Name: Technischer Aspekt der automatisierten Synthese und Echtzeit-Kinetik-Evaluierung von 11C SNAP-7941 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Erfahren Sie die automatisierte Synthese von [11C]SNAP-7941 für die Echtzeit-Kinetik-Evaluierung mittels PET-Bildgebung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Rezeptorexpressionsniveaus in vitro.

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Diese Arbeit wurde vom Wissenschaftsfonds (FWF P26502-B24, M. Mitterhauser) unterstützt. Wir sind dankbar für die technische Unterstützung von T. Zenz und A. Krcal. Darüber hinaus danken wir K. Pallitsch für die Vorbereitung der AgOTf und H. Spreitzer für die Verteilung des Vorläufers.

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Wir haben nichts zu verraten.

Die Radiosynthese von [11C]SNAP-7941 wurde auf einem kommerziellen Synthesemodul etabliert. Durch die Möglichkeit, das Aufbereitungsverfahren vollständig zu automatisieren, wurde die Als zuverlässig erwiesene Radiosynthese nachgewiesen und Verbesserungen beim Strahlenschutz des Bedieners erzielt. Die Herstellung des Synthesizers hat einen enormen Einfluss auf die Qualität des Radiotracers, insbesondere in Bezug auf die Molaktivität. Daher ist es wichtig, ständig unter inerten Bedingungen (z. B. Heliumatmosphäre) zu arbeiten und alle Leitungen vor dem Reaktionsgefäß zu spülen (Ziellinie, [11C]CH3I Produktionszyklus und Reaktor (siehe Abbildung 2)). Darüber hinaus erhöht das Erhitzen der jeweiligen Fallen und Öfen vor Beginn der Synthese, um Feuchtigkeit und atmosphärischen Kohlenstoff zu entfernen, die Molaktivität vorteilhaft. Insbesondere die agOTf-Säule, mit graphitisiertem Kohlenstoff imprägniert, ist extrem feuchtigkeitsempfindlich. Schon geringe Mengen einer beliebigen Feuchtigkeitsquelle stören die Umwandlung von [11C]CH3I in [11C]CH3OTf. Vor Beginn der Synthese müssen die [11C]CO 2-Falle und die [11C]CH3I-Falle wieder auf Raumtemperatur abgekühlt werden, um ein nachfolgendes Fangen zu ermöglichen. Darüber hinaus wird empfohlen, den Vorläufer kurz vor Beginn der Synthese aufzulösen und die Basis direkt in die Vorläuferlösung einzutragen.
Die Qualitätskontrolle für Carbon-11-Radiotracer muss rationell auf einen kontinuierlichen und schnellen Arbeitsablauf ausgelegt sein. Die wichtigsten Parameter für Zellkulturstudien sind jedoch radiochemische Reinheit und molaren Aktivität, um gültige Ergebnisse zu erhalten. Eine korrekte Bewertung der Molaktivität erfordert eine robuste analytische HPLC-Methode und die Kalibrierkurve muss den Konzentrationsbereich des Endprodukts abdecken. Der schwierige Teil für Radiotracer besteht darin, eine Konzentration oberhalb der Quantifizierungsgrenze (LOQ) aufgrund kleiner Mengen zu erreichen, die während der Radiosynthese erzeugt werden. Daher besteht die Kunst darin, das Gleichgewicht zwischen hohen molaren Aktivitäten zu finden, um Rezeptorsättigung und hohe Konzentrationen zu vermeiden, um das nicht-radioaktive Signal noch quantifizieren zu können.
[11C] SNAP-7941 wurde als potentes Substrat des menschlichen P-gp-Transporters bestätigt, da in den unbehandelten oder fahrzeugbehandelten MDCKII-hMDR1-Zellen aufgrund des schnellen Ausflusses keine Ansammlung beobachtet wurde. Im Gegensatz dazu lieferten beide Versuchs-Setups (MDCKII-WT- oder vorblockierte MDCKII-hMDR1-Zellen) ähnliche Ergebnisse (Akkumulation von [11C]SNAP-7941), was die Vielseitigkeit dieses In-vitro-Assays unterstützt. MDCKII-hMDR1-Zellen eignen sich aufgrund ihrer stabilen Transfektion, ihres schnellen Wachstums und der anhaltenden Scherbelastung durch die rotierende Zellkulturschale hervorragend für LigandTracer-Experimente. Das Fehlen von [11C]SNAP-7941 Aufnahme im Ratten- und Mäusehirn kann daher durch Efflux durch den P-gp Transporter verursacht werden. Aufgrund der Transfektion von Canine-Nierenzellen mit dem humanen Multi-Wirkstoffresistenz-Protein 1 (hMDR-1, P-gp) ist der Vorhersagewert dieser Methode für die Efflux-Transporterbindung beim Menschen hoch, was im Hinblick auf eine zukünftige klinische Anwendung günstig ist. Bisher wurde die Selektivität gegenüber anderen Efflux-Transportern jedoch nicht überprüft. Daher können andere Zelllinien verwendet werden, die verschiedene prominente Efflux-Transporter wie das Brustkrebsresistenzprotein (BCRP) oder das Multiple Resistenzprotein -1 (MRP-1) exprossen, um Wechselwirkungen zu diesen Transportern zu untersuchen. Die Methode ist im Vergleich zu klassischen Akkumulations- oder Transporttests sehr einfach und liefert sofort qualitative Ergebnisse. Darüber hinaus ist der größte Vorteil, dass diese Technologie die Bewertung der direkten Interaktion zwischen PET-Tracer und Ziel in Echtzeit ermöglicht, im Gegensatz zum konventionellen Experiment mittels indirekter Quantifizierung (meist Verschiebung). Darüber hinaus bietet die Echtzeit-Radioassay-Software experimentelle Flexibilität (z.B. Nuklidenzerfallskorrektur, Messzeit und Positionen, etc.) und damit hohe Freiheit für den Anwender. Auf der anderen Seite umfasst die Einschränkung der Methode einen niedrigen Probendurchsatz, da jeweils nur eine Zellschale gemessen werden kann. Darüber hinaus sollten einige andere technische und betriebliche Fragen berücksichtigt werden: Die beschriebene Technologie ist sehr empfindlich gegenüber Hintergrundstrahlung; Daher sollten Strahlungsquellen auf Distanz gehalten und der Schwerpunkt auf die Hintergrundmessung vor dem Experiment gelegt werden. Ein weiteres Problem bei Experimenten bei höheren Temperaturen als Raumtemperatur ist die Erwärmung der geneigten Stütze: Verdunstung des Zellkulturmediums könnte den Detektor beeinflussen. Anstelle des Erhitzens wird das gesamte Gerät vorzugsweise in den Inkubator gestellt. Darüber hinaus ist die Methode auf anhaftende Zelllinien beschränkt. Durch die Rotation der Zellkulturschale können sich spannungsempfindliche Zellen von der Schale lösen, was zu ungültigen Ergebnissen führen kann.
Dennoch liefert die Methode schnelle und zuverlässige Ergebnisse für die Analyse des kinetischen Verhaltens präklinischer PET-Tracer, wenn der Experimentator auf diese kleinen Nachteile achtet.

[11C] SNAP-7941 wurde als erster Positronen-Emissionstomographie (PET)-Tracer entwickelt, der auf den Melanin-konzentrierenden Hormonrezeptor 1 (MCHR1) abzielt - ein Rezeptor, der hauptsächlich an der zentralen Regulierung von Appetit und Nahrungsaufnahme beteiligt ist1. Die Carbon-11-Kennzeichnung von SNAP-7941, einem gut charakterisierten MCHR1-Antagonisten, ergab den authentischen PET-Tracer2,3,4,5. Die vollautomatische Radiosynthese ist jedoch eine große Herausforderung in Bezug auf die Zeitliche Wirksamkeit und Reproduzierbarkeit mit dem kurzlebigen Radionuklid Carbon-11, das eine Halbwertszeit von 20 min6bietet. Die Gesamtsynthesezeit sollte auf ein Minimum beschränkt werden, und als Faustregel sollte 2-3 Halbwertszeiten (d.h. etwa 40-60 min für Kohlenstoff-11)7nicht überschreiten. Insbesondere müssen Syntheseverfahren für Radiotracer, die auf Rezeptorsysteme mit geringer Expressionsdichte abzielen, umfassend optimiert werden, um ausreichende Erträge und damit eine hohe Molaktivität zu erhalten8. Die synthetische Strategie folgt oft der Radionuklidproduktion innerhalb eines Zyklotrons und der Freisetzung von [11C]CO2 an den Synthesizer. Dort wird [11C]CO2 zunächst auf [11C]CH4 reduziert und anschließend mit Jod auf die Ausbeute reagiert [ 11C]CH3I über die Gasphasenmethode9,10. Weitere Behandlung mit Silbertriflate ergibt [11C]CH3OTf direkt online. Anschließend wird dieses reaktive Kohlenstoff-11-markierte Zwischenprodukt in eine Lösung eingeführt, die das Vorläufermolekül enthält. Eine automatisierte Radiosynthese beinhaltet zusätzlich einen Reinigungsprozess mit semipräparativem RP-HPLC inklusive nachträglicher Formulierung des Produktes, das für präklinische und klinische Studien geeignet ist.
Unabhängig von der Halbwertszeit des Radionuklids und dem Zeitaufwand der Radiosynthese ist die Pharmakokinetik eines Radiopharmazeutikums der kritischste Teil, der während der PET-Tracer-Entwicklung bewertet werden muss. In Bezug auf Neuroimaging ist der Hirneintrag des PET-Tracers die wichtigste Voraussetzung. Die Blut-Hirn-Schranke (BBB), eine "Sicherheitsgrenze" des Gehirns, drückt jedoch Efflux-Transporter hoch aus, die kleine Moleküle (z. B. PET-Tracer) entladen und deren Anwendbarkeit effizient behindern können.
Ein großer Nachteil bei der präklinischen Auswertung sind unerwartete Wechselwirkungen zu diesen Efflux-Transportern, die in In-vitro-Experimenten oft nicht erkannt werden und zum Versagen des PET-Tracers in vivo führen, wie bei [11C]SNAP-7941 beobachtet. Die PET-Bildgebung bei Ratten zeigte eine geringe Hirnansammlung, die nach Verabreichung des P-gp-Inhibitors Tariquidar11dramatisch zunahm. Diese Daten legten nahe, dass [11C]SNAP-7941 ein Substrat dieses Efflux-Transportersystems ist, das Dieligandbindung an zentrale MCHR1 behindert. Leider fehlt es immer noch an geeigneten In-vitro-Modellen, die die Vorhersage der BBB-Penetration in einem frühen Stadium der Tracer-Entwicklung ermöglichen.
Hier beschreiben wir die automatisierte Synthese von [11C]SNAP-7941 mit einem Synthesizer für Kohlenstoff-11-Methylierungen. Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt darin, einen Überblick darüber zu geben, wie ein konsekutierter experimenteller Ansatz organisiert werden kann, einschließlich der automatisierten Synthese, Qualitätskontrolle sowie der aufeinanderfolgenden In-vitro-Evaluierung mit dem sehr kurzlebigen Nuklid kohlenstoff-11.
Zunächst werden die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Radiosynthese mit minimalem Zeitaufwand und maximalem Ertrag beschrieben. Dann wird ein zuverlässiges Qualitätskontrollverfahren eingerichtet, das den Radiotracer für potenzielle klinische Studien zur Verfügung stellt und die Kriterien des Europäischen Arzneibuchs12erfüllt. Die Quantifizierung der Molkonzentration und die Berechnung der jeweiligen Molaktivität ist eine wesentliche Voraussetzung für die aufeinanderfolgenden kinetischen Messungen.
Schließlich wird eine neue und einfache In-vitro-Methode zur Bewertung der Wechselwirkungen von [11C]SNAP-7941 zum Efflux-Transporter P-gp (hMDR1) vorgestellt. Das vorgeschlagene kinetische Modell verwendet ein einfach zu handhabendes Gerät, das eine sofortige Dateninterpretation ermöglicht und minimalen Zellkulturaufwand erfordert13.

<table><tbody><tr><td>Tabelle 1: Liste der Materialien und Instrumente für die vollautomatische Radiosynthese von [11C]SNAP-7941</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni-Katalysator</td><td>Shimadzu, Kyoto, Japan</td><td></td><td>Shimalilte Ni reduziert, 80/100 mesh</td></tr><tr><td>Jod</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td></td><td>1.04761.0100</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td></td><td>für die DNA-Synthese, < 10 ppm H2</td></tr><tr><td>O Acetonitril</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td></td><td>HPLC-Qualität</td></tr><tr><td>Ammoniumacetat</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td> Essigsäure Merck, Darmstadt, Deutschland <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Gletscher-Ethanol</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td></td><td>96%</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>B. Braun, Melsungen, Deutschland</td><td></td><td>0,9% </td></tr><tr><td>Tetrabutylammoniumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td></td><td>SPE-Kartusche in HPLC-Qualität</td></tr><tr><td></td><td>Waters, Milford, MA, USA</td><td></td><td>SepPak C18plus</td></tr><tr><td>Semi-präparative RP-HPLC-Säule</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td></td><td>Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm</td></tr><tr><td>Vorsäule</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td></td><td>Chromolith Guard RP-18e, 5-4,6 mm</td></tr><tr><td>Vorläufer</td><td>Universität Wien, Österreich</td><td></td><td>SNAP-Säure</td></tr><tr><td>Referenzverbindung</td><td>Universität Wien, Österreich</td><td></td><td>SNAP-7941</td></tr><tr><td>Silbertrifluormethansulfonat</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graphpa GC</td><td>Alltech, Deerfield, IL, USA</td><td></td><td>80/100 mesh</td></tr><tr><td>PET trace 860 Zyklotron</td><td>GE Healthcare, Uppsala, Schweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>[11C]CO2 Hochdrucktarget</td><td>Air Liquide, Wien, Österreich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRACERlabFX2 C</td><td>GE Healthcare, Uppsala, Schweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 + 1% O2</td><td>Air Liquide, Wien, Österreich</td><td></td><td>Target gas</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Tabelle 2: Liste der Materialien und Instrumente für die Qualitätskontrolle von [11C]SNAP-7941.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Merck Hitachi LaChrom, L-7100</td><td>Hitachi Vantara Austria GmbH (Wien, Österreich)</td><td></td><td>HPLC-Pumpe</td></tr><tr><td>Merck Hitachi, L7400</td><td>Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokio, Japan)</td><td></td><td>UV-Detektor</td></tr><tr><td>NaI-Radiodetektor</td><td>Raytest (Straubenhardt, Deutschland)</td><td></td><td>NaI-Radiodetektor</td></tr><tr><td>Chromolith Performance RP-18e, 100-4,6 mm</td><td>Merck (Darmstadt, Deutschland)</td><td></td><td>HPLC-Säule</td></tr><tr><td>430-GC</td><td>Bruker (Bremen, Deutschland)</td><td></td><td>Gaschromatograph</td></tr><tr><td>Kapillarsäule ID-BP20; 12 mx0,22 mmx0,25 mm</td><td>SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australien)</td><td></td><td>Gaskapillare</td></tr><tr><td>Wesco, Osmometer Vapro 5600</td><td>Sanoya Medical Systems (Wien, Österreich)</td><td></td><td>Osmometer</td></tr><tr><td>g-Spektrometer</td><td></td><td></td><td>g-Spektrometer</td></tr><tr><td>Software zur Steuerung der Gaschromatographie</td><td>VARIAN (Palo Alto, Kalifornien, U.S.A)</td><td></td><td>Galaxie Version 1.9.302.952</td></tr><tr><td>Gammaspektrometer-Steuerungssoftware</td><td>ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.)</td><td></td><td>Maestro für Windows Version 6.06</td></tr><tr><td>Gamma-Spektrum-Abrufsoftware</td><td>ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.)</td><td></td><td>Winplots Version 3.21</td></tr><tr><td>HPLC-Steuerungssoftware</td><td>Raytest (Straubenhardt, Deutschland)</td><td></td><td>Gina Star Version 5.9</td></tr><tr><td>inolab 740</td><td>WTW (Weilheim, Deutschland)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-MeterName<</td><td>strong>Firma<</td><td>>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Tabelle 3: Liste von Materialien und Instrumenten zur Bewertung des kinetischen Echtzeitverhaltens von [11C]SNAP-7941.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1)</td><td>Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Niederlande)</td><td></td><td>Exprimation des humanen P-Glykoproteins (hMDR1)</td></tr><tr><td>Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-WT)</td><td>Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Niederlande)</td><td></td><td>Wildtyp (WT)</td></tr><tr><td>DMEM GlutaMAX</td><td>VWR International GmbH, Wien, Österreich</td><td></td><td>Gibco 61965-026</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FCS)</td><td>VWR International GmbH, Wien, Österreich</td><td></td><td>Gibco 10270-106</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>VWR International GmbH, Wien, Österreich</td><td></td><td>Gibco 15140</td></tr><tr><td>Zellkulturschale</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland</td><td></td><td>Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160</td></tr><tr><td>In vitro Experimente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM GlutaMAX</td><td>VWR International GmbH, Wien, Österreich</td><td></td><td>Gibco 61965-026</td></tr><tr><td>(&plusmn;)-Verapamilhydrochlorid</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)</td><td></td><td>276855-100 mL</td></tr><tr><td>Zellkulturschale</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland</td><td></td><td>Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160</td></tr><tr><td>Sterile Einwegpipetten aus Kunststoff</td><td>VWR International GmbH, Wien, Österreich</td><td></td><td>Sterilin, 5 mL &ndash; 25 mL</td></tr><tr><td>Sterile Pipettenspitzen</td><td>VWR International GmbH, Wien, Österreich</td><td></td><td>Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 & Mikro; L &ndash; 200 & Mikro; L</td></tr><tr><td>Zellkulturflaschen</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland</td><td></td><td>Cellstar 250 mL, 75 cm2 red Filter-Schraubverschluss, Hersteller-Nr.658175</td></tr><tr><td>LigandTracer-Steuerung Version 2.2.2</td><td>Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Schweden.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LigandTracer Yellow</td><td>Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Schweden.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LigandTracer White</td><td>Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Schweden.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6.0</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tragbarer automatisierter Zellzähler</td><td>Millipore Corporation Billerica MA01821</td><td></td><td>Zepter (Cat.No. PHC00000)</td></tr><tr><td>Zellzähler-Sensoren</td><td>Millipore Corporation Billerica MA01821</td><td></td><td>Zeptersensor 60 & Mikro; m (Cat.No. PHCC60050)</td></tr></tbody></table>

technischer aspekt der automatisierten synthese und echtzeit-kinetik-evaluierung von [11c]snap-7941

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Die Positronenemissionstomographie (PET) ist eine wesentliche molekulare Bildgebungstechnik, die Einblicke in Wege und die Verwendung gezielter Radioligande für In-vivo-Untersuchungen bietet. Innerhalb dieses Protokolls wird eine robuste und zuverlässige ferngesteuerte Radiosynthese von [11C]SNAP-7941, einem Antagonisten des Melanin-konzentrierenden Hormonrezeptors 1, beschrieben. Die Radiosynthese beginnt mit cyclotron produziertem[11C]CO2, das anschließend durch einen Gasphasenübergang zu [11C]CH3OTf weiter umgesetzt wird. Dann wird dieses reaktive Zwischenprodukt in die Vorläuferlösung eingeführt und bildet den jeweiligen Radiotracer. Die chemische sowie die radiochemische Reinheit werden mittels RP-HPLC bestimmt, die routinemäßig im radiopharmazeutischen Qualitätskontrollprozess eingesetzt werden. Zusätzlich wird die Molaktivität berechnet, da sie eine Notwendigkeit für die folgenden kinetinen Echtzeituntersuchungen ist. Darüber hinaus wird [11C]SNAP-7941 auf MDCKII-WT- und MDCKII-hMDR1-Zellen angewendet, um die Auswirkungen der P-Glykoprotein-Expression (P-gp) auf die Zellakkumulation zu bewerten. Aus diesem Grund wird die P-gp-extierende Zelllinie (MDCKII-hMDR1) entweder ohne oder mit Blockierung vor Experimenten mittels des P-gp-Substrats ()-verapamil verwendet und die Ergebnisse werden mit denen verglichen, die für die Wildtypzellen beobachtet wurden. Der gesamte experimentelle Ansatz zeigt, wie wichtig ein präzises Zeitmanagement ist, das für jede präklinische und klinische Studie mit PET-Tracern, die mit kurzlebigen Nukliden wie Kohlenstoff-11 (Halbwertszeit: 20 min) radioaktiv gekennzeichnet sind, unerlässlich ist.

Die vollautomatische Radiosynthese von [11C]SNAP-7941 ergab 5,7 x 2,5 GBq (4,6 x 2,0 % bei EOB, 14,9 x 5,9 % basierend auf [11C]CH3OTf; n = 10) des formulierten Produkts. Die Gesamtsynthese dauerte ca. 40 min, wobei 15 min für die Vorbereitung von [11C]CH3OTf über die Gasphasenmethode erforderlich waren, weitere 5 min waren für die Radiomarkierung des Vorläufers erforderlich, gefolgt von 10 min semipräparativer RP-HPLC-Reinigung und 10 min für die C18-Patrone Festphasenextraktion und -formulierung. Anschließend wurde dem für die Qualitätskontrolle verantwortlichen Personen ein kleiner Aliquot (ca. 100-200 l) geliefert, während die Originalproduktdurchstechflasche mit dem gebrauchsfertigen Tracer an den Experimentator der kinetischen Echtzeitanalyse übergeben wurde.
Die Qualitätskontrolle wurde innerhalb von 10 min nach dem Ende der Synthese abgeschlossen. Die molare Aktivität lag in einem Bereich von 72 x 41 GBq/Mol (n = 10) und die radiochemische Reinheit betrug immer &gt; 95%. Alle anderen Parameter (pH, Osmolalität, Restlösungsmittel) erfüllten die Freisetzungskriterien. Für den kinetischer Echtzeit-Assay wurden drei verschiedene Versuchsaufbauten ausgewählt: (A) behandelte und unbehandelte (Fahrzeug)-MDCKII-WT-Zellen, (B) nicht behandelt oder mit MDCKII-hMDR1-Zellen behandelte Fahrzeugzellen und (C) die letztere Zelllinie mit Blockierung vor der Echtzeit kinetische Assay des Transporters mit ()-verapamil. Die Anwendung von [11C]SNAP-7941 auf die Wildtyp-Zelllinie MDCKII-WT (P-gp nicht-exsokierend) und MDCKII-hMDR1 (P-gp-Exzess) zeigt ein anderes kinetisches Verhalten, da es eine schnelle Akkumulation der Wildtyp-Zelllinie gibt, während keine Akkumulation beobachtet wurde, während keine Akkumulation beobachtet wurde. für die MDCKII-hMDR1-Zellen. Die Blockierung des P-gp-Efflux-Transporters in MDCKII-hMDR1-Zellen mit ()-verapamil führte jedoch zu einer vergleichbaren Echtzeit-Kinetik, wie sie bereits für die Wildtyp-Zelllinie gesehen wurde (Abbildung 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig1.jpg"> Abbildung 1: Übersicht über den Arbeitsablauf. Arbeitsablauf der Radiosynthese, Qualitätskontrolle und Leistung der kinetinen Echtzeitmessung von [11C]SNAP-7941. Die schwarzen Pfeile zeigen den Transportweg der Radioaktivität an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig2.jpg"> Abbildung 2: Radiosynthetisches Schema des automatisierten Synthesizers. Schaltkreis des automatisierten Synthesizers, beginnend mit der Zirkulationseinheit für [11C]CH3I/[11C]CH3OTf Produktion, Reaktor zur Einführung der Aktivität in die Vorläuferlösung und SPE-Reinigung (SPE = festes Phasenextraktion; PCV = Produktsammlungsdurchstechflasche). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig3.jpg"> Abbildung 3: Repräsentative Chromatogramme der vollautomatischen Radiosynthese von [11C]SNAP-7841. Das halbpräparative RP-HPLC-Chromatogramm ist oben und das analytische nach der Reinigung am Boden dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig4.jpg"> Abbildung 4: Vorbereitung von Zellkulturschalen für Echtzeitexperimente. Schritt 1 beinhaltet die Aussaat von 2,5 x 105 bis 1 x 106 je nach Zelltyp und Wachstumsrate. Anschließend wird das Kulturgericht in einer schrägen Ebene (ca. 30-45°) platziert. Daher kann das mitgelieferte Metallgerät oder der Deckel einer Zellkulturschale im Inkubator verwendet werden, um die Schräglage der Schale zu stabilisieren. Am Tag danach (24 h) wird das Gericht horizontal eingestellt, und frisches Zellkulturmedium wird hinzugefügt, um die Zelloberfläche vollständig zu bedecken. Am Tag des Experiments werden Zelllebensfähigkeit und Zusammenfluss untersucht. Nach dem Versuchsprotokoll werden die Zellen mit DPBS gewaschen, das Medium durch ein serumfreies Medium (2 ml) ersetzt und die Kulturschale bis zum Beginn der Experimente in eine schräge Position umpositioniert. Von nun an können die Zellen mit dem Inhibitor oder Fahrzeug behandelt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig5.jpg"> Abbildung 5: Kinetische Echtzeitmessungen von [11C]SNAP-7941. Repräsentative Echtzeitkinetik von [11C]SNAP-7941 wird in drei verschiedenen Setups dargestellt: Verwendung von MDCKII-WT-Zellen; MDCKII-hMDR1-Zellen vorblockiert mit ()-verapamil als P-gp-Hemmer und MDCKII-hMDR1-Zellen ohne Blockade. Die y-Achse veranschaulicht die Steigerungsrate der vorblockierten MDCKII-hMDR1- und WT-Zellen im Vergleich zu den Ergebnissen der unbehandelten bzw. fahrzeugbehandelten MDCKII-MDR1-Zellen (keine Aufnahme, 0%). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Hier stellen wir ein Protokoll zur vollautomatischen Radiobeschriftung von [11C]SNAP-7941 und zur Analyse der Echtzeitkinetik dieses PET-Tracers auf P-gp-extierende und nicht-extierende Zellen dar.

Technischer Aspekt der automatisierten Synthese und Echtzeit-Kinetik-Evaluierung von [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...

Die Radiokennzeichnung carbon-11 ermöglicht die Verwendung kleiner Verbindungen für die Positronenemissionstomographie oder PET, ohne das Molekül zu verändern. Dies ist wichtig für die Untersuchung der Rezeptor-Expressionsspiegel. Der Vorteil der Carbon-11-Radiolabeling ist, dass wir PET verwenden können, um die Bindungskinetik von SNAP direkt auf den Melanin-konzentrierenden Hormonrezeptor in Echtzeit zu bewerten.SNAP als Melanin-konzentrierender Hormonrezeptor-Antagonist wird zu einem besseren Verständnis dieses Rezeptors und seiner Assoziation mit stoffwechselmetabolischen Bedingungen wie Fettleibigkeit und Diabetes beitragen. Efflux-Transporter, die an der Blut-Hirn-Schranke ausgedrückt werden, können die Verwendung von Radiopharmaka für die Bildgebung zentraler Rezeptorexpression erheblich behindern. Daher ist es wichtig, Spuren in vitro zu bewerten.Die automatisierte Radiosynthese von SNAP ist weitgehend auf radioaktiv markierte niedermolekulare Verbindungen mit einer leicht zu bewertten Methylgruppe anwendbar. Einmal etabliert, kann dieses Verfahren für andere Verbindungen angepasst werden. Mit dabei sind die Senior-Doktoranden Sarah Pfaff und Theresa Balber.Um mit der Carbon-11 SNAP-Synthese zu beginnen, richten Sie ein sauberes automatisiertes Synthesemodul für Kohlenstoff-11 mit den entsprechenden Reagenzien und Materialien ein. Starten Sie den SNAP-Syntheseprozess auf dem Modulcomputer, der mit Systemprüfungen und Konditionierung beginnt. Etwa 30 bis 40 Minuten, bevor das Modul für die C-11-Lieferung bereit ist, wählen Sie das C-11-Kohlendioxidziel auf dem Zyklotron aus und starten Sie den Strahl bei 65 Mikroamperen.Sobald das Modul lieferbereit ist, schließen Sie das Innenfenster und die Außentür. Bestätigen Sie, dass die CO2-Falle auf mindestens 40 Grad Celsius abgekühlt ist und dass die Methanfalle mit der Kühlung begonnen hat. Sobald das Zyklotron etwa 120 Gigabecquerel C-11 CO2 produziert hat, klicken Sie in der Modulsoftware auf OK, um den Weg vom Ziel durch die CO2-Falle zu öffnen.Am Cyclotron-Computer beginnen C-11 CO2 an das Modul zu liefern. Überwachen Sie die Aktivitätsübertragung am Modulcomputer und stellen Sie sicher, dass sie nach drei Minuten zur Reduktion von CO2 auf Methan führt. Überwachen Sie den Prozess, da das entstehende Methan in die Methanfalle gespült und durch Zirkulation durch den Jodofen in Methyljodid umgewandelt wird.Warten Sie am Ende der Umwandlungssequenz, wie Nebenprodukte aus der Methyljodidfalle gespült werden, um auszupuffen, und bestätigen Sie dann, dass der Reaktor bereit ist, Aktivität zu empfangen, indem Sie auf OK klicken. Überwachen Sie das System, während das Methyljodid aus der Falle freigesetzt, durch den Methyltriflate-Ofen gespült und im Reaktor eingeschlossen wird. Wenn die Aktivität in den Reaktorplateaus bestätigt, dass das Fangen abgeschlossen ist. Warten Sie, während die Reaktionsmischung bei 75 Grad Celsius für drei Minuten reagiert.Überwachen Sie dann das System, wenn das Reaktionsgemisch auf unter 35 Grad Celsius abgekühlt und mit 1,5 Milliliter Wasser abgeschreckt wird. Überwachen Sie das System, wenn das Reaktionsgemisch in die HPLC-Injektionsschleife geladen und in die halbvorbereitende HPLC-Säule injiziert wird. Beobachten Sie die UV- und Gammadetektorspuren, während die Chromatographie voranschreitet.Wenn die Produktspitze manuell angezeigt wird, beginnen Sie mit dem Sammeln des Produkts im runden Bodensammelkolben im Modul. Manuelle End-Sammlung, wenn das Gamma-Signal unter etwa 400 Zählungen pro Sekunde fällt. Beobachten Sie den Flüssigkeitsstand im runden Bodenkolben, während das Produkt unter Heliumdruck auf eine Festphasen-Extraktionspatrone geladen wird.Sobald der Kolben leer ist und die Flüssigkeit durch die SPE-Patrone gelangt ist, klicken Sie auf OK, um mit dem Waschen der auf der Patrone gefangenen Produkte zu beginnen. Überwachen Sie dann die Aktivität in der Produktsammelflasche, da das Produkt zuerst von der Patrone in die Durchstechflasche eluiert und dann mit 0,9% Saline-Lösung verdünnt wird. Beobachten Sie, wie die Produktlösung durch sterilen Filter unter Heliumdruck auf die Produktdurchstechflasche übertragen wird.Wenn die Übertragung abgeschlossen ist, schließen Sie das Produktausgangsventil. Wenn der Radiotracer in der Produktdurchstechflasche ankommt, messen Sie den absoluten radioaktiven Ertrag. Dann verwenden Sie eine bleiabgeschirmte Spritze, um 100 Mikroliter des Tracers auf eine kleine Durchstechflasche zur Qualitätskontrolle zu übertragen.Bringen Sie die Qualitätskontrollprobe in einen abgeschirmten Arbeitsbereich der Qualitätskontrolle. 40 Mikroliter der QC-Probe in eine gasdichte Spritze ziehen, in ein vorbereitetes HPLC-Instrument mit analytischer Säule laden und das Produkt injizieren. Führen Sie während des HPLC-Laufs weitere Qualitätskontrollmessungen durch.Sobald der HPLC-Lauf abgeschlossen ist, integrieren Sie alle Spitzen im Chromatogramm des Radioaktivitätsdetektors, um festzustellen, ob die radiochemische Reinheit von SNAP größer als 95% ist. Integrieren Sie die Spitzen im UV-Chromatogramm, um die chemische Reinheit des Produkts zu bestimmen. Verwenden Sie den Bereich unter der UV-Produktspitze, um die spezifische Aktivität zu berechnen. Sobald das Produkt bestätigt wurde, um die Anforderungen für die Verwendung zu erfüllen, lassen Sie den Radio Tracer an das kinetische Echtzeit-Experimentlabor frei.Mindestens 30 Minuten vor dem Experiment den vorbereiteten Wildtyp oder transfizierte Zellen mit DPBS waschen und zwei Milliliter serumfreies Wachstumsmedium hinzufügen. Um transfizierte Zellen zu blockieren, fügen Sie 0,98 Mikroliter einer 20,4 Millimolaren Lösung des racemischen Verapamilhydrochlorids in Dimethylsulfoxid hinzu. Inkubieren Sie die Zellen auf einer schrägen Ebene für 30 Minuten.Schalten Sie dann das Echtzeit-Assay-Instrument und den zugehörigen Computer ein. Öffnen Sie die Steuerungssoftware und wählen Sie ein Ziel aus. Legen Sie die Anzahl der Positionen auf zwei, die Erkennungszeit auf drei Sekunden, die Erkennungsverzögerungszeit auf zwei Sekunden und den Namen der ersten Phase auf die Basislinie fest.Setzen Sie die Zellkulturschale in die geneigte Unterstützung des Geräts mit dem Zellpol auf der Unterseite ein. Stellen Sie sicher, dass der Zellpol mit dem Zellkulturmedium bedeckt ist. Starten Sie eine 10-minütige Hintergrundmessung, und legen Sie den Dateinamen und den Pfad fest.Stellen Sie die Zeitskala auf Minuten und die Nuklidsammlung auf Carbon-11 ein. Konfigurieren Sie das Diagramm so, dass die subtrahierten Zieldaten für Hintergrund, Ziel und Hintergrund angezeigt werden. Sobald der Radio-Tracer geliefert und für den Einsatz zugelassen wurde, nehmen Sie eine kleine Probe für den Test.Berechnen Sie das benötigte Volumen der Radio-Tracer-Lösung und bereiten Sie eine Pipette vor. In der Instrumentensoftware halten Sie den Lauf an und warten Sie, bis die Tellerrotation beendet ist. Öffnen Sie den Deckel des Geräts, drehen Sie die Stütze um 90 Grad nach links, fügen Sie den Radiotracer mit der vorbereiteten Pipette hinzu und bringen Sie das Gerät in seine Ausgangsposition zurück.Schließen Sie den Deckel des Geräts und setzen Sie das Experiment sofort fort. Lassen Sie das Experiment 20 Minuten lang laufen, bevor Sie es beenden. Verarbeiten und analysieren Sie die Daten, um die SNAP-Aufnahme in den Zellen auszuwerten.Nun kann das Verfahren für die DMSO-behandelte Kontrollzellkulturschale und die Wildtyp-Zelllinie wiederholt werden. Echtzeit-kinetische Assays wurden mit Nicht-PGP-Exzessen wildtypisierter Zellen, PGP-exemitten Zellen, vorblockiert mit Verapamil als PGP-Hemmer und entsperrten PGP-Zellen durchgeführt. Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen nicht behandelten Zellen und fahrzeugbehandelten Zellen beobachtet.Carbon-11 SNAP akkumulierte sich schnell in Wildzellen, während keine Akkumulation in PGP-exemitten Zellen beobachtet wurde. Die Vorblockierung des PGP-Efflux-Transporters mit Verapamil führte zu einer SNAP-Akkumulation in den PGP-Zellen, die mit der von Wildzellen vergleichbar war. In Kombination mit kinetinen Echtzeitmessungen ermöglicht dieser Aufbau ein breites Verständnis der Pharmakokinetik von niedermolekularen Verbindungen und ist daher für die präklinische Entwicklung von Radiopharmazeutika von großer Bedeutung.Timing und Organisation sind die Hauptbestandteile für eine erfolgreiche Kohlenstoff-11-Radiosynthese mit nachfolgenden kinetinen Echtzeitexperimenten, da die Halbwertszeit von Carbon-11 nur 20 Minuten beträgt. Aufgrund einer kurzen Halbwertszeit von Carbon-11 werden viele Teile dieses Verfahrens gleichzeitig durchgeführt. Es ist wichtig, dass alle Beteiligten den Umfang und den Zeitpunkt ihrer Rolle verstehen.Sowohl die Produktsicherheit als auch der Strahlenschutz sind für die Herstellung von Radiopharmazeutika von entscheidender Bedeutung. Alle Experimente müssen dem so niedrigen wie vernünftigerweise erreichbaren oder ALARA-Prinzip folgen, um die Strahlenexposition des Bedieners zu begrenzen.

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Forschung

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Chemistry

Chemie

Die Ugi-Reaktion hat sich als eine bequeme Möglichkeit, um schnell diverse Bibliotheken von Verbindungen sein. Es geht um die Reaktion eines Amins mit einem Aldehyd, einer Carbonsäure und ein Isonitril in der Regel in Methanol bei Raumtemperatur. In diesem Video, verwenden wir ein 48-Slot Mettler-Toledo MiniBlock mit Filtration Rohren und einem Mettler-Toledo MiniMapper automatisierten Liquid Handler verwendet wurde, um die Reagenzien und Lösungsmittel liefern ausgestattet. Die Parameter des...

Optimierung der Ugi-Reaktion mit Parallel Synthese und Automated Liquid Handling

Photostabile Cyaninfarbstoffe werden an Oligonukleotide gebunden, um die Hybridisierung durch Energietransfer zu überwachen.

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Wir zeigen die halbautomatisierte radiochemische Synthese von [ 18 F] 3F4AP und Qualitätskontrollverfahren.

Automatisierte radiochemische Synthese von [<sup&gt; 18</sup&gt; F] 3F4AP: Ein neuartiger PET-Tracer zur Bildgebung von demyelinisierenden Krankheiten

Ein Protokoll für die Synthese von 1,2-Dithiolane modifizierte Peptid und die Charakterisierung der supramolekularen Strukturen durch das Peptid Selbstmontage.

Synthese und Charakterisierung von 1,2-Dithiolane geändert selbstorganisierende Peptide

Positronen-Emissions-Tomographie (PET) imaging Websites, die mehrere frühen klinischen Studien beteiligt sind brauchen robuste und vielseitige Radiotracer Fertigungskapazitäten. Mit Hilfe der Radiotracer [18F] Clofarabin als Beispiel, wir zeigen, wie die Synthese von einem Radiotracer mit einer flexiblen, Kassetten-basierte Radiosynthesizer zu automatisieren und die Synthese für die klinische Anwendung zu validieren.

Automatisierung eines Positronen-Emissions-Tomographie (PET) Radiotracer Synthese Protokolls für klinische Herstellung

Wir berichten über eine effiziente Carbon-11-Radiolabeling-Technik zur Herstellung klinisch relevanter Tracer für die Positronen-Emissionstomographie (PET) mit Festphasen-Extraktionspatronen. 11 C-Methylierungsmittel wird durch eine Patrone mit Vorläufer vorinstalliert und aufeinanderfolgende Elution mit wässrim Ethanol liefert chemisch und radiochemisch reine PET-Tracer in hohen radiochemischen Erträgen.

Feste Phase 11C-Methylierung, Reinigung und Formulierung für die Herstellung von PET Tracern

Hier beschreiben wir einen Bioassay unter Verwendung von 3-(4′,5′-Dimethylthiazol-2′-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumbromid (MTT), um zuvor synthetisierte spirocyclische Oxime zu testen.

Funktionalisierte spirozyklische Heterocyclensynthese und Zytotoxizitätstest

Diese Methode beschreibt den Einsatz einer neuartigen Hochdurchsatzmethode, basierend auf tröpfchenchemischen Reaktionen, zur schnellen und wirtschaftlichen Optimierung von Radiopharmazeutika unter Verwendung von Nanomolmengen an Reagenzien.

Optimierung radiochemischer Reaktionen mit Droplet Arrays

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Optimierung und Parametrisierung von Aminosäureresten, die mit reaktiven Carbonylspezies modifiziert wurden und an Proteinsysteme angepasst werden können. Zu den Protokollschritten gehören das Strukturdesign und die Optimierung, die Ladungszuweisung, die Parameterkonstruktion und die Vorbereitung von Proteinsystemen.

Synthese von Aminosäuren, die mit reaktiven Carbonylen in Silico modifiziert wurden, um strukturelle Effekte mit Hilfe von Molekulardynamik-Simulationen zu bewerten 

Dieses Protokoll stellt ein detailliertes Verfahren zur Herstellung von vier Kohlenstoff-11-Radiotracern mittels der "Schleifenmethode" [11C]methylierung vor. Wir beschreiben das Verfahren zur Synthese von [11C]ER-176 mit Daten für drei weitere Radiotracer: [11C]MRB, [11C]mHED und [11C]PiB. Die Loop-Methode bietet eine effiziente Synthese mit erhöhter radiochemischer Ausbeute gegenüber der herkömmlichen Reaktionsgefäß-Methylierung [11C].

Verbesserung der Effizienz und der Radiomarkierungsausbeute von Kohlenstoff-11-Radioliganden für die klinische Forschung mit der Loop-Methode

Diese Arbeit beschreibt den automatisierten Prozess zur Herstellung von [68Ga]Ga-3BP-3940 mit dem GAIA V2-Synthesizer für die PET-Bildgebung von Fibroblasten-Aktivierungsproteinen. Die Ergebnisse von Qualitätskontrolltests, die an drei Testchargen durchgeführt wurden, werden ebenfalls vorgestellt.

Automatisierte Präparation von [68Ga]Ga-3BP-3940 auf einem Synthesemodul für die PET-Bildgebung der Tumormikroumgebung

Erfahren Sie die automatisierte Synthese von [11C]SNAP-7941 für die Echtzeit-Kinetik-Evaluierung mittels PET-Bildgebung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Rezeptorexpressionsniveaus in vitro.

Technischer Aspekt der automatisierten Synthese und Echtzeit-Kinetik-Evaluierung von [¹¹C]SNAP-7941

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