Name: Gewinnung von wässrigen Metaboliten aus kultivierten Adherenten Zellen für die metabolomische Analyse durch die kapitänische Spektrometrie Elektrophoresis-Mass (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-09T23:59:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Lernen Sie die Extraktion wässriger Metabolite aus kultivierten Krebszellen für metabolomische Analysen mittels Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie. Diese zuverlässige Methode ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse in der Krebsforschung.

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Wir bedanken uns bei allen Mitgliedern des Shonai Regional Industry Promotion Centers für ihre Hilfe. Diese Arbeit wurde unter anderem durch Forschungsmittel der Präfektur Yamagata und der Stadt Tsuruoka, durch den Forschungs-und Entwicklungsfonds des National Cancer Center [Grant-Nummer 28-A-9] und durch die Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI unterstützt. 17K07189] bis HM.

1. Zellkultur am 1. Tag
Hinweis: Jede Probe für die Stoffwechselextraktion sollte aus einer einzigen 100-mm-Gewebekulturschale zubereitet werden, die mäßig, aber nicht vollständig verwirrend ist (mit etwa 2 – 5 Millionen Zellen). Berechnen Sie die Anzahl der für den Test benötigten Gerichte und bereiten Sie sie entsprechend vor.
<ol><li>Kultur HCC827 und PC-9-Zellen in 5% CO 2 bei 37 ° C in RPMI-1640 Medium ergänzt mit 10% fetalen Rinderserum (FBS).</li>
	<li>Aspiration die Zellkulturmedien aus den 100-mm-Kulturgerichten.</li>
	<li>Waschen Sie Zellen auf jeder Schüssel mit 2 ml Phosphat-gepufferten Saline (PBS) Lösung ohne Kalzium und Magnesium. Jedes Gericht sanft rocken, so dass die PBS-Lösung die Oberfläche der Schale vollständig abdeckt.</li>
	<li>Den Waschpuffer aus den Kulturgerichten aufsaugen.</li>
	<li>Warm 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung auf 37 ° C und 2 mL Trypsin-EDTA-Lösung mit einer 5 mL serologischen Pipette hinzufügen. Jedes Gericht so sanft felsen, dass die Trypsin die Oberfläche der Schüssel vollständig bedeckt.</li>
	<li>Die Kulturgerichte bei 37 ° C ca. 5 min einverwöhnen.</li>
	<li>Fügen Sie 4 ml vorgewärmtes komplettes Wachstumsmedium pro Schüssel hinzu. Die Zellen in Medium wiederbeleben, indem Sie mehrmals sanft pipettieren.</li>
	<li>Jede Zellaufhängung auf ein separates 15 mL konisches Rohr und Zentrifuge mit 800 × g für 5 min übertragen.</li>
	<li>Resuspend jedes Zellpellet in 2 mL vorgewärmtem Gesamtwachstumsmedium.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Gesamtzahl und die prozentuale Lebensfähigkeit der Zellen mit dem automatisierten Zellzähler und 0,4% trypan blauer Lösung.<ol>
<li>Mischen Sie 10 μL Zellaufhängung und 10 μL von 0,4% Trypan Blue-Lösung.</li>
		<li>Laden Sie 10 μL Probe in die Zellzählkammer rutschen durch Kapillarwirkung.</li>
		<li>Legen Sie den Kammerrutsch in den automatisierten Zellzähler. Das übertragene Licht leuchtet automatisch aus und das Instrumentenauto konzentriert sich auf die Zelle.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Aufnahmetaste, um das Bild zu erfassen und die Ergebnisse anzuzeigen.</li>
		<li>Wenn nötig, fügen Sie ein weiteres Wachstumsmedium hinzu, um die gewünschte Zellkonzentration zu erhalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Saatgut sind etwa 1 – 2,5 Millionen Zellen pro 100 mm Zellkulturschale. Hinweis: Die durch die CE-MS-Analyse ermittelten Stoffwechselkonzentrationen werden auf der Grundlage der Anzahl der lebensfähigen Zellen normalisiert. Für die Zellzählung ist es notwendig, für jede Gruppe mindestens ein zusätzliches Saatgut zuzubereiten.</li>
	<li>Die Kulturgerichte in 5% CO 2 bei 37 ° Cfür 18 Stunden anfärmen.</li>
</ol>2. Zubereitung von Reagenzien
<ol><li>Verdünnen Sie eine kommerzielle interne Standardlösung mit L-Methion-Sulfon und D-Camphor-10-Sulfonsäure 1000-fach in ultrareinem Wasser. Hinweis: Für weniger als 80 Proben einfach 50 μL der internen Standardlösung 1 und 45 ml ultrareines Wasser in eine 50 ml volumetrische Flasche mischen, dann die Lösung bis zu 50 ml mit ultrareinem Wasser mitbringen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 0,05 g/mL Mannitol-Lösung in ultrareinem Wasser als Waschpuffer vor. Achtung: Für weniger als 30 Proben einfach 25 g Mannitol in 500 ml ultrareines Wasser auflösen. Pro 100 mm Kulturschale werden ca. 15 ml Waschpuffer benötigt, so dass je nach Anzahl der Proben ein ausreichendes Volumen an Waschpuffer erstellt wird.</li>
</ol>3. Vorwasch-Zentrifugalfiltereinheiten
<ol><li>Pipette 250 μL ultrareines Wasser in die Filterbecher jeder Zentrifugalfiltereinheit (siehe Materialtabelle). Achtung: Pro Probe werden zwei Filtereinheiten benötigt.</li>
	<li>Die Filtereinheiten fest und zentrifuge bei 9,100 × g bei 4 ° C für 5 min fest und zentrifuge.</li>
	<li>Überprüfen Sie das Volumen jedes Filtrats — wenn sich bei der ersten kurzen Drehung signifikantes Filtrat angesammelt hat, kann die Filtereinheit defekt sein. In diesem Fall die Filtereinheit ablegen und stattdessen eine neue Filtereinheit verwenden.</li>
	<li>Schließen Sie die Deckel der Filtereinheiten fest und zentrifuge bei 9,100 × g bei 4 ° C für 30 min wieder.</li>
	<li>Achten Sie darauf, dass in keinem der Filterbecher ultrareines Wasser verbleibt; Entfernen Sie das gefilterte ultrareines Wasser in jedem Sammelrohr mit einer Pipette und werfen Sie ab. Hinweis: Versuchen Sie nicht, Restwasser in einem Filterbecher mit einer Pipette zu entfernen, da es den Filter beschädigen kann.</li>
	<li>Die Filterbecher in ihre Sammelrohre legen. Hinweis: Verwenden Sie die Zentrifugalfiltereinheiten innerhalb einer Stunde, da die Filter beim Trocknen beschädigt werden können.</li>
</ol>4. Zellkultur am 2. Tag
<ol><li>
Die 100-mm-Kulturgerichte aus dem Inkubator herausnehmen. Hinweis: Die empfohlene Zellkulturdauer beträgt 18 Uhr.</li>
	<li>Aspirieren Sie das Zellkulturmedium aus jedem 100 mm Kulturgericht.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Gericht 10 ml Zellkulturmedium hinzu, das die entsprechenden Konzentrationen von Verbindungen oder Medikamenten enthält, wobei darauf geachtet wird, die Zellschicht nicht zu stören. Hinweis: Für Demonstrationszwecke haben wir in diesem Experiment 10 μL 250 mM-Diamid, die in PBS (Endkonzentration von 250 μM) aufgelöst wurden, hinzugefügt.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Kulturgerichte bei 37 ° C für 30 min in Anwesenheit von Diamid oder PBS als Kontrolle.</li>
	<li>Aspirieren Sie das Zellkulturmedium aus jedem 100 mm Kulturgericht.</li>
	<li>Waschen Sie Zellen, indem Sie sanft 2 ml von 5% Mannitol-Lösung an den Rand jeder Schüssel legen, wobei darauf geachtet wird, die Zellschicht nicht zu stören, und dann die Schale leicht kippen. Hinweis: PBS oder Salzlösung stören sich in die CE-MSS-basierte Metabolomische Analyse und wirken sich negativ auf die Messergebnisse aus und sollten daher nicht als Waschpuffer verwendet werden.</li>
	<li>Aspirieren Sie den Waschpuffer von jeder Kulturschale, dann waschen Sie die Zellen wieder, indem Sie sanft 10 ml Waschpuffer pro Schüssel hinzufügen und die Schüssel leicht kippen.</li>
	<li>Den Waschpuffer vom Rand jedes Kulturgerichts völlig absaugen. Hinweis: Aspirieren Sie so viel Wäschepuffer wie möglich, während Sie darauf achten, die Zellen nicht zu saugen. Restmannitol kann die CE-MS-Analyse stören; Das Streben nach Zellen wird die Anzahl der Zellen verringern und so zu einer Quelle von Fehlern bei der Normalisierung der Daten werden.</li>
</ol>5. Extraktion von Metaboliten aus kultivierten Zellen
<ol><li>Pro Kulturgericht 800 μL von 99,7% Methanol hinzufügen. Jede Kulturschale wird sanft hin-und hergestromt, um ihre gesamte Oberfläche zu bedecken. Lassen Sie das Geschirr bei Zimmertemperatur für 30 s.</li>
	<li>Fügen Sie langsam 550 μL der verdünnten internen Standardlösung pro Schüssel hinzu, indem Sie die Spitze der Pipette in das Methanol eintauchen und mehrmals sanft nach oben und unten kippen.</li>
	<li>Jede Kulturschale wird sanft hin-und hergestromt, um ihre gesamte Oberfläche zu bedecken.</li>
	<li>Lassen Sie das Geschirr bei Zimmertemperatur für 30 s.</li>
</ol>6. Ultrafiltration von Zellextrakten
<ol><li>Übertragen Sie die extrahierte Lösung von jedem Kulturgericht auf ein separates 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.</li>
	<li>Zentrifuge die Röhren bei 2.300 × g bei 4 ° C für 5 min.</li>
	<li>Übertragen Sie 350 μL eines jeden Supernatants in zwei Zentrifugalfiltereinheiten pro Probe. Hinweis: Aus jeder Kulturschale werden insgesamt 700 μL der extrahierten Lösung in zwei Filterrohre (350 μL/tube) übertragen.</li>
	<li>Die Filterrohre bei 9,100 × g bei 4 ° C ca. 2 h zentrifugen, bis keine Flüssigkeit in den Filterbechern bleibt.</li>
	<li>Die Filterbecher entfernen und die Deckel der Sammelrohre fest verschließen.</li>
</ol>7. Probenverdampfung
<ol><li>Bereiten Sie einen Zentrifugalverdampfer vor — typischerweise besteht dies aus einem Verdampfer, einer Kaltfalle und einer Vakuumpumpe.</li>
	<li>Die Sammelrohre in den Zentrifugalverdampfer legen. Achtung: Die Deckel der Rohre offen lassen.</li>
	<li>Die extrahierten Probenlösungen unter Vakuumbedingungen bei Raumtemperatur verdampfen. Hinweis: Typische Konfigurationen für die Anzahl der Rotationen und des Drucks sind 1.500 U/min bzw. 1.000 Pa, und es dauert in der Regel etwa 3 Stunden, um die Proben vollständig zu verdampfen.</li>
	<li>Bestätigen Sie, dass keine Flüssigkeit in einem der Sammelrohre verbleibt und schließen Sie die Deckel der Rohre fest.</li>
	<li>Bewahren Sie die Sammelrohre in einem extrem niedrigen Temperaturbereich (− 80 ° C) bis zur metabolomischen Analyse auf.</li>
</ol>8. Metabolomische Analyse von CE-MS
<ol><li>Das Filtrat in 50 μL ultrareines Wasser unmittelbar vor der CE-MS-Analyse wiederverwenden.</li>
	<li>Führen Sie die CE-MS-Analyse mit denbisher beschrieben 12,13mit dem kapillaren Elektrophoresystem und dem Zeitvernahmanag-System Massenspektrometer, das mit einer isokratischen Pumpe, einem CE-MS-Adapter und einem CE-ESI-MS-Sprayer ausgestattet ist. Hinweis: Beide Systeme lassen sich über die Software der Systemhersteller steuern und sind durch eine geschmolzene Siliziumkapillare (50 μm Innendurchmesser × 80 cm Gesamtlänge) verbunden.<ol>
<li>Instrumente und Probenschwingungen aufstellen, die Kapillare mit einer Kapillarkassette aufbereiten, die Hüllenflüssigkeiten und die entsprechenden Elektrophorese-Puffer je nach Anion-oder Kationenanalysemodus auffüllen und dann Spannungen anwenden. Hinweis: Instrumentierung und analytische Bedingungen werden an anderer Stelle 12,13ausführlich beschrieben.</li>
		<li>Öffnen Sie die Software und erstellen Sie eine Werkliste mit Datenerfassungsmethoden und Musterinformationen.</li>
		<li>Starten Sie einen Testlauf und überprüfen Sie die Daten wie die Signalintensität und die Spitzenform interner Standards und die Spitzenauflösung anderer Standardverbindungen.</li>
		<li>Die analytischen Bedingungen gegebenenfalls anpassen.</li>
		<li>Die Musterlösungen mit 50 mbar für 3 s und einer Spannung von 30 kV injizieren. Hinweis: CE-MS wurde entweder im positiven oder negativen Ionenmodus durchgeführt. Stellen Sie das Spektrometer ein, um den Massenbereich m/50 – 1000 zu scannen. Die Kapillarspannung wurde auf 4 kV eingestellt; Die Durchflussrate des Stickstoffgases (Heizungstemperatur 300°C). Für den positiven Modus wurden die FRFV-Spannung von Fragmentor, Skimmer und OCT auf 75, 50 bzw. 125 V eingestellt. Für den negativen Ionenmodus wurde die FRFV-Spannung des Fragmentors, Skimmer und OCT auf 100, 50 und 200 V festgelegt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse von Spektrumdaten.<ol>
<li>Extrahalbesitzel aus den Massenspektraldaten mit automatischer Integrationssoftware, um Peak-Informationen wie m/z, Peak-Bereich und Migrationszeit (MT) zu erhalten. Hinweis: Die Methode wird an anderer Stelle 14ausführlichbeschrieben.</li>
		<li>Ausschließen Sie Signalspitzen, die Isotopomen, Addukt-Ionen und anderen Produktionen bekannter Metaboliten entsprechen.</li>
		<li>Kommentieren Sie die verbleibenden Spitzen mit Informationen aus der HMT-Metababolitendatenbank nach m/z-Werten und MTs.</li>
		<li>Normalisieren Sie Bereiche der kommentierten Spitzen auf interne Standardwerte und Zellzahlen pro Probe.</li>
		<li>Bewerten Sie die Konzentration jedes Metaboliten in den kultivierten Zellen (pmol/10 6Zellen ) mit Standardkurven, die für jeden Metaboliten vorbereitet werden.</li>
		<li>Nutzen Sie die quantifizierten Stoffwechselkonzentrationen für nachfolgende statistische Analysenund biologische Interpretationen 14.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lunt, S. Y., Vander Heiden, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerobic+glycolysis%3A+meeting+the+metabolic+requirements+of+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Aerobic glycolysis: meeting the metabolic requirements of cell proliferation.</a> Annual Review Cell and Developmental Biology. 27, 441-464 (2011).</li>
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<li>Sugimoto, M., Wong, D. T., Hirayama, A., Soga, T., Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+mass+spectrometry-based+saliva+metabolomics+identified+oral%2C+breast+and+pancreatic+cancer-specific+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles.</a> Metabolomics. 6 (1), 78-95 (2010).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier beschreiben wir eine allgemein zugängliche Methodik zur Vorbereitung von Metaboliten aus kultivierten Krebszellen auf die auf CE-MS basierende metabolomische Analyse. Einer der kritischsten Punkte in diesem Protokoll ist die richtige Aufbereitung von Krebszellen, da die gemessenen Stoffwechselkonzentrationen auf die Anzahl der lebensfähigen Zellen normalisiert werden. Für die genaue Abschätzung der Zellzahl ist es notwendig, mindestens ein zusätzliches Kulturgericht pro Experimentengruppe vorzubereiten, um die Anzahl der lebensfähigen Zellen parallel zur Extraktion von Metaboliten für die metabolomische Analyse zu zählen. Darüber hinaus sollte in jedem Teller die gleiche Anzahl von Zellen für die Replikate und in der Schüssel für das Zählen gesät werden; In Zukunft würde dies durch ein schnelles und stressfreies (z.B. trypsinfreies) Zellzählprotokoll unterstützt, das es erlaubt, die gleiche Schale sowohl für das Zählen lebensfähiger Zellen als auch für den Abbau von Metaboliten zu verwenden. Bei der Wäsche sollte darauf geachtet werden, dass sich die Zellen nicht von der Oberfläche der Geschirr lösen. Schwere Zytotoxizitätstests und andere Experimente, die die Zellhaftung reduzieren, können für dieses Extraktionsprotokoll aufgrund eines möglichen Verlustes von Zellen während des Waschvorgangs ungeeignet sein.
Es ist wichtig, eine 5-prozentige Mannitol-Lösung als Waschpuffer für die Extraktion von Metaboliten aus kultivierten Zellen für die CE-MS-Basis mabolomische Analyse zu verwenden, da salzbasierte Puffer, wie PBS, die metabolomische Analyse stören und die Messung negativ beeinflussen.
Zwei oder drei Gerichte können als Einzelprobe kombiniert werden, indem man Metaboliten aus jeder Schüssel einzeln extrahiert und dann Proben bündelt; Die Kombination mehrerer Gerichte erhöht jedoch oft das Restmannitol in der extrahierten Metabolitenlösung. Dies kann auch die metabolomische Analyse durch CE-MS stören. Daher wird empfohlen, nicht mehrere Gerichte oder Brunnen als eine Probe zu verwenden.
Diese metabolomische Analysemethode mit CE-MS wurde für die umfassende Messung von geladenen Molekülen mit molekularen Gewichten zwischen 50 und 1000 Da entwickelt; So ist dieses Protokoll für die Extraktion von wässrigen, niedermolekularen Verbindungen optimiert. Daher eignet sich dieses Protokoll nicht für die Gewinnung hydrophobischer Metaboliten wie Lipide oder Makromoleküle wie Proteine und Nukleinsäuren. Da die Nachfrage nach umfassenden Lipidanalysen oder Lipidomics kultivierter Zellproben steigt, ist die Entwicklung eines einfachen und effektiven Protokolls zur gleichzeitigen Gewinnung von hydrophilen und hydrophobischen Metaboliten erforderlich.
Der erste Schritt der Stoffwechselextraktion — Aspirationsmedimine und Waschzellen mit Mannitol — sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden, um Veränderungen des Stoffwechselprofils der Zellen zu minimieren. Die Behandlung von Zellen mit Methanol nach dem Waschen mit Mannitol wird angenommen, um Proteine zu dichten und so zu verhindern, dass Enzyme weitere Stoffwechselreaktionen katalysieren. Doch auch nach der Methanolbehandlung können nicht-enzymatische chemische Reaktionen — wie Redoxreaktionen, einige Dekarboxylierungsprozesse und Thiolverbindungen — stattfinden. Daher sollten alle Konzentrationen von Metaboliten, die an diesen Reaktionen beteiligt sind, die durch dieses Protokoll gemessen werden, mit Vorsicht interpretiert werden. Im Gegensatz zum Genom oder Transkriptom besteht das Metabolom aus Molekülen mit einer Vielzahl chemischer Eigenschaften; Daher kann kein einzelnes Protokoll alle Metaboliten ohne Verlust oder Störung extrahieren. Für genauere Messungen solcher hochreaktiven Metaboliten sollte ein speziell entwickeltes Protokoll konsultiert werden, um bestimmte Stoffwechselgruppen zu extrahieren, die Fraktionierungen und Derivate erfordern. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt jedoch eine einfache und schnelle Extraktion wässriger Metaboliten aus kultivierten Zellproben für die metabolomische Analyse von CE-MS. In diesem Beitrag konnten wir nicht beschreiben, wie man CE-MS im Detail aufstellt, weil der Fokus des vorliegenden Manuskripts anders ist, aber die Beschreibung detaillierter Schritte zur Einrichtung von CE-MS kann einen separaten, dedizierten Artikel erfordern.

Otto Warburg beobachtete, dass Krebszellen die ungewöhnliche Fähigkeit erlangen, Glukose aufzunehmen und sie zu gären, um Laktat in Gegenwart von ausreichend Sauerstoff zu produzieren — ein Phänomen, das als Warburg-Effekt oder Aerobic-Glykolyse1,2bezeichnet wird. Als Grundlage für die aeroben Glykolyse in Krebszellen 3 werden mitochondriale Atemdefekte spekuliert. Tatsächlich ist der Warburg-Effekt die Grundlage für die Tumorabbildung durch Fluorodeoxyglukose (FDG)-Positronen-Emissionstomographie (PET), die in der klinischen Praxis4,5weitverbreitet ist. Eine hohe Aerobic-Glykolysegiltals ein wesentliches Merkmal von Krebs und wurde vor kurzem als eines der bekannten "Kennzeichen von Krebs" angenommen, wie es D. Hanahan und B. Weinberg 6 beschrieben haben. Somatische Mutationen in Onkogenen und Tumorsuppressorgenen — wie HRAS/KRAS/NRAS, EGFR, BRAF, MYC, TP53, Isozitrat-Dydrierase (IDH) und Fumarathydratase (FH — mit spezifischen Stoffwechselveränderungen in Krebszellen in Verbindung gebracht wurden, die als Folge des Warburg-Effekts 7 gelten.
Die metabolomische Analyse ist ein vielversprechender Ansatz, nicht nur die Stoffwechselregulation in Krebszellen zu verstehen, sondern auch, um Biomarker im Frühstadium und die Vorhersage der Chemotherapie zu identifizieren. Nach der Behandlung sensibler oder resistenter Krebszellen mit Krebsmittelverbindungen ermöglicht die Verfolgung ihrer Stoffwechselreaktionen die Identifizierung von Stoffwechselbiomarkern, um die Wirksamkeit bestimmter Krebstherapien bei Krebspatienten vorherzusagen 88 ,9,10,11. In diesem Artikel wurden Krebszelllinien, die von einem Lungenadenokarzinom mit einer EGFR-Mutation abgeleitet sind, die mit Diamid — behandelt wird, die oxidativen Stress verursacht — als Modelle für die metabolomische Analyse verwendet wurden. Der Vorteil dieser analytischen Methode mit kapillarer Elektrophoresis-Massenspektrometrie (CE-MS) ist die umfassende Messung von geladenen Metaboliten mit dem Massenbereich m/50-1000 12,13. Der Zweck dieses Artikels ist es, den Novizen ein detailliertes stufenweises visuelles Protokoll zur Herstellung von wässrigen Metaboliten aus kultivierten Krebszellen und anschließender metabolomischer Analyse, insbesondere durch CE-MS, zu liefern.

<table><tbody><tr><td>Automatisierter Zellzähler</td><td>Thermo Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td>Countess II automatisierter Zellzähler</td></tr><tr><td>Automatische Integrationssoftware</td><td>Agilent Technologies</td><td>MassHunter G3335-60041</td><td>Version B.02.00</td></tr><tr><td>CE-System</td><td>Agilent</td><td>Technologies Agilent 7100 CE-System</td><td></td></tr><tr><td>CE/MS-Adapterkit</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1603A</td><td></td></tr><tr><td>CE-ESI-MS Sprühset</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1607A</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger für die Zellzählkammer</td><td>Thermo Scientific</td><td>C10282</td><td>Objektträger für die Zellzählkammer</td></tr><tr><td>Zentrifugalfilter, 5 kDa</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>ULTRAFREE MC PLHCC, UFC3LCCNB-HMT</td><td></td></tr><tr><td>Konisches steriles Polypropylen-Röhrchen, 15 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>N339651</td><td></td></tr><tr><td>Konische sterile Tube aus Polypropylen, 50 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>N339653</td><td></td></tr><tr><td>Costar Stripette, 10 ml</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Costar Stripette, 5 ml</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-Mannitol</td><td>Wako</td><td>133-00845</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Elektrophoresepuffer</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>H3301-1001</td><td>für die Kationenanalyse</td></tr><tr><td>Elektrophoresepuffer</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>H3302-1021</td><td>für die Anionenanalyse</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Biowest</td><td>S1780</td><td></td></tr><tr><td>Filterspitze, 1000 &mu; l</td><td>Watson</td><td>124P-1000S</td><td></td></tr><tr><td>Filterspitze, 20 &mu; l</td><td>Watson</td><td>124P-20S</td><td></td></tr><tr><td>Filterspitze, 200 &mu; l</td><td>Watson</td><td>1252-703CS</td><td></td></tr><tr><td>Quarzglas-Kapillare</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP050375</td><td>50 μmu; m i.d. & mal; 80 cm Gesamtlänge</td></tr><tr><td>HCC827</td><td>Amerikanische Kultursammlung</td><td>CRL-2868</td><td></td></tr><tr><td>Interne Standardlösung</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>H3304-1002</td><td></td></tr><tr><td>Isokratische Pumpe</td><td>Agilent Technologies</td><td>Agilent 1100 Serie Isokratische Pumpe</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Wako</td><td>138-14521</td><td>1 L, LC/MS-Qualität</td></tr><tr><td>Mikroröhrchen, 1,5 ml</td><td>Watson</td><td>131-415C</td><td></td></tr><tr><td>Bediensoftware</td><td>Agilent Technologies</td><td>ChemStation G2201AA</td><td>Version B.03.01 für CE</td></tr><tr><td>PC-9</td><td>RIKEN Bio Resource Center</td><td>RCB4455</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Gewebekulturschale, 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Flugzeit-Massenspektrometer</td><td>Agilent Technologien</td><td>Agilent G1969A Time-of-Flight LC/MS</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung, 0,4 %</td><td>Thermo Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Reinstwasser</td><td>Merck</td><td>Milli-Q Wasser</td><td>18,2 M&Omega; &#183; cm reines Wasser</td></tr><tr><td>Messkolben, 50 ml</td><td>Iwaki</td><td>5640FK50E</td><td>TE-32</td></tr></tbody></table>

gewinnung von wässrigen metaboliten aus kultivierten adherenten zellen für die metabolomische analyse durch die kapitänische spektrometrie elektrophoresis-mass

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Die metabolomische Analyse ist ein vielversprechender Omik-Ansatz, um nicht nur die spezifische Stoffwechselregulation in Krebszellen im Vergleich zu normalen Zellen zu verstehen, sondern auch Biomarker für die Krebserkennung und Vorhersage von Chemotherapie-Reaktionen im Frühstadium zu identifizieren. Krebspatienten. Die Vorbereitung einheitlicher Proben für die metabolomische Analyse ist ein kritisches Thema, das noch angegangen werden muss. Hier stellen wir ein einfaches und zuverlässiges Protokoll zur Gewinnung wässriger Metaboliten aus kultivierten, haftenden Zellen zur metabolomischen Analyse vor, die mittels der kapillaren Elektrophoresen-Massenspektrometrie (CE-MS) verwendet wird. Wässrige Metaboliten aus kultivierten Zellen werden durch Kultivierungs-und Waschzellen analysiert, Zellen mit Methanol behandelt, Metaboliten extrahiert und Proteine und Makromoleküle mit Spinnspalten für die CE-MS-Analyse entfernt. Repräsentative Ergebnisse mit Hilfe von Lungenkrebszelllinien, die mit Diamid behandelt werden, einem oxidativen Reagenz, zeigen die deutlich beobachtbare Stoffwechselverschiebung von Zellen unter oxidativem Stress. Dieser Artikel wäre besonders wertvoll für Studenten und Forscher, die an der Metabolomik-Forschung beteiligt sind, die neu sind, um Metaboliten aus Zelllinien zu ernten, um sie von CE-MS zu analysieren.

Da die Stoffwechselkonzentrationen in Krebszellen (pmol/10 6 Zellen) auf die Anzahl der lebensfähigen Zellen normalisiert werden, sollten experimentelle Bedingungen mit Vorsicht geschaffen werden, um die Variation der Anzahl der lebensfähigen Zellen zwischen den Bedingungen zu minimieren. So war die Diamidbehandlung relativ hoch (250 μm), aber für kurze Zeit, um alle Zellen so gleichmäßig wie möglich wachsen zu lassen, wodurch die Anzahl der untersuchten Zellen ausgeglichen wurde. Unter diesen Versuchsbedingungen wuchsen die HCC827 und PC-9-Zellen um 3 Stunden gleich pro Stunde (Abbildung 1). Die CE-MS-Analyse von diamid-behandelten Zellen im Vergleich zu PBS-behandelten (Kontroll-) Zellen ergab 175 bzw. 150 Differentialmetabolite in HCC827 bzw. PC-9-Zellen. Darunter waren mehrere Zwischenprodukte im Pentose-Phosphatweg (PPP) und in der oberen Glykolyse in den diamidbehandelten Bedingungen in beiden Zelllinien signifikant höher, während einige wenige Trikarbonsäure (TCA) Zyklusmittler in den behandelten Die Bedingungen (Bild 2 und Bild 3).
Das PPP erzeugt Reduktionsäquivalente in Form von reduziertem Nikotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat (NADPH), das zur Versorgung mit Rehox-Homöostasen und Fettsäure zur Biosynthese 15 verwendet wird. Nach der Diamidbehandlung — sich der Gehalt an Gluconsäure — einer oxidierten Glukose in HCC827-Zellen um das 12-fache und in PC-9-Zellen um das Zehnfache erhöht; Ähnlich vermehrt sich nach der Diamidbehandlung der Gehalt an Glukose-6-Phosphat (G6P)—a phosphorylizener Glukose und das erste hexokinase-katalysierte Glykolyse-Produkt — ebenfalls um 6,3-und 3,5-fach in HCC827 bzw. PC-9-Zellen (Abbildung4). Darüber hinaus hat sich nach der Diamidbehandlung der Gehalt an 6-Phosphogluconat (6PG)—the ersten Zwischenprodukt in PPP — in HCC827-Zellen dramatisch um das 89-Fache und in PC-9-Zellen im Vergleich zu den PBS-Steuerungen (Abbildung4) um das 231-fache erhöht. Im Gegensatz dazu änderten sich die Niveaus anderer glykolytischer Zwischenprodukte, wie Fructose 6-Phosphat (F6P) und Fructose 1,6 bisphosphat (F1,6P), im Diamidexperiment-Bedingung nicht (Abbildung4). Der gesamte Nikotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphatgehalt (NADP+) entsprach fast gleichwertig zwischen der Behandlung von Diamidbehandlungen und den PBS-Kontrollbedingungen (Abbildung4), was darauf hindeutet, dass Glukose hauptsächlich über die PPP katabolisiert wurde.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig1.jpg"> Bild 1. Unveränderte Zellzahlen bei der Diamidbehandlung. Die Reaktion des Zellwachstums auf 250 μm Diamid wurde mit Hilfe der Trypan-Blau-Färbung gemessen. Es werden die Zellzahlen der (A) HCC827 und (B) PC-9-Zellen angezeigt, die mit PBS (blau) oder Diamid (rot; 250 μm) für 1 oder 3 h behandelt werden. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 6) angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig2.jpg"> Bild 2. Repräsentative MS-Spitzen von Metaboliten. Elektropherogramme, die als (A) Gluconsäure bezeichnet werden, (B) Glukose 6-Phosphat (G6P), (C) 6-Phosphogluconat (6PG), und (D) Nikotinamid Adenin Dinucleotid-Phosphat (NADP+), die durch CE-MS-Analyse gewonnen werden. Jede Zeile zeigt die verwendete Zelllinie (fest, HCC827; gepunktet, PC-9) und die Behandlung (blau, PBS; rot, diamid) an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig3.jpg"> Bild 3. Metabolome Profile von intrazellulären Metaboliten. Falte Veränderungen der Metaboliten in (A) HCC827 und (B) PC-9-Zellen, die mit Diamid behandelt werden, werden als Log 2 (diamide/PBS) angezeigt. Insgesamt wurden 175 und 150 Metaboliten in HCC827 bzw. PC-9-Zellen kommentiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig4.jpg"> Bild 4. Oberregulierung von PPP nach der Diamidbehandlung. Es werden intrazelluläre Konzentrationen (pmolm/10 6 Zellen) wichtiger Metaboliten gezeigt, die an der Glykolyse und dem Pentose-Phosphatweg (PPP) nach der Behandlung mit Diamid beteiligt sind. Metabolite wurden aus HCC827 und PC-9-Zellen extrahiert, die mit PBS (blau) oder Diamid (rot, 250 μm) für 30 min behandelt wurden. Repräsentative Metaboliten wie Gluconsäure, Glukose-6-Phosphat (G6P), Fructose 6-Phosphat (F6P), 6 Es werden Phosphoglukonat (6PG) und Nikotinamid Adenin Dinucleotid-Phosphat (NADP+) gezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Der Zweck dieses Artikels ist es, ein Protokoll für die Extraktion von wässrigen Metaboliten aus kultivierten, anhaftenden Zellen für die metabolomische Analyse zu beschreiben, insbesondere die kapillare Elektrophoresen-Massenspektrometrie.

Gewinnung von wässrigen Metaboliten aus kultivierten Adherenten Zellen für die metabolomische Analyse durch die kapitänische Spektrometrie Elektrophoresis-Mass

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Der Zweck dieses Artikels ist es, ein detailliertes, schrittweises visuelles Protokoll für die Extraktion wässriger Metaboliten aus kultivierten Krebszellen für die nachfolgende Metabolomanalyse bereitzustellen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Einfachheit und Zuverlässigkeit für die Extraktion von Metaboliten aus anhaftenden Zellen. Vor allem aber ist es für die Metabolom-Analyse mit Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie oder CEMS optimiert.Metabolomics ist eine leistungsstarke Technik, um Biomarker zu identifizieren oder Krebs im Frühstadium zu erkennen und die Chemotherapie-Reaktion von Krebspatienten vorherzusagen. Wir verwenden Krebszellen in dieser Demonstration. Diese Technik kann jedoch auch zur Ernte von Metaboliten aus anderen anhaftenden Zellen wie Fibroblasten in iPS-Zellen angewendet werden.Metabolitenkonzentrationen werden auf der Grundlage der Anzahl lebensfähiger Zellen normalisiert. So sorgfältige Vorbereitung der Kultur, ist dies der Schlüssel für die Erlangung guter reproduzierbarer Daten. Demonstriert wird das Verfahren von Ami Maruyama, einem Techniker aus meinem Labor.Zunächst werden HCC827- und PC-9-Zellen in 100-Millimeter-Schalen mit 10 Millilitern RPMI-1640-Medium mit 10% fetalem Rinderserum auftellert. Legen Sie die Gerichte in einem Inkubator bei 5% Kohlendioxid und 37 Grad Celsius für 24 Stunden zu Kultur. Nach der Inkubation die 100-Millimeter-Kulturgerichte sanft kippen, um die Zellkulturmedien zu saugen.Waschen Sie Zellen auf jeder Schale mit zwei Milliliterphosphat-gepufferten Saline-Lösung ohne Kalzium und Magnesium. Jede Schale vorsichtig schaukeln, so dass die PBS-Lösung die Oberfläche der Schale vollständig abdeckt, und kippen Sie dann die Teller, um den Waschpuffer zu aspirieren. Erwärmen Sie 0,25%Trypsin-EDTA Lösung auf 37 Grad Celsius.Mit einer 5-Milliliter-Serologischen Pipette zwei Milliliter der erwärmten Trypsin-EDTA-Lösung zu jeder Schale hinzufügen. Jede Schale vorsichtig schaukeln, so dass das Trypsin die Oberfläche der Schale vollständig bedeckt. Die Kulturgerichte bei 37 Grad Celsius für etwa fünf Minuten bebrüten.Dann fügen Sie vier Milliliter des vorgewärmten vollständigen Wachstumsmediums zu jedem Gericht hinzu. Und sanft Pipette mehrmals, um die Zellen in Medium wieder zu suspendieren. Übertragen Sie jede Zellsuspension in ein separates 15-Milliliter Konikonrohr.Zentrifuge bei 800 mal g für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie jedes Zellpellet in zwei Milliliter des vorgewärmten gesamtwütigen Wachstumsmediums wieder auf. Mischen Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension mit 10 Mikrolitern 0,4%Trypan-Blaulösung in einem 1,5-Milliliter-Mikrorohr.10 Mikroliter des Gemischs durch Kapillarwirkung in eine Zellzählkammer gleiten lassen. Legen Sie das Kammergleiten in den automatischen Zellenzähler ein, und drücken Sie die Aufnahmetaste, um das Bild zu erfassen und die Ergebnisse der Gesamtzahl und der prozentualen Lebensfähigkeit der Zellen anzuzeigen. Wenn die Gesamtzellzahl über 0,5 Millionen Zellen pro Milliliter liegt, fügen Sie dem 15-Milliliter-Konusrohr weiteres Wachstumsmedium hinzu, um die gewünschte Zellkonzentration zu erhalten.Fügen Sie nun zwei bis fünf Milliliter der Kultur zu jeder 100-Millimeter-Zellkulturschale hinzu, um etwa ein bis zwei 1/2 Millionen Zellen pro Schale auszusäen. Inkubieren Sie die Kulturgerichte in 5% Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius für 18 Stunden. Verdünnen Sie zunächst in einem 15-Milliliter-Volumenkolben eine kommerzielle interne Standardlösung, die L-Methionin-Sulfon und D-Camphor-10-Sulfonsäure 1.000-fach in Reinstwasser enthält.Mannitol in Reinstwasser auflösen, um eine 0,05 Gramm pro Milliliter Mannitollösung in Reinstwasser als Waschpuffer vorzubereiten. Dann in den Filterbecher jeder Zentrifugalfiltereinheit, Pipette 250 Mikroliter Reinstwasser. Die Filtereinheiten fest verschließen und bei 9, 100 mal g bei vier Grad Celsius fünf Minuten lang zentrifugieren.Überprüfen Sie die Lautstärke jedes Filtrats. Wenn sich während der ersten kurzen Drehung erhebliche Sfiltrate angesammelt haben, kann die Filtereinheit defekt sein. Verwerfen Sie die Filtereinheit, und verwenden Sie stattdessen eine neue Filtereinheit.Schließen Sie die Deckel der Filtereinheiten fest und zentrieren Sie wieder bei 9, 100 mal g bei vier Grad Celsius für 30 Minuten. Stellen Sie sicher, dass kein Reinstwasser in einem der Filterbecher verbleibt, und entfernen Sie das gefilterte Reinstwasser in jedem Sammelrohr mit einer Pipette. Legen Sie die Filterbecher wieder in ihre Sammelrohre und verwenden Sie die Zentrifugalfiltereinheiten innerhalb einer Stunde, um Schäden beim Trocknen zu vermeiden.Nehmen Sie die 100-Millimeter-Kulturgerichte aus dem Brutkasten und aspirieren Sie das Zellkulturmedium aus jedem Gericht. Fügen Sie 10 Milliliter PBS-Kulturmedium mit oder ohne 250 Mikromolar-Diamid zu jeder Schale hinzu, wobei darauf geachtet wird, die Zellschicht nicht zu stören. Inkubieren Sie die Kulturgerichte bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten.Nach der Inkubation das Zellkulturmedium aus jedem 100-Millimeter-Kulturgericht ansaugen. Kippen Sie die Schale leicht, und fügen Sie vorsichtig zwei Milliliter 5%Mannitol Waschpuffer an den Rand jeder Schale, um die Zellen zu waschen, wobei darauf zu achten, die Zellschicht nicht zu stören. Den Waschpuffer von jeder Kulturschale ansaugen und die Zellen wieder waschen, indem man die Schale leicht neigt und sanft 10 Milliliter Waschpuffer pro Schale hinzufügt.Dann, vollständig aspirieren Sie den Waschpuffer vom Rand jeder Kulturschale. Fügen Sie nun 800 Mikroliter 99,7% Methanol pro Kulturgericht hinzu und schaukeln Sie jedes Kulturgericht sanft hin und her, um seine gesamte Oberfläche zu bedecken. Lassen Sie das Geschirr bei Raumtemperatur für 30 Sekunden.Fügen Sie langsam 550 Mikroliter der verdünnten internen Standardlösung pro Schale hinzu, indem Sie die Spitze der Pipette in das Methanol eintauchen und mehrmals sanft nach oben und unten pfeifen. Schaukeln Sie jedes Kulturgericht sanft hin und her, um seine gesamte Oberfläche zu bedecken, und lassen Sie das Geschirr bei Raumtemperatur für 30 Sekunden. Dann übertragen Sie die extrahierte Lösung aus jeder Kulturschale in ein separates 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr.Zentrifugieren Sie die Rohre bei 2, 300 mal g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Übertragen Sie 700 Mikroliter jedes Überstandes in zwei Zentrifugalfiltereinheiten mit 350 Mikroliterpro Einheit. Zentrifugieren Sie die Filterrohre bei 9, 100 mal g bei vier Grad Celsius für etwa zwei Stunden, bis keine Flüssigkeit in den Filterbechern verbleibt.Entfernen Sie die Filterbecher, und schließen Sie die Deckel der Sammelrohre fest. In dieser Studie wuchsen HCC827 und PC-9 Zellen drei Stunden lang gleichmäßig. Die CEMS-Analyse zeigt die Differenz zwischen diamidbehandelten Zellen und PBS-behandelten Zellen für beide Zelllinien an.Darunter waren mehrere Zwischenprodukte im Pentosephosphatweg und in der oberen Glykolyse bei den mit Diamid behandelten Bedingungen signifikant höher, während einige tricarbonylische Zykluszwischenprodukte in den behandelten Bedingungen niedriger waren. Metabolomprofile intrazellulärer Metaboliten zeigten 175 bzw. 150 Differentialmetaboliten in HCC827- bzw. PC-9-Zellen. Nach der Diamidbehandlung erhöhte sich der Gehalt an Gluconsäure und oxidierter Glukose in HCC827-Zellen um das 12-fache und in PC-9-Zellen um das 10-fache.In ähnlicher Weise erhöhte sich der Gehalt an Glucose 6-Phosphat, einer phosphorylierten Glukose im ersten Hexokinase-katalysierten Glykolyseprodukt, ebenfalls in HCC827- bzw. PC-9-Zellen um das 6,3- bzw. 3,5-fache. Darüber hinaus stiegen die Konzentrationen von 6-Phosphogluconate, dem ersten Zwischenprodukt im Pentosephosphatweg, in HCC827-Zellen und dem 231-fachen in PC-9-Zellen dramatisch um das 89-fache. Im Gegensatz dazu änderten sich die Konzentrationen anderer glykolytischer Zwischenprodukte wie Fructose 6-Phosphat im diamidexperimentellen Zustand nicht.Die gesamten Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat-Werte waren nahezu gleichwertig zwischen der Diamidbehandlung und den PBS-Kontrollbedingungen. Die Verwendung von 5%mannitol Lösung, außer PBS, als Waschpuffer für Waschzellen ist sehr wichtig für die CEMS-Analyse, da salzbasierte Puffer die Analyse stören und die Messung beeinträchtigen. Dieses Protokoll ist ungeeignet für die Extraktion hydrophober Metaboliten wie Lipide, daher müssen wir ein Protokoll entwickeln, um sowohl hydrophile als auch hydrophobe Metaboliten bequem für eine umfassendere Metabolomanalyse zu extrahieren.Diese Technik realisiert eine einfache Extraktion von Metaboliten aus fast allen anhaftenden Zellen und ist daher für eine Vielzahl von Forschungen wie Krebs, Stammzellen, Pharmakologie, Ernährung und Kosmetische Wissenschaft anwendbar.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

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Gewinnung von wässrigen Metaboliten aus kultivierten Adherenten Zellen für die metabolomische Analyse durch die kapitänische Spektrometrie Elektrophoresis-Mass (Video) | JoVE Journal

Gewinnung von wässrigen Metaboliten aus kultivierten Adherenten Zellen für die metabolomische Analyse durch die kapitänische Spektrometrie Elektrophoresis-Mass

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