Isolation, Kultur, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Muskelprogenitorzellen aus dem Skelettmuskelbiopsieverfahren
23. August 2019
Wir präsentieren Techniken zur Isolierung, Kultivierung, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Primärmuskelvorläuferzellen (hMPCs), die aus Skelettmuskelbiopsiegewebe gewonnen werden. hMPCs, die durch diese Methoden gewonnen und charakterisiert werden, können anschließend verwendet werden, um Forschungsfragen im Zusammenhang mit menschlicher Myogenese und Skelettmuskelregeneration zu behandeln.
Die Isolierung der menschlichen Muskelvorläuferzellen, die die Regeneration der Skelettmuskulatur regulieren, ermöglicht es uns, Prozesse zu untersuchen, die dem regenerativen Prozess zugrunde liegen, während die Variabilität der Spender erhalten bleibt. Diese Technik ermöglicht es, große Erträge von menschlichen Muskelvorläuferzellen aus kleinen Mengen von Gewebe und ihre phätotypische Analyse mit einer kleinen Anzahl von Zellen zu erhalten. Diese Methode wurde speziell entwickelt, um menschliche Muskelvorläuferzellen zu isolieren, um ihre Proliferations- und Differenzierungsfähigkeiten zu verfolgen und diese Daten mit dem Regenerationsprozess des Skelettmuskels in Beziehung zu setzen.
Der schwierigste Aspekt dieser recht einfachen Technik ist, sicherzustellen, dass jeder Schritt reproduzierbar durchgeführt wird, um die Ausbeute und Reinheit der Zellen zu optimieren. Es gibt mehrere Schritte, die für eine erfolgreiche Isolierung der Zellen abgeschlossen werden müssen. Einige der Schritte sind leichter zu verstehen, wenn sie visuell beobachtet werden.
Um menschliche Muskelvorläuferzellen aus Biopsiegewebe zu isolieren, legen Sie das Muskelgewebe in eine sterile Petrischale unter sterilen Bedingungen und verwenden Sie ein steriles Skalpell, um das Gewebe in ein Millimeter gewürfelte Stücke zu zerkleinern. Wenn das gesamte Gewebe gehackt wurde, übertragen Sie die Stücke in eine 15-Milliliter-Röhre mit 10 Milliliter PBS und lassen Sie das Gewebe durch die Schwerkraft absetzen, bevor Sie den Überstand sorgfältig anzapfen, ohne das Gewebe zu stören. Nachdem Sie die Fragmente ein zweites Mal gewaschen haben, wie gerade gezeigt, ersetzen Sie das PBS durch 10 Milliliter des modifizierten Eagle-Mediums dulbecco mit niedrigem Glukoseniveau.
Entfernen Sie den Überstand, nachdem das Gewebe abgelegt wurde, und setzen Sie die Stücke in drei Milliliter Verdauungsmedium wieder aus. Legen Sie das Gewebe 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, mit Triturierung der Muskelfragmente alle 10 Minuten mit einer ein Milliliter serologischen Pipette. Am Ende der Inkubation 83 Mikroliter zusätzliches Verdauungsmedium und 24 Mikroliter Dispase-Lösung in die Proben geben und das Gewebe alle fünf bis zehn Minuten mit einer breitbohrenden Pipettenspitze trituieren, bis eine gleichmäßige Gülle erreicht ist.
Eine gleichmäßige Gülle ist wichtig für die maximale Erholung der menschlichen Muskelvorläuferzellen. Setzen Sie die Verdauung fort, wenn die Gülle nicht durch eine Standard-Pipettespitze von 1.000 Mikroliter geht. Um die Pax7-positiven Zellen zu isolieren, färben und torieren Sie die Zellen gemäß dem Protokoll.
Sortieren Sie die CD56, CD29 doppelt positiven menschlichen Muskelvorläuferzellen auf einem Durchflusszytometer mit einer 100-Mikrometer-Düse bei einem Druck von 20 Pfund pro Quadratzoll in Sammelröhrchen, die ein 300-Mikroliter-Kissen fluoreszenzaktivierten Zellsortierpuffer summieren. Dann säen Sie die sortierten menschlichen Muskelvorläuferzellen in kollagenbeschichtete 24-Well-Platten, die ein vorgewärmtes Wachstumsmedium bei einer 3,5-mal 10-bis-die vierten Zelle pro Zentimeter quadratinder Konzentration enthalten. Um Zusammenflussscans durchzuführen, laden Sie die Platte auf ein bildgebendes Zytometer, und wählen Sie Neue Scan erstellen und die Plattenkategorie, das Plattenprofil und die Platten-ID.Unter Anwendung wählen Sie Confluence und Confluence 1 aus, und wählen Sie einen Brunnen aus, der angezeigt werden soll.
Suchen Sie eine Fokusebene, in der die Zellen im Vergleich zum Hintergrund weiß erscheinen, und wählen Sie Handbuch registrieren aus. Verwenden Sie die Maus, um alle Bohrungen hervorzuheben, die gescannt werden müssen, und wählen Sie Scan starten aus. Der gesamte Brunnenbereich wird automatisch gescannt.
Wählen Sie die Analyseeinstellungen aus, die für den Platten- und Zelltyp optimal sind, und wählen Sie Analyse starten aus. Verwenden Sie das bildgebende Zytometer, um den Zusammenfluss zunächst zu messen. Um dann die Zellen auf dem bildgebenden Zytometer zu zählen, ersetzen Sie das Medium in jedem Brunnen durch 200 Mikroliter Färbelösung.
Nach 15 Minuten bei 37 Grad Celsius die Färbelösung durch 100 Mikroliter frischen Schinken F12 ersetzen. Geben Sie die Platte an das bildgebende Zytometer zurück, und wählen Sie unter Anwendung Die Option Zelllebensfähigkeit und Live Dead Total aus. Der Live-Kanal wird ein helles Feldbild sein, der Dead-Kanal zeigt die Propidium-Iodid-Färbung und der Total-Kanal wird die Hoechst 33342 Färbung sein.
Klicken Sie unter Fokus-Setup auf Auto registrieren. Legen Sie unter dem Kanal Total den Kanal auf blau fest. Verwenden Sie Fokus suchen, um die Kerne in den Fokus zu rücken, und klicken Sie auf Versatz festlegen, um den Fokus auszuwählen.
Stellen Sie unter dem Kanal "Tote" den Kanal auf Rot ein, und verwenden Sie "Fokus suchen", um die toten Zellen in den Fokus zu rücken. Klicken Sie auf Versatz festlegen, um den Fokus auszuwählen, und wählen Sie Scan starten aus, um den Scan zu starten. Wählen Sie dann die Analyseparameter aus, die für den Platten- und Zelltyp geeignet sind, und wählen Sie Analyse starten aus, um die Analyse zu starten.
Wenn die Analyse abgeschlossen ist, überprüfen Sie visuell, ob die Analyse die Zellen entsprechend gezählt hat. Wenn der Scan und die Analyse zufriedenstellend sind, geben Sie die Platte an den Inkubator zurück, andernfalls scannen oder ändern Sie die Analyseparameter. Menschliche Muskelvorläuferzellen können durch erste Gating-Ereignisse identifiziert werden, die auf dem Seiten- und Vorwärtsstreubereich basieren, um abgestorbene Zellen oder Trümmer zu beseitigen, gefolgt von der Auswahl nur der Zellen, die negativ für 7-AAD sind und daher lebensfähig sind.
Die Zellen, die sowohl für CD56- als auch cd29-Zelloberflächenmarker positiv sind, stellen dann die Population der menschlichen Muskelvorläuferzellpopulation dar. Menschliche Muskelvorläuferzellen können auch durch ihre Pax7-Expression identifiziert werden. Tatsächlich ist Pax7 in der Gesamtbevölkerung nach FACS bereichert und wird durch mehrere Passagen aufrechterhalten.
Hier wird ein repräsentativer Zusammenflussscan angezeigt. Die grünen Umrisse wurden durch das bildgebende Zytometer erzeugt und zeigen, wie das bildgebende Zytometer den Zusammenfluss anhand der ausgewählten Analyseeinstellungen bestimmt. Eine Heterogenität und Kernzahl ist zwischen Spendern üblich.
Diese Heterogenität zu entdecken und genau zu charakterisieren, ist eine schlüsselfertige Anwendung des bildgebenden Zytometers. Die Zusammenflussmessungen und Kernzählungen von Einzelspendern sind jedoch stark korreliert. Menschliche Muskelvorläuferzellen, die zu Myoröhren differenziert sind, können durch ihre embryonale Myosin-schwere Kettenexpression unterschieden werden.
Es ist wichtig, bei der Auswahl der Gating-Parameter auf dem Durchflusszytometer konsistent zu sein, um die gleiche Zellpopulation von jedem Spender zu isolieren. Einmal isoliert, menschliche Muskel Vorläuferzellen können für mehrere Zwecke verwendet werden, einschließlich der Identifizierung der einzigartigen metabolischen Anforderungen der Proliferation und Differenzierung der menschlichen Muskel Vorläuferzellen. Die Isolierung menschlicher Muskelvorläuferzellen hat die Diskriminierung der Unterschiede in der Zelloberflächenmarker-Expression auf menschlichen und Mausmuskelvorläuferzellen ermöglicht.
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Übersicht
In diesem Artikel werden Techniken zur Isolierung und Charakterisierung humaner primärer muskulärer Vorläuferzellen (hMPCs) aus Biopsiematerial der Skelettmuskulatur vorgestellt. Diese Methoden ermöglichen es Forschern, die humane Myogenese und die Regeneration der Skelettmuskulatur zu untersuchen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Regenerative Medizin
Hintergrund
- Menschliche Muskelvorläuferzellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Regeneration des Skelettmuskels.
- Die Isolierung dieser Zellen ermöglicht die Untersuchung regenerativer Prozesse unter Berücksichtigung der Spendervariabilität.
- Methoden zur Zellisolierung müssen reproduzierbar sein, um eine optimale Ausbeute und Reinheit sicherzustellen.
- Die visuelle Beobachtung der Isolierungsschritte kann das Verständnis verbessern.
Zweck der Studie
- Isolierung menschlicher Muskelvorläuferzellen zur Erforschung der Muskelregeneration.
- Analyse der Proliferations- und Differenzierungsfähigkeit dieser Zellen.
- Einordnung der Ergebnisse in den gesamten Regenerationsprozess des Skelettmuskels.
Verwendete Methoden
- Isolierung von hMPCs aus Biopsiematerial der Skelettmuskulatur.
- Charakterisierung der isolierten Zellen.
- Phänotypische Analyse unter Verwendung geringer Zellmengen.
- Verfolgung der Proliferations- und Differenzierungsfähigkeit.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von hMPCs aus minimalen Gewebeproben.
- Die Charakterisierung der Zellen zeigt ihr Potenzial für Forschungsanwendungen auf.
- Die Reproduzierbarkeit der Methode gewährleistet zuverlässige Ergebnisse.
- Es werden Erkenntnisse über den Regenerationsprozess des Skelettmuskels gewonnen.
Schlussfolgerungen
- Die vorgestellten Techniken eignen sich zur Isolierung und Untersuchung von hMPCs.
- Mithilfe dieser Methoden kann das Verständnis der Muskelregeneration vorangebracht werden.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können auf diesen Erkenntnissen aufbauen, um therapeutische Anwendungen zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Isolierung und Charakterisierung menschlicher Muskelprogenitorzellen (hMPCs) aus Biopsien des Skelettmuskels ermöglicht eine mechanistische Entlastung bei der Validierung von Zielstrukturen in der Muskelregeneration. Dieser Ansatz unterstützt die phänotypische Bildschirmanalyse und die Entwicklung von Assays, indem er ein krankheitsrelevantes System mit Spenderheterogenität bereitstellt, das die klinische Variabilität widerspiegelt. Die Methode erhöht das Vorhersagevertrauen in präklinischen Modellen, indem die zelluläre Expansionskapazität mit regenerativen Ergebnissen des Skelettmuskels verknüpft wird.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, die mit Wegen der Regeneration des Skelettmuskels zusammenhängen.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominderung durch funktionelle Validierung der Proliferation und Differenzierung menschlicher MPCs.
- Wissenschaftlicher Wert: Fördert das Vertrauen in Zielstrukturen, indem zelluläre Phänotypen mit regenerativen Prozessen in Beziehung gesetzt werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet ein standardisiertes, reproduzierbares System zur Herstellung validierter biologischer Proben für nachgeschaltete Screening-Verfahren.
- Operationaler Wert: Ermöglicht quantitative Messungen der Konfluenz und der Kernanzahl mittels bildgebender Zytometrie zur Standardisierung von Assays.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Skalierbarkeit von Assays und die Wiederverwendung von Plattformen durch konsistente Isolations- und Ansäteprotokolle.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet ein krankheitsrelevantes System, um die Variabilität der Expansionskapazität zwischen Spendern zu untersuchen, was zur Abstimmung translationsrelevanter Biomarker beiträgt.
- Operationaler Wert: Stellt eine kontinuierliche Übertragung von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung sicher, indem die Pax7-Expression und das Differenzierungspotential zu Myotuben erhalten bleiben.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem Mechanismen identifiziert werden, die der Heterogenität des regenerativen Potentials zugrunde liegen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis zur präklinischen Bewertung, indem sie quantifizierbare, nach Spendergruppen stratifizierte zelluläre Phänotypen bereitstellt.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen, indem die Proliferation und Differenzierung isolierter hMPCs verfolgt werden kann.
- Screening: Bietet Bereitschaft und Reproduzierbarkeit von Assays durch standardisierte Gewebeverdauung, FACS-Sortierung und Beschichtung von Platten mit Kollagen.
- Analytik: Erzeugt quantitative Konfluenz-Scans und Zellkernzählungen, die einen Vergleich zwischen Spendern sowie die Bewertung verschiedener Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Forschung durch Erhaltung der myogenen Differenzierungsfähigkeit und Expression der embryonalen schweren Myosinkette in den gebildeten Myotuben.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert einen wiederverwendbaren Workflow zur Isolierung und Charakterisierung, der auf mehrere Spenderproben und experimentelle Bedingungen anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Zielvalidierung durch Verknüpfung der zellulären Expansion mit regenerativer Kapazität.
- Operationaler Wert: Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Zellausbeute und -reinheit durch optimierte Verdauungs- und Sortierschritte.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen durch die Möglichkeit, die Funktionalität von Muskelvorläuferzellen donorstratifiziert zu bewerten.
- Portfolio-Wirkung: Risikobasierte Priorisierung von Regenerationszielen mithilfe von Heterogenität-bezogenen Metriken zur Expansionskapazität.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit primärem Gewebe, Durchflusszytometrie und bildgebender Zytometrie zur Isolierung und Analyse lebensfähiger Zellen.
- Benötigt eine sterile Zellkulturinfrastruktur, Geräte für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung sowie automatisierte Bildgebungssysteme.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen den Teams bei den Gating-Protokollen für CD56/CD29 und Pax7, um eine konsistente Identifizierung humaner Muskelvorläuferzellen (hMPCs) über verschiedene Spender hinweg sicherzustellen.
- Benötigt Anpassungen hinsichtlich der variierenden Gewebequalität der Spender und der Biopsiegröße, um die Effizienz der Isolierung aufrechtzuerhalten.
- Zu den praktischen Einschränkungen zählen die vom Spender abhängige Variabilität der Zellausbeute und der Proliferationskinetik, was größere Stichprobenumfänge für ausreichende statistische Aussagekraft notwendig macht.
