Kontrolliertes kortikales Wirkungsmodell der Maushirnverletzung mit therapeutischer Transplantation von humaninduzierten Pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuralzellen

Unser Protokoll zeigt einen umfassenden präklinischen Workflow zur Erprobung der therapeutischen Wirksamkeit von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen nach Einer Hirnverletzung. Dieses Modell der traumatischen Hirnverletzung bietet ein hohes Maß an Vielseitigkeit und Reproduzierbarkeit, indem es die Parameter der mechanischen Kraft genau kontrolliert und somit eine klar definierte Verletzung liefert. Diese Verfahren können verwendet werden, um Verletzungs- und Erholungsprozesse in anderen Hirnregionen zu untersuchen, und die Transplantationsmethode ist für viele Zelltypen geeignet.

Cranial-Bohren ist eine Herausforderung, da die Technik manuelle Geschicklichkeit erfordert, um den entsprechenden Druck, Geschwindigkeit, Tiefe und sanfte Bewegungen zu meistern. Dokumentieren Sie alle Veranstaltungen und Üben ausgiebig. Um eine einseitige Kraniektomie durchzuführen, bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen in der anästhesierten Maus und sichern Sie die Maus in einem stereotaxic Rahmen.

Mit einem sterilen Wattestäbchen und einer Jodlösung auf die Augen wird eine antibiotische ophthalmologische Salbe auf die Augen aufgebracht. Entfernen Sie das Jod mit 70% Ethanol und bedecken Sie das Tier mit einem fenestrated chirurgischen Drap. Machen Sie einen 1,5 bis zwei Zentimeter Mittellinie Schnitt auf der Kopfhaut und verwenden Sie sterile Wattestäbchen, um die Wunde zu reinigen und die Faszien links von der Mittellinie bei Bregma zu reinigen.

Verwenden Sie eine Schlagsonde, um die Kraniektomie-Site zu identifizieren und legen Sie den x gleich Null, y gleich Null stereotaxic Referenzpunkt bregma. Passen Sie die Sonde seitlich auf zwei Millimeter links von der Mittellinie an. Verwenden Sie einen feinspitzen chirurgisch sicheren Marker, um einen Kreis mit fünf Millimetern Durchmesser um den mutmaßlichen Aufprallbereich zu umkreisen.

Heben und drehen Sie den Stoßkraft aus der Position und vervollständigen Sie den Fünf-Millimeter-Kreis. Geben Sie den Stoßkraft kurz in Position zurück, um die Genauigkeit des Fünf-Millimeter-Kreises zu überprüfen. Heben und drehen Sie den Stoßsatz aus der Position und verwenden Sie ein Hochgeschwindigkeits-Dreh-Mikromotor-Kit-Handwerkzeug, das mit einem runden Spitzenbohrer 0,6 oder 0,8 Millimeter Gratbit ausgestattet ist, um ein offenes Loch im Schädel mit einer maximalen Geschwindigkeit von 70 bis 80 % zu machen.

Wenden Sie leichten Druck auf den Schädel an, während Sie entlang der fünf Millimeter umlaufenden Umrisse innerhalb dieser Grenze bohren, und verwenden Sie Zangen, um die resultierende Knochenklappe zu heben. Das Bohren durch Nahtlinien kann zusätzliche Schwierigkeiten mit sich bringen, da der Knochen unterbrochen wird und zusätzlichen Druck erfordert. Blutgefäße können in enger Verbindung sein und daher Blutungsereignisse sind wahrscheinlich.

Um eine leichte kontrollierte kortikale Schlagverletzung auszulösen, reinigen Sie die Stoßsonde mit einem sterilen Alkohol-Prep-Pad und bewegen Sie die Stoßsonde wieder in Position über den exponierten Kortex. Senken Sie die Sonde, bis sie die Dura mater-Oberfläche berührt, und markieren Sie diese Position als z gleich Null. Ziehen Sie den Kolben ab und bewegen Sie sich auf z entspricht minus einem Millimeter und entladen Sie den Kolben, um den Kortex zu beeinflussen.

Heben Sie den Kolben sofort an und bewegen Sie den Arm aus der Position und bewässern Sie den Kortex mit einem großzügigen Volumen an Saline und verwenden Sie einfache unterbrochene Stiche und 5-0 Seidennaht, um den Kopfhautschnitt zu schließen. Dann liefern Sie 10 Milligramm pro Kilogramm Cyclosporin A durch subkutane Injektion in die Scruff und legen Sie die Maus in einen sauberen vorgewärmten postoperativen Käfig mit Überwachung bis zur vollständigen Genesung. Etwa 24 Stunden nach der Kraniektomie, legen Sie die Maus wieder in den stereotaxic Rahmen.

Bedecken Sie die Maus mit dem fenestrated chirurgischen Drap. Spülen Sie die Einschnittstelle mit steriler Saline, um die Stelle zu reinigen und die Nähte zu lösen. Verwenden Sie einen 70% Ethanol getränkten Wattestäbchen, um die Schnittstelle sanft zu sterilisieren und verwenden Sie feine Pinzette und Augenscheren, um die Nähte zu entfernen.

Dann bewässern Sie die Operation und Kraniektomie-Site mit reichlich steriler Saline. In einer Zellkultur Biosicherheitshaube, sanft wirbeln oder tippen Sie auf die Zellröhre, um eine homogene Zellsuspension zu gewährleisten. Verwenden Sie eine Mikropipette, um etwa 7,5 Mikroliter Zellen durch das Kolbenende in eine Hamilton-Spritze zu laden.

Halten Sie die Spritze in einem 120-Grad-Winkel mit dem Kolbenende nach unten, legen Sie den Kolben unter Hinweis darauf, keine Luftblase zwischen Federung und Kolbenspitze einzuführen. Befestigen Sie die Dichtungseinheit an der Pipettennadel und befestigen Sie die Nadel an der Spritze. Drücken Sie den Kolben, um die Zellsuspension in die Pipettenadel zu bewegen, und befestigen Sie die Spritze an der stereotaxic Spritzenpumpe.

Bewegen Sie den Kolben, um sicherzustellen, dass die Spritzenpumpenbaugruppe ordnungsgemäß funktioniert, und bewegen Sie die Nadel in die Injektionskoordinaten. Richten Sie die Nadelspitze auf Bregma aus, und legen Sie die x- und y-Koordinaten auf Null fest. Bewegen Sie die Nadelspitze über die Kraniektomie auf zwei Millimeter seitlich und minus einen Millimeter hinter dem Ende auf Bregma und berühren Sie die Nadelspitze auf die Dura-Mater-Oberfläche.

Heben Sie die Nadel leicht an und machen Sie dann einen kleinen Schnitt in der Dura mater an der Stelle, an der die Nadel Kontakt aufgenommen hat. Stellen Sie die stereotaxic-Koordinate auf z gleich Null und drücken Sie den Kolben, um zu bestätigen, dass die Zellsuspension ausreichend fließt, bevor Sie die Nadel in das Gehirn einführen. Führen Sie die Nadel in eine Tiefe von z entspricht minus 1,4 Millimeter naden in das Gehirn ein, um das Transplantat an den grauen Materie-/Weißen Stoffrand des tiefen Kortex zu platzieren.

Starten Sie die Spritzenpumpe, um die Zellsuspension über einen Zeitraum von 15 Minuten zu infundieren. Verwenden Sie ein Langzeitmikroskop, um den Zellsuspensionsabfluss zu überwachen, der die Operationsstelle während der Injektion mit steriler Saline bewässert, um die Gewebefeuchte aufrechtzuerhalten. Wenn alle Zellen geliefert sind, ziehen Sie langsam die Transplantationsnadel zurück und bewässern Sie die Operationsstelle mit zusätzlicher Saline, bevor Sie den Schnitt mit neuen Nähten schließen.

Dann liefern Sie postoperative Pflege, wie gezeigt. Für einen Klebebandentfernungstest verwenden Sie zunächst ein kleines Rasiermesser, um gelbe und rote Teile des Elektrobandes auf einer glatten Glasoberfläche in drei mal fünf Millimeter Streifen zu schneiden. Bringen Sie die Mäuse mindestens 30 Minuten vor dem Test in den Verhaltenstestraum und verwenden Sie ein Handhabungstuch, um die Maus durch die Schürfwunden des Halses und des Rückens so zu halten, dass die Maus die Vorderpfoten von ihrem Körper und Kopf fernhält.

Verwenden Sie eine Pinzette, um einen Klebestreifen auf die Plantaroberfläche jedes Vorderpfoes zu legen und verwenden Sie einen empfindlichen und konsistenten Fingerdruck, um die Streifen an den Pfoten zu sichern. Legen Sie die Maus schnell in einen Kunststoffzylinder und starten Sie zwei Stoppuhren, wenn die Maus alle vier Pfoten auf der Kunststoff-Testbox hat. Dann verwenden Sie die beiden Stoppuhren, um die Latenzen für linke Pfotenanzeige, linke Pfotenentfernung, rechte Pfotenanzeige und rechte Pfotenentfernung aufzuzeichnen.

In diesem Pilotexperiment wurde die Vorderbeinfunktion allein bei Derkerei, kontrollierten kortikalen Schlagverletzungen und naiven Mäusen verglichen. Mäuse, die operiert wurden, wiesen vorübergehende erhöhte Latenzen auf, um klebefreie Reize für ein bis drei Tage unmittelbar nach der Operation und vorübergehende postoperative Defizite bei der Klebeentfernung aus dem ipsilateralen Vorpaw zu bemerken. Mäuse, die kontrollierten kortikalen Auswirkungen unterzogen wurden, wiesen jedoch signifikante Defizite in der motorischen Leistung in der Vorpaw kontralateral zu der Verletzung im Vergleich zu naiven Mäusen aus dem postoperativen Tag 28.

Die Immunostainierung von Maus-Gehirnabschnitten für menschliches Kernantigen zeigt, dass menschliche Zelltransplantate deutlich von Wirtsgeweben bei SHAM-Verletzungen und kontrollierten kortikalen Aufprallgehirnen unterschieden werden können. Sie müssen bei der Handhabung kultivierter menschlicher Zellen und beim Umgang mit Spritzennadeln, die mit Nagetieren oder immunsuppressiven Medikamenten in Berührung kommen, die üblichen Laborsicherheitsverfahren beachten. Hirngewebeabschnitte können für die Expression von neuroinflammatorischen Markern analysiert werden, da es wertvoll ist zu wissen, wie das Transplantat die Reaktion auf die Wirtsgewebeverletzung beeinflusst und umgekehrt.

Wir waren überrascht, subtile Geschlechtsunterschiede in den Verhaltensergebnissen nach der Verletzung zu finden. Wir untersuchen nun, ob Sex eine Rolle bei der Neuroimmunreaktion auf Hirnverletzungen spielt. Stetige Hände, Geduld und Übung sind entscheidend für die Entwicklung einer guten Kraniektomie-Technik.

Kollateralschäden durch eine unsachgemäße Kraniektomie können den Bereich gefährden, den Sie für die Zelltransplantation ins Visier nehmen möchten.