Name: Modellierung von Brustkrebs über eine intraduktive Injektion des Cre-expressingAvirus in die Maus-Mammary Drüse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Erfahren Sie die intraduktale Injektion von Cre-exprimierendem Adenovirus in Mäuse-Mammardrüsen zur Modellierung von Brustkrebs. Diese Methode ermöglicht zellspezifische Manipulation onkogener Ereignisse ohne aufwendige Zuchtstrategien.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Arbeit wurde durch das Stipendium der National Institutes of Health (NIH) R01 CA222560 und den Breakthrough Award des Department of Defense W81XWH-18-1-0037 unterstützt.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Brigham and Women es Hospital genehmigt.
1. Erzeugung und Wartung von Floxed-Mäusen
<ol><li>Erhalten Sie brustkrebsrelevante bedingte Knockouts (z. B. Trp53tm1Brn [trp53L/L], Brca1tm1Aash [Brca1L/L]) oder bedingte Einsteckmauslinien (z. B. Gt(ROSA)26Sortm1(Pik3ca*H1047R)Egan) aus dem Jackson Laboratory (JAX) oder NCI Mouse Models of Human Cancer Consortium (MMHCC). Um die Verfolgung von MECs zu erleichtern, die einer cre-vermittelten Rekombination unterzogen werden, kann auch eine bedingte Cre-Reporter-Leitung von JAX bezogen werden (z. B. Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos [bezeichnet als R26Y]).</li>
	<li>Züchte Trp53L/L homozygote Mäuse mit R26Y homozygoten Reportermäusen oder mit homozygoten Mäusen, die die R26Y Reporterallele und alle zusätzlichen floxierten bedingten Knockout- oder Knock-in-Allele für verschiedene Mausmodelle, um heterozygote männliche und weibliche Nachkommen der F1 zu erhalten.</li>
	<li>Intercross heterozygote F1 männliche und weibliche Mäuse, um F2-Verbindung weibliche Mäuse zu erhalten, die homozygot für jedes Allel sind (als experimentelle Mäuse), sowie R26Y-nur homozygote Weibchen (als Kontrollmäuse). Genotyp F2-Mäuse auf Basis der unten aufgeführten PCR-Primer und Zyklusbedingungen, indem zwei Standard-PCR-Reaktionen von 20 l (mit Taq 5X Master Mix) in zwei verschiedenen PCR-Röhren, eine mit den R26Y-Primern und die andere mit dem Trp53L Primer. Verwenden Sie erwachsene Mäuse (in der Regel etwa 2–4 Monate alt) für alle Zucht.<ol>
<li>Für R26YpcR bei 94 °C für 3 min, dann bei 94 °C für 30 s, 60 °C für 30 s und 72 °C für 1 min für 35 Zyklen, gefolgt von 72 °C für 3 min und Aufrechterhaltung bei 14 °C. Primer (i) R26YFP-1 verwenden: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; ii) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC; iii) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG. HINWEIS: Ein einzelnes PCR-Band von 250 bp zeigt eine R26Y-Homozygote an, ein einzelnes PCR-Band von 500 bp einen Wildtyp (WT) und zwei PCR-Bänder (R26Y: 250 bp, WT: 500 bp) auf eine R26Y-Heterozygote (Abbildung 1A). Für Trp53LpcR bei 94 °C für 3 min, dann bei 94 °C für 30 s, 60 °C für 30 s und 72 °C für 1 min für 35 Zyklen, gefolgt von 72 °C für 3 min und Aufrechterhaltung bei 14 °C. Primer (i) p53F2-10 1F verwenden: CAC AAA AAC AGG TTA AAC CCA G; (ii) s53F2-10 1R: AGC ACA TAG GAG GCA GAG AC. HINWEIS: Ein einzelnes PCR-Band von 370 bp zeigt ein Trp53 L/L-Homozygote an, ein einzelnes PCR-Band von 288 bp zeigt ein Trp53+/+ WT an, und zwei PCR-Bänder (WT: 288 bp, Trp53L: 370 bp) weisen auf ein Trp53L hin. /+ heterozygote (Abbildung 1B).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Präoperative Zubereitung
<ol><li>Autoklavalle chirurgische Werkzeuge 1 Tag vor der Operation.</li>
	<li>0,1% Bromphenolblau in phosphatgepufferter Salin (PBS) vorbereiten und bei 4 °C lagern. Verdünnen Sie den Ad-Cre, der für die intrauktale Injektion in DMEM-Medium mit 0,01 M CaCl2 und Bromphenolblau im Verhältnis 1:10 (d. h. der Injektionsmischung) verwendet wird. HINWEIS: Der hier verwendete Ad-Cre wurde von der University of Iowa Viral Vector Core mit einem viralen Titer von 1010–1011 pfu/mL gewonnen.</li>
	<li>Anästhetisieren Sie die weibliche Maus (F2-Generation wie in Schritt 1.2 beschrieben, Alter im Alter von 3–4 Wochen bis zum Erwachsenen) mit einer Isofluran-Kammer und wenden Sie Augensalbe. Während des Eingriffs befeuchten Sie die Maus kontinuierlich, indem Sie sicherstellen, dass sie 1%–2,5% Isofluran in Sauerstoff einatmet. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie mindestens alle 15 min, indem Sie eine Zehenklemme durchführen. Überwachen Sie die Maus sorgfältig auf jede Änderung der Atemfrequenz und passen Sie bei Bedarf den Isoflurangehalt entsprechend an.</li>
	<li>Injizieren Sie Meloxicam als Analgesie subkutan in einer Dosis von 5 mg/kg, vor dem chirurgischen Eingriff.</li>
	<li>Setzen Sie die Brustwarze chirurgische Nipsel durch die Anwendung mehrerer Tropfen Haarentfernung Creme; entfernen Sie übermäßige Creme und lockeres Haar mit weichen Papiertüchern. HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt in einem Bereich durch, der von dem Ort, an dem die Operation durchgeführt werden soll, getrennt ist. Rasieren wird nicht empfohlen, um Schäden an den Brustwarzen zu vermeiden. Seien Sie vorsichtig, um chemische Enthaarungsmittel rechtzeitig zu entfernen. Das Mittel zu lange eingeschaltet zu lassen, kann zu einer chemischen Verbrennung der Haut führen</li>
	<li>Desinfizieren Sie die chirurgische Stelle zuerst mit Iodophoren, gefolgt von 70% Alkohol, und enden sie mit einer endgültigen Anwendung von Peeling-Iodophoren. Tun Sie dies in einer kreisförmigen Bewegung von der Mitte des Arbeitsbereichs in Richtung Peripherie mit einem Gazeschwamm oder Baumwoll-Applikator. Wiederholen Sie den Zyklus 3x–4x.</li>
</ol>3. Intraduktive Injektion
<ol><li>Verwenden Sie aseptische Techniken während des gesamten chirurgischen Eingriffs.</li>
	<li>Machen Sie eine Einschnittstelle auf der Haut mit einer Länge von 1 cm zwischen den beiden vierten Leisten-MGs (Abbildung 2). Trennen Sie die Hautklappe (mit dem MG) vorsichtig vom parietalen Peritoneum, um den brustduktalen Baum zu visualisieren.</li>
	<li>Halten Sie die Brustwarze vorsichtig mit der Zange des Uhrmachers fest und entfernen Sie die Außennippel, ohne die hautnahe Haut mit einer Mikro-Sektionsschere zu schneiden.</li>
	<li>Mit einer 33 G-Metallnabennadel in eine 25-L-Hamilton-Spritze mit 33 G-Metallnabennadel. Schätzen Sie das Volumen der Injektionsmischung in der Spritze auf der Grundlage des in der Mischung enthaltenen blauen Farbstoffs. ANMERKUNG: Verwenden Sie bei der Injektion in MGs von 3–4 Wochen alten Weibchen ein kleineres Volumen (z. B. 3 l) und ein größeres Volumen (z. B. 10 l), wenn Sie mGs von laktierenden Weibchen injizieren.</li>
	<li>Halten Sie vorsichtig den Rand der Hautklappe mit einer feinen gekrümmten Pinzette und injizieren Sie die Ad-Cre Injektionsmischung langsam in die Brustwarze, während sie die Ausbreitung von blauem Farbstoff in den Brustduktalbaum überwacht. Halten Sie die Injektionsrate so niedrig wie möglich, um Schäden am duktalen Lumen zu vermeiden. HINWEIS: Injizierte Flüssigkeit (wie durch den mitgelieferten Bromphenolblaufarbstoff veranschaulicht), die sich über den gesamten duktalen Baum ausbreitet, ohne in das Stromfach zu gelangen, deutet auf eine erfolgreiche intrauktale Injektion hin.</li>
	<li>Ziehen Sie die Nadel vorsichtig aus der Brustwarze, um ein Auslaufen der injizierten Flüssigkeit zu vermeiden.</li>
	<li>Untersuchen Sie die distale Seite (d. h. weg von der Brustwarze) des MG oder die Umgebung der injizierten Brustwarze. Beachten Sie, dass anschwellender blauer Farbstoff (d. h. Farbstoff, der in das nahe gelegene Stroma diffundiert) eher auf eine Brustfettpad-Injektion als auf eine erfolgreiche intrauktale Injektion hinweist.</li>
	<li>Schließen Sie die chirurgischen Wunden (ab Schritt 3.2) in der Haut mit Wundclips.</li>
</ol>4. Postoperative Pflege
<ol><li>Entfernen Sie die Maus von der Anästhesie und legen Sie sie auf ein Heizkissen in einem sauberen Käfig für die Erholung.</li>
	<li>Meloxicam subkutan bei 5 mg/kg wieder verabreichen, 24 h nach der Operation.</li>
	<li>Überwachen Sie die allgemeinen Bedingungen des Tieres und suchen Sie 5 Tage lang nach Anzeichen einer Infektion an der Einschnittstelle.</li>
	<li>Wundclips werden 7-10 Tage nach der Operation entfernt.</li>
</ol>5. Überwachung der Entwicklung des Brusttumors
<ol><li>Überwachen Sie die injizierten Mäuse zweimal wöchentlich durch Palpation auf Anzeichen einer Entwicklung des Brusttumors.</li>
	<li>Sobald der Tumor greifbar ist, überwachen Sie die Maus täglich und messen Sie die Tumorgröße, bis sie den experimentellen Endpunkt erreicht, wie durch die Größe (z. B. erreichen 10%–15% des Körpergewichts der Maus) oder Zustand (z. B. ulzeriert oder nekrotisch) des Tumors, oder durch die allgemeinzustand der Maus (z. B. Komatus, Moribund).</li>
	<li>Euthanisieren Sie die Maus durch Kohlendioxid-Erstickung, gefolgt von einer sekundären Methode (z. B. Zervixdislokation).</li>
	<li>Isolieren Sie die Brusttumorgewebe und analysieren Sie sie durch Durchflusszytometrie, Immunfluoreszenz oder Expressionsprofilierung (z. B. durch RNA-Sequenzierung [RNAseq] oder Mikroarray), wie zuvor beschrieben12.</li>
	<li>Führen Sie eine zytometrische Flussanalyse durch Gating für Liniennegative Zellen (Lin-: negativ für Lineage-Marker CD45 [Leukozytenmarker], CD31 [endotheliale Zellmarker] und TER119 [Erythrozytenmarker]) durch und analysieren Sie die Zellen im Tumor anhand ihrer Expression von YFP, CD24 und CD29.</li>
</ol>

<ol><li>Wagner, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-mediated+gene+deletion+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cre-mediated gene deletion in the mammary gland.</a> Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).</li>
<li>Selbert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+BLG-Cre+mediated+gene+deletion+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland.</a> Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).</li>
<li>Jonkers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+tumor+suppressor+activity+of+BRCA2+and+p53+in+a+conditional+mouse+model+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer.</a> Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).</li>
<li>van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RUNX1%2C+a+transcription+factor+mutated+in+breast+cancer%2C+controls+the+fate+of+ER-positive+mammary+luminal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells.</a> eLife. 3, e03881(2014).</li>
<li>Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Long-Lived+Luminal+Subpopulation+Enriched+with+Alveolar+Progenitors+Serves+as+Cellular+Origin+of+Heterogeneous+Mammary+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors.</a> Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+mutation+of+Brca1+in+mammary+epithelial+cells+results+in+blunted+ductal+morphogenesis+and+tumour+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation.</a> Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETV6-NTRK3+fusion+oncogene+initiates+breast+cancer+from+committed+mammary+progenitors+via+activation+of+AP1+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex.</a> Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+loss+of+BRCA1+and+p53+in+mice+induces+mammary+tumors+with+features+of+human+BRCA1-mutated+basal-like+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).</li>
<li>Molyneux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+basal-like+breast+cancers+originate+from+luminal+epithelial+progenitors+and+not+from+basal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).</li>
<li>Koren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIK3CA+induces+multipotency+and+multi-lineage+mammary+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours.</a> Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).</li>
<li>Van Keymeulen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+multipotency+by+oncogenic+PIK3CA+induces+breast+tumour+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity.</a> Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).</li>
<li>Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+p53+loss+in+mouse+luminal+cells+causes+clonal+expansion+and+development+of+mammary+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours.</a> Nature Communications. 8, 14431(2017).</li>
<li>Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+Tracing+of+Mammary+Epithelial+Cells+Using+Cell-Type-Specific+Cre-Expressing+Adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses.</a> Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).</li>
<li>Sutherland, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+of+origin+of+small+cell+lung+cancer%3A+inactivation+of+Trp53+and+Rb1+in+distinct+cell+types+of+adult+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung.</a> Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).</li>
<li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).</li>
<li>The Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li>
<li>Nik-Zainal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+history+of+21+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The life history of 21 breast cancers.</a> Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).</li>
<li>Abba, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Molecular+Portrait+of+High-Grade+Ductal+Carcinoma+In+Situ%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ.</a> Cancer Research. 75 (18), 3980-3990 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Der Erfolg dieses Ansatzes zur Induktion von Brusttumoren aus verschiedenen Subpopulationen von MECs hängt nicht nur von der Wahl geeigneter zelltypspezifischer Promotoren (um die Cre-Expression zu fördern), sondern auch von der intraduktiven Injektion selbst ab. Die Idee hinter diesem Ansatz ist, dass die injizierten Ad-Cre-Viren im duktalen Baum zurückgehalten werden, der eine verborgene Struktur mit Lumen ist, und daher sind nur MECs den Viren ausgesetzt und werden von Ad-Cre infiziert. Aufgrund des begrenzten Lumenra...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Entwicklung eines neuen Ansatzes zur Modellierung von Brustkrebs auf der Grundlage einer intraduktiven Injektion von Ad-Cre in die Maus MG. Der Cre/loxP-Rekombinationsansatz wurde häufig verwendet, um menschlichen Brustkrebs bei Mäusen zu modellieren. Die erste Generation von Cre/loxP-basierten Brustkrebsmausmodellen wird durch verwendung von cre-exzessienten transgenen Mäusen unter der Kontrolle von MEC-spezifischen Promotoren (z. B. MMTV-Cre für luminale MECs und einen Teil der basalen MECs, Wap-Cre und Blg-Cre für luminale Vorläufer und alveolare Leuchtdichte MECs, K14-Cre für Basal und einen Teil der luminalen MECs1,2,3,4,5)6, 7 , 8 , 9. Während diese transgenen Cre-Linien zwar die räumliche Kontrolle des Cre-Expressions (d. h. in verschiedenen Teilmengen von MECs) ermöglichen, erlauben sie jedoch keine zeitliche Kontrolle der Cre-Expression und der Cre/loxP-vermittelten genetischen Manipulation. Die zweite Generation von Cre/loxP-basierten Brustkrebs-Mausmodellen nutzt induzierbare Cre-Aktivitäts-/Expressionsansätze (z. B. Verwendung von Cre-Östrogen-Rezeptor-Fusion [CreER], die nur eine Cre/LoxP-Rekombination bei Verabreichung von Tamoxifen induzieren kann), und Daher ermöglichen diese genetischen Werkzeuge sowohl räumliche als auch zeitliche Kontrollen der Aktivierung onkogener Ereignisse in MECs (z. B. K8-CreER-und K5-CreER-basierteModelle)10,11,12 . In beiden Generationen von Brustkrebsmausmodellen können als Promotoren, die zur Antrieb von Cre- oder CreER-Expression (z. B. Krt8, Krt5) verwendet werden, auch in Epithelzellen anderer Organe aktiv sein (d. h. sie sind zelltypspezifisch, aber nicht organspezifisch) oder haben eine undichte Expression in anderen Zelltypen als Epithelzellen (z. B. MMTV, die undichte Aktivität in hämatopoetischen Knochenmarkzellen hat), können diese Ansätze zur Entwicklung unerwünschter Krebserkrankungen in anderen Organen führen. Wenn diese unerwarteten Krebsarten bei den betroffenen Mäusen eine Letalität verursachen, kann der ursprüngliche Zweck der Modellierung von Brustkrebs bei diesen Mäusen verboten sein (z. B. MMTV-Cre-getriebeneonkogene Ereignisse können zu hämatopoetischen Malignitäten und einem frühen Tod der Mäuse führen. , aufgrund der Leckage des MMTV-Promotors in hämatopoetischen Zellen)4. 
Hier berichten wir über einen Ansatz zur Brustkrebsmodellierung bei Mäusen, der sowohl zelltyp- als auch organspezifische Manipulationen onkogener Ereignisse in zeitlich kontrollierter Weise ermöglicht. Dieser Ansatz basiert auf einer intraduktiven Injektion von Ad-Cre in Maus-MGs (und ist somit organspezifisch). Die Cre-Expression kann durch die Verwendung verschiedener MEC-Subpopulations-spezifischer Promotoren gesteuert werden, die in den adenoviralen Vektor eingebettet sind (z. B. Krt8 für luminale MECs, Krt5 für Basal-MECs, wodurch eine zelltypische Spezifität erreicht wird). Die Krebsinduktion in MGs kann zeitlich durch eine Injektion von Ad-Cre in Mäuse in verschiedenen Altersstufen kontrolliert werden, beginnend mit 3-4 Wochen (Pubertät) bis zum Erwachsenenstadium.

<table><tbody><tr><td>33-Gauge-Nadel</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>Point Style 3 stumpfe</td></tr><tr><td>7mm Reflex Clip</td><td>Braintree Scientific</td><td>RF7 CS</td><td></td></tr><tr><td>Adenovirus, Ad-K5-Cre</td><td>University of Iowa Viraler Vektorkern</td><td>Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547)</td><td></td></tr><tr><td>Adenovirus, Ad-K8-Cre</td><td>University of Iowa Viraler Vektorkern</td><td>Ad5mK8-nlsCre</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol</td><td>Fisher</td><td>HC800-1GAL</td><td>Vorbereiten auf 70 % des Gebrauchs</td></tr><tr><td>biotinyliertes CD31</td><td>eBiosciences</td><td>13-0311-85</td><td></td></tr><tr><td>biotinyliertes CD45</td><td>eBiosciences</td><td>13-0451-85</td><td></td></tr><tr><td>biotinyliertes TER119</td><td>eBiosciences</td><td>13-5921-85</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenol Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>CD24-AF-700</td><td>BD Pharmingen</td><td>564237</td><td></td></tr><tr><td>CD24-PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0242-83</td><td></td></tr><tr><td>CD29-APC</td><td>eBiosciences</td><td>17-0291-82</td><td></td></tr><tr><td>CD29-PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0291-82</td><td></td></tr><tr><td>Haarentferner-Lotion</td><td>Nair</td><td></td><td>9 Oz</td></tr><tr><td>Hamilton Spritze</td><td>Hamilton</td><td>7636-01</td><td>0,025 mL</td></tr><tr><td>Iodophore</td><td>Betadin</td><td></td><td>10% Povidon-Jod</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter</td><td>NDC 10019-360-40</td><td>1-2,5%</td></tr><tr><td>Loxicam</td><td></td><td>Norbrook NDC 55529-040-10</td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>Gleitmittel Augensalbe</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-062-35</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Präparierschere</td><td>Pentair</td><td>9M</td><td>Uhrmacherzange</td></tr><tr><td>Mikro-Präparierpinzette</td><td>Dumont</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>Taq 5X Mastermix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0285L</td><td></td></tr></tbody></table>

modellierung von brustkrebs über eine intraduktive injektion des cre-expressingavirus in die maus-mammary drüse

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

Brustkrebs ist eine heterogene Krankheit, möglicherweise aufgrund komplexer Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Ursprungszellen und onkogenen Ereignissen. Mausmodelle sind entscheidend, um Einblicke in diese komplexen Prozesse zu gewinnen. Obwohl viele Mausmodelle entwickelt wurden, um Beiträge verschiedener onkogener Ereignisse und Ursprungszellen zur Brusttumorigenese zu untersuchen, sind diese Modelle oft nicht zelltyp- oder organspezifisch oder können die Initiation einer Brusttumorigenese in einem zeitlich gesteuerte Art und Weise. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Generierung einer neuen Art von Brustkrebsmausmodellen, die auf der intraduktiven Injektion des Cre-expressing adenovirus (Ad-Cre) in Maus-Mammary Drüsen (MGs) basieren. Durch die direkte Injektion von Ad-Cre in Brustkanäle ist dieser Ansatz MG-spezifisch, ohne unerwünschte Krebsinduktion in anderen Organen. Das intrauktale Injektionsverfahren kann bei Mäusen in verschiedenen Stadien ihrer MG-Entwicklung durchgeführt werden (daher ermöglicht es eine zeitliche Kontrolle der Krebsinduktion, beginnend mit einem Alter von 3-4 Wochen). Die Zelltyp-Spezifität kann erreicht werden, indem verschiedene zelltypspezifische Promotoren verwendet werden, um die Cre-Expression im adenoviralen Vektor zu fördern. Wir zeigen, dass luminale und basale Brustepithelzellen (MECs) durch eine intraduktive Injektion von Ad-Cre unter der Kontrolle des Keratin 8 bzw. Keratin 5-Promotors gezielt für die Cre/loxP-basierte genetische Manipulation eingesetzt werden können. Durch die Einbeziehung eines bedingten Cre-Reporters (z.B. Cre/loxP-inducible Rosa26-YFP-Reporter) zeigen wir, dass MECs, die von Ad-Cre ins Visier genommen werden, und von ihnen abgeleitete Tumorzellen nach der intraduktiven Injektion den Reporter-positiven Zellen folgen.

Repräsentative PCR-Genotypisierungsergebnisse für die R26Y- und Trp53 L-Allele sind in Abbildung 1dargestellt.
Obwohl grundsätzlich alle 10 MGs dem intraduktiven Injektionsverfahren unterzogen werden können, werden praktisch die beiden vierten Leisten-MGs aufgrund ihrer leichterenZugänglichkeit und größerer MG-Größen (Abbildung 2) zur Injek...

Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen neuen Ansatz zur Modellierung von Brustkrebs zu beschreiben, der auf der intraduktiven Injektion von Cre-expressing adenovirus in Maus-Mammary-Drüsen basiert. Dieser Ansatz ermöglicht sowohl eine zelltyp- als auch organspezifische Manipulation onkogener Ereignisse in zeitlich kontrollierter Weise.

Modellierung von Brustkrebs über eine intraduktive Injektion des Cre-expressingAvirus in die Maus-Mammary Drüse

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Dieses Protokoll wird Forschern helfen, eine neue Art von Mausmodell zu generieren, um die Entwicklung von menschlichem Brustkrebs aus verschiedenen Teilmengen von Brustepithelzellen zu rekapitulieren. Diese Technik ermöglicht es Forschern, Brustkrebs-Maus-Modelle im Entwicklungsstadium Gewebe auf eine zelltypspezifische Weise und ohne die Notwendigkeit einer umfangreichen Mauszucht zu generieren. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, generieren, warten und anästhesieren Sie floxierte Mäuse, wie im Textprotokoll beschrieben.Bringen Sie die Maus in einen Bereich, der von dem Ort getrennt ist, an dem die Operation durchgeführt werden soll. Nach Bestätigung der Anästhesie durch Durchführung einer Zehenprise, injizieren Meloxicam als Analgesie subkutan in einer Dosis von fünf Milligramm pro Kilogramm, um für den chirurgischen Eingriff vorzubereiten. Setzen Sie die Brustwarzen chirurgische Stelle durch die Anwendung mehrerer Tropfen Haarentfernung Creme.Entfernen Sie übermäßige Creme und lockeres Haar mit weichen Papiertüchern. Rasieren wird nicht empfohlen, um Schäden an den Brustwarzen zu vermeiden. Desinfizieren Sie die chirurgische Stelle mit Iodophoren zuerst gefolgt von 70%Alkohol

modeling-breast-cancer-via-an-intraductal-injection-cre-expressing

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

In diesem Artikel diskutieren wir, wie man ein Brustkrebsmodell bei weiblichen Mäusen etablieren kann, indem Brustkrebszellen in das Brustfettpolster injiziert werden. Das Beispielprotokoll demonstriert die orthotope Injektion.

Orthotope Injektion in das Brustfettpolster: Etablierung von Brustkrebs bei Mäusen

Dieses Video beschreibt eine intraduktale Injektionstechnik, bei der wir Injektionsmischung in die Kanäle der Brustdrüsen von Mäusen einbringen.

Intraduktale Injektion: Abgabe der Injektionsmischung in die Kanäle der Brustdrüse der Maus

Ein Protokoll für die nicht-invasive intraductal Lieferung von wässrigen Reagenzien zu der Brustdrüse der Maus beschrieben. Die Methode nutzt lokalisierte Injektion in den Brustwarzen der Brustdrüsen Targeting Milchgänge speziell. Diese Technik ist für eine Vielzahl von Verbindungen, einschließlich siRNA, chemotherapeutischen Mitteln und kleinen Molekülen anpaßbar.

Intraduktale Injection für Lokalisierte Drug Delivery auf die Maus Milchdrüse

Die Aktivierung von latenten Mutationen mit Adenovirus-Cre im duktalen System der Brust führt zu einem klinisch relevanten metastasierten Brustkrebs. Der Einbau eines YFP-Promotors ermöglicht die Verfolgung von distalen metastasierten Tumorzellen. Dieses Modell ist nützlich, um latente Metastasen und Anti-Tumor-Immunität zu untersuchen und neuartige Immuntherapien zur Behandlung von Brustkrebs zu entwickeln.

Initiation Metastasierende Mammakarzinom durch Targeting des duktalen Epithel mit Adenovirus-Cre: Eine neue transgene Maus-Modell der Brustkrebs

Krebs ist eine komplexe Erkrankung, die durch den den Tumor umgebenden Gewebes sowie lokale pro- und anti-inflammatorischen Mediatoren beeinflusst wird. Daher kann orthotrope Pritzer, anstatt subkutanen Modellen nützlich sein, um Krebsprogression in einer Weise, dass eine bessere ahmt menschlichen Pathologie studieren.

Orthotopische Injektion von Brustkrebszellen in das Brustfettpolster von Mäusen, das Tumorwachstum zu studieren.

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Brustkrebs-Zellen in der Mamma Fettpolster in einer einfachen, weniger invasiv und einfach zu handhabende Möglichkeit, einzupflanzen und dieses orthotopen Brust Krebs Mausmodell mit einer richtigen Mamma Fettlappen Umgebung kann verwendet werden, um verschiedene Aspekte zu untersuchen Krebs.

Orthotopen Injektion von Brustkrebs-Zellen in den Mäusen Mamma Fettlappen

Patientenbasierte Xenograft-Modelle (PDX) und transplantierbare gentechnisch veränderte Mausmodelle rekapitulieren menschliche Krankheiten originalgetreu und sind bevorzugte Modelle für die grundlegende und translationale Brustkrebsforschung. Hier wird eine Methode beschrieben, Brusttumorfragmente orthotopisch in das Brustfettpolster zu transplantieren, um die Tumorbiologie zu untersuchen und die Arzneimittelreaktion zu bewerten.

Orthotope Transplantation von Brusttumoren als präklinische Modelle für Brustkrebs

Wir beschreiben ein Xenotransplantat-Mausmodell für Brustkrebs-Hirnmetastasen, die durch Schwanzveneninjektion einer endogen HER2-amplifizierten entzündlichen Brustkrebszelllinie erzeugt werden.

Modellierung der Hirnmetastasierung durch Injektion von entzündlichen Brustkrebszellen in die Schwanzvene

Es wird ein Verfahren der intraduktalen Injektion von Reagenzien für eine ethanolbasierte ablative Lösung in den maktalen Brustbaum der Maus zur In-vivo-Bildgebung und Brustkrebsprävention beschrieben. Die Injektion direkt in die Brustwarzenöffnung ermöglicht das Targeting von Brustepithelzellen mit minimalen Kollateralschäden.

Intraduktale Verabreichung und Röntgenvisualisierung von Ethanol-basierter ablativer Lösung zur Prävention und lokalen Behandlung von Brustkrebs in Mausmodellen

Es wird ein Verfahren zur Abgabe einer chemischen ablativen Lösung an den Brustduktalbaum der Ratte zur bildgeführten präventiven Behandlung von Brustkrebs beschrieben. Brustepithelzellen können mit minimalen Kollateralgewebeschäden durch Kanülierung direkt in die Brustwarzenöffnung und intraduktale Infusion einer 70% Ethanol-basierten ablativen Lösung gezielt angegriffen werden.

Röntgenvisualisierung einer intraduktalen ethanolbasierten ablativen Behandlung zur Prävention von Brustkrebs in Rattenmodellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die intraduktale Injektion von viralen Vektoren über die Zitze, um Gene von Interesse in die Brustepithelzellen einzuschleusen.

Im lebenden Organismus Gentransfer in Brustepithelzellen der Maus durch intraduktale Injektion in der Brust

Erfahren Sie die intraduktale Injektion von Cre-exprimierendem Adenovirus in Mäuse-Mammardrüsen zur Modellierung von Brustkrebs. Diese Methode ermöglicht zellspezifische Manipulation onkogener Ereignisse ohne aufwendige Zuchtstrategien.

Modellierung von Brustkrebs über eine intraduktive Injektion des Cre-expressingAvirus in die Maus-Mammary Drüse

Weitere Videos entdecken