>229124</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Loctite UltraGel Control Sekundenkleber</td><td>Loctite</td><td>N/A</td><td>Gekauft im Baumarkt</td></tr><tr><td>Natural Red Sable Runde Pinsel</td><td>Princeton Art & Brush Co</td><td>7400R-2</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicinsulfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN1676045</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-8158-100mg</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutatmin</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Spurenelemente</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN1676549</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Fisher Scientific</td><td>12585014</td><td></td></tr><tr><td>Epidermaler Wachstumsfaktor</td><td>Corning</td><td>354001</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>Retinsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>R2625-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>A3160602</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 Medien</td><td>Corning</td><td>150-90-CV</td><td></td></tr><tr><td>Millicell Zellkultureinsatz</td><td>Millipore Sigma</td><td>PICM01250</td><td>12 mm, 0,4 μm Porengröße für 24-Well-Platte</td></tr><tr><td>0,4 % Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>R37601</td><td>Nur verwendete LIVE-Farbstoffkomponente</td></tr><tr><td>Anti-Ki-67 Antikörper</td><td>Zellsignaltechnologie</td><td>9129S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-E-Cadherin Antikörper</td><td>Zellsignaltechnologie</td><td>3195S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cleaved Caspase-3 Antikörper</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9661L</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SMA Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6198</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Amylase Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8273</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TUBB3 Antikörper</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>5568S</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Antikörper Beschriftungskit</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A20185</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21568-2500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd Prills</td><td>Fisher Scientific</td><td>5027632</td><td></td></tr><tr><td>New England Nuclear Blocking Agent</td><td>Perkin Elmer</td><td>2346249</td><td>Nicht mehr verkauft</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4083S</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Eindeckmedien</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Leica SPSII Spektral Konfokal</td><td>Leica Biosystems</td><td>N/A</td><td>Für die konfokale Bildgebung</td></tr><tr><td>Leica DMIL Inverses Phasenkontrastmikroskop</td><td>Leica Biosystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cobalt-60 Teletherapie-Instrument</td><td>Atomenergie von Kanada Ltd Theratron-80</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Amac Box, Clear</td><td>The Container Store</td><td>60140</td><td>Agarose-Blockform</td></tr></tbody></table>

strahlenbehandlung von organischen kulturen aus submandibulären und parotid-salivarienmodels schlüssel in vivo-leiten

Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics

Hyposalivation und Xerostomia erzeugen chronische orale Komplikationen, die die Lebensqualität bei Kopf-und Nackenkrebspatienten, die mit Strahlentherapie behandelt werden, verringern. Experimentelle Ansätze zum Verständnis von Mechanismen der Speicheldrüsenfunktionsstörungen und Restaurationen haben sich auf in vivo-Modellen konzentriert, die durch die Unfähigkeit, therapeutische Kandidaten und Effizienz in der Transfektion systematisch zu untersuchen behindert werden, behindert werden. Fähigkeit, bestimmte Gene zu manipulieren. Der Zweck dieses Speicheldrüsen-organotypischen Kulturprotokolls ist es, die maximale Zeit der Kulturlebensfähigkeit zu bewerten und zelluläre Veränderungen nach der Behandlung ex vivo zu charakterisieren. Wir haben die immunfluoreszierende Färbung und die konfokale Mikroskopie eingesetzt, um festzustellen, wann bestimmte Zellpopulationen und Marker während einer 30-tägigen Kulturperiode vorhanden sind. Darüber hinaus werden in vivo Strahlungsmodelle in Kulturen ausgewertet, die ex vivo bestrahlt werden. Diese Methode, die sich vorwärts bewegt, ist eine attraktive Plattform für die schnelle Ex-vivo-Bewertung von Murin-und menschlichen Speichelgewebe Reaktionen auf therapeutische Wirkstoffe, die Speichelfunktion verbessern.

Primär werden 2-D-Kulturen in fetalem Rinderserum (FBS) angebaut, die Medien ergänzen,währenddie primäre 3-D-Salisphere-Kultur typischerweise unter serumfreien Bedingungen10,11kultiviert wird. Darüber hinaus haben die beiden vorhergehenden Studien, die Vibratomkulturen aus Speicheldrüsen verwendeten, ihre Abschnitte in 0% oder 10% FBS kultiviert,dieMedien19,20ergänzt. Die ...

Durch die Verwendung dreidimensionaler organotypischer Kulturen zur Visualisierung der Morphologie und funktionellen Marker von Speicheldrüsen können neue Einblicke in die Mechanismen von Gewebeschäden nach Strahlung gegeben werden. Hier wird ein Protokoll zu den Abschnitten, Kultur, Bestrahlung, Fleck und Bild 50 – 90 μm dicken Speicheldrüsenabschnitten vor und nach der Exposition gegenüber ionisierender Strahlung beschrieben.

Strahlenbehandlung von organischen Kulturen aus Submandibulären und Parotid-Salivarienmodels Schlüssel in Vivo-Leiten

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Auswertung von Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen innerhalb eines Gewebes und ex vivo molekularen und pharmakologischen Manipulationen, die in vivo weniger möglich wären. Der Hauptvorteil dieser Technik ist der längere Zeitraum, in dem diese Gewebeabschnitte in der Kultur beibehalten werden könnten, so dass ihre Bewertung zu späteren Zeitpunkten möglich ist. Diese Technik wird ein schnelleres Screening von therapeutischen Verbindungen ermöglichen, um Speicheldrüsenschäden zu korrigieren und wird wahrscheinlich die Anzahl der Mäuse reduzieren, die für diese Studien verwendet werden.Wir planen, diese Technik zu verwenden, um die Speicheldrüsenreaktion auf Diebstrahlung zu Zwischenzeitpunkten zu verstehen und Gene in bestimmten Intervallen ein- und auszuschalten. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist die Gewebesektion und verhindert den Verlust von Gewebeabschnitten während der Kultur- und Färbeschritte. Vor Beginn des Verfahrens desinfizieren Sie die abnehmbaren Vibram-Komponenten mit 70% Ethanol, gefolgt von einer UV-Sterilisation für mindestens 30 Minuten.Sichern Sie eine zusätzliche Platte Laborfolie über der Puff

radiation-treatment-organotypic-cultures-from-submandibular-parotid

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Ein optimiertes Protokoll für die Isolierung von Stammzellen aus der Maus Speicheldrüse beschrieben. Die Methode nutzt enzymatische und mechanische Verdauung, und erlaubt Isolierung salispheres enthaltenden Zellen mit Eigenschaften von Stammzellen.

Isolierung von Maus Speicheldrüsen Stem Cells

Eine Technik, genetisch zu manipulieren Epithelzellen innerhalb der...

Genetic Modification und Rekombination von Speicheldrüsen Organkulturen

Unterfunktion der Speicheldrüsen, eine schwerwiegende Nebenwirkung der Kopf- und Hals-Strahlentherapie, verringert die Lebensqualität eines Patienten. Der Nachweis der Wirksamkeit neuer Therapien im Tiermodell ist eine Voraussetzung für den klinischen Übergang. Dieses Protokoll beschreibt die retroduktale Verabreichung und lokale Bestrahlung der submandibulären Drüsen der Ratte.

Retroductal Submandibulardrüse Einträufeln und Lokalisierte fraktionierten Bestrahlung in einem Rattenmodell von Speichel- Unterfunktion

Wir beschreiben ein Protokoll zur chirurgisch freizulegen und Stabilisierung der murinen mandibulären Speicheldrüse intravitalen Bildgebung mit aufrechten intravitalen Mikroskopie. Dieses Protokoll ist leicht anpassbar an anderen therapeutisches Drüsen von Kopf und Hals-Bereich der Mäuse und andere kleine Nagetiere.

Vorbereitung der murinen mandibulären Speicheldrüse aufrecht Intravitalen Mikroskopie

Lokalen Drug-Delivery, die submandibulären Drüsen ist Interesse an Verständnis Speicheldrüse Biologie und für die Entwicklung neuer Therapeutika. Wir präsentieren Ihnen eine aktualisierte und detaillierte Retroductal Injektion Protokoll, entworfen, um Lieferung Genauigkeit und experimentelle Reproduzierbarkeit zu verbessern. Die enthaltenen Anwendung ist die Lieferung von Polymeren Nanopartikel.

Retroductal Nanopartikel Injektion an der murinen mandibulären Drüse

Wir präsentieren Ihnen einen detaillierten Ansatz zur Durchführung von Speichel Sammlung, einschließlich murinen Tracheostoma und die Isolation der drei großen Speicheldrüsen.

Murine Speichel funktionale Bewertung über Pilocarpin Stimulation folgenden fraktioniert Bestrahlung

Organoide, die sich aus den Meeressammrissen entwickelten, wurden bestrahlt und charakterisiert, um epitheliale Merkmale und Wechselwirkungen mit Immunzellen zu beurteilen. Bestrahlte Organoide können verwendet werden, um Wechselwirkungen mit Zellen besser zu bewerten, die zu der Rekrutierung von Tumorzellen in bestrahltem normalem Gewebe führen können.

Wachstum und Charakterisierung der bestrahlten Organoide aus den Brustdrüsen

Wir präsentieren eine Methode zur Isolierung und Kultivierung primärer menschlicher Speicheldrüsen-abgeleiteten Epithelzellen. Diese Zellen zeigen Genexpressionsmuster, die mit ihrem Epithel-Ursprung übereinstimmen und können als Salisphären auf Kellermembranmatrizen aus Engelbreth-Holm-Schwarm-Tumorzellen oder als Monolayer auf behandelten Kulturgerichten angebaut werden.

Isolierung von Speicheldrüsenepithelzellen aus menschlichen Speicheldrüsen für In-Vitro-Wachstum als Speicheldrüsen oder Monolayer

Die immunfluoreszierende Bildgebung ist durch die Fähigkeit eingeschränkt, komplexe, zeitabhängige biologische Prozesse in nur einer einzigen Momentaufnahme zu beobachten. Diese Studie skizziert einen Live-Imaging-Ansatz, der an präzisionsgeschnittenen Unterkieferdrüsenschnitten von Mäusen durchgeführt wird. Dieser Ansatz ermöglicht die Echtzeitbeobachtung von Zell-Zell-Interaktionen während der Homöostase und der Regenerations- und Reparaturprozesse.

Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen in der Speicheldrüse mittels ex vivo Lebendzell-Bildgebung

Ein Protokoll für die Kanülierung der Maus Glandula Speicheldrüse über die Wharton-Gang beschrieben. Für dieses Experiment ist die Trypanblau-Lösung als Färber verwendet werden, um zu demonstrieren, wie diese Technik effektiv liefert Infusionen in die gezielte Drüse, und die Zuverlässigkeit dieses neuen Ansatzes als potenzielle klinische Arzneimittelentwicklung / Zelltherapie für die Regeneration der Speicheldrüsen vorschlagen.

Kanülierung der Maus Submandibular Speicheldrüsen über die Wharton-Gang

Lernen Sie die Strahlenbehandlung von organotypischen Speicheldrüsenkulturen zur Untersuchung von Zell-zu-Zell-Interaktionen. Diese Methode ermöglicht die schnelle Testung therapeutischer Verbindungen und reduziert den Tierverbrauch.

Strahlenbehandlung von organischen Kulturen aus Submandibulären und Parotid-Salivarienmodels Schlüssel in Vivo-Leiten

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