Name: Bewertung der Speicherstabilität von extrakellulären Bläschen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Speicherstabilität von extrazellulären Vesikeln mit Glucuronidase als Marker und AF4-Reinigung bewerten. Dieses Protokoll ermöglicht den Vergleich verschiedener Zellherkünfte für therapeutische Anwendungen.

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Das NanoMatFutur Junior Research Programm des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (Fördernummer 13XP5029A) unterstützte diese Arbeit. Maximilian Richter wurde von der Studienstiftung des Deutschen Volkes durch ein Promotionsstipendium unterstützt.

1. Zellkultur und die Produktion von zellkonditionierten Medium
<ol><li>In der Regel werden Zellen unter den für die jeweilige Zelllinie erforderlichen individuellen Bedingungen kultiviert.</li>
	<li>Die Zellen 24-72 h in serumfreien Bedingungen oder in Medium mit EV-abgereichertem fetalen Rinderserum (FBS) für 24-72 h kultivieren. Hinweis: Wenn EV-erschöpfte FBS verwendet wird, verwenden Sie eine Methode, die nachweislich das Serum effizient erschöpft, um eine Kontamination mit Rinder-Serum-abgeleiteten EVs 26 zu verhindern.</li>
	<li>Sammeln Sie das Medium aus den Flaschen. Zentrifuge bei 300 x g für 10 min, um die Zellen zu pustieren. Sammeln Sie vorsichtig das zellkonditionierte Medium (CCM), ohne die Pellezellen zu stören. Am besten nutzen Sie das CCM direkt oder lagern es über Nacht bei 4 ° C. Hinweis: Es ist immer besser, frisch produzierte CCM zu verwenden. Wenn die Speicherung über längere Zeiträume nicht umgangen werden kann, sollten alle relevanten Parameter nach den MISEV2018-Richtlinien26erfasst werden, wobei die möglichen Vorurteile der erworbenen Ergebnisse zu berücksichtigen sind.</li>
	<li>Beispielprotokoll für HUVECs<ol>
<li>Anbau von HUVEC-Zellen für 120 h in EGM-2-Medium, das FBS und andere Nahrungsergänzungsmittel enthält.</li>
		<li>Anbau von HUVEC-Zellen für 48 h im EBM-2-Basalmedium ohne Zusatzstoffe.</li>
		<li>Sammeln Sie das Medium aus den Flaschen und führen Sie den Zentrifugationsschritt wie oben angegeben durch (Schritt 1.3). In der Regel verwenden Sie 100 ml Medium für eine EV-Isolierung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Ultraentrifugation of CCM
<ol><li>Unmittelbar vor der Ultrakentrifugation (UC), zentrifugen Sie das CCM für 15 Minuten bei 3.000 x g und 4 ° C, um Zellschutt und große Agglomerate zu entfernen.</li>
	<li>Übertragen Sie das Supernatant vorsichtig auf die UC-Rohre. Wenn Sie einen festen Winkelrotor verwenden, markieren Sie die Ausrichtung der Rohre in der Zentrifuge, um das Abrufen des EV-Pellets nach dem UC zu erleichtern. Zentrifuge für 2 h bei 120.000 x g,mit einem k-Faktor von 259,4.</li>
	<li>Nach dem UC den Supernatanten vorsichtig mit einem serologischen Piptier ablegen, um eine Störung der pellenden EVs zu vermeiden. Achtung: Das Pellet ist unsichtbar.</li>
	<li>200 μL von 0,2 μm gefilterter Phosphat-gepufferten Saline (PBS) in die erste Röhre geben und PBS und das Restsupernatant verwenden, um das Pellet durch Pipetting auf und ab zu reanimieren. Die daraus resultierende EV-Federung auf das nächste Rohr der jeweiligen Probe übertragen und für die Wiederbelebungsrente verwenden. Gehen Sie auf diese Weise fort, um alle EVs der Probe in einem Endvolumen von etwa 300-350 μL wiederzubeleben.</li>
	<li>Nach der Wiedererlangung bestätigen Sie das Vorhandensein von Partikeln durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA). Verwenden Sie die Einstellungen, die für den angegebenen EV-Typ optimiert sind, wie die folgenden Einstellungen (Schritt 2.5.1). Hinweis: Die Papiere von Gardiner et al. 27 und Vestadet al. 28 enthalten wertvolle Informationen darüber, wie die Parameter für die Messung von Elektrofahrzeugen optimiert werden können.<ol>
<li>Um die unten beschriebenen Ergebnisse zu reproduzieren, verwenden Sie Instrumente (z.B. NanoSight LM14), die mit einem grünen Laser ausgestattet sind. Nehmen Sie drei Videos von 30 s mit einem Bildschirmgewinn von 1,0 und einem Kamerastand von 13 auf. Für die Analyse verwenden Sie einen Bildschirmgewinn von 1,0 und eine Erfassungsschwelle von 5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie das Pellet sofort, wenn möglich; Ansonsten bei 4 ° C über Nacht lagern.</li>
</ol>3. Glucuronidase-Verkapselung in EVs
<ol><li>In das wiederaufgebrachte Pellet, Beta-Glucuronidase (10 mg/mL in PBS) zu einer Endkonzentration von 1,5 mg/mL und Saponin (10 mg/mL in H2 O)zu einer Endkonzentration von 0,1 mg/mL hinzufügen. Gut vermischen durch Wirbeln für 3 s.</li>
	<li>Inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur mit durchmischtem Mischen durch sanftes Flimieren der Röhre. Nach der Inkubation direkt durch die Größe-Ausschlusschromatographie (SEC) reinigen (siehe Abschnitt 5). Hinweis: Glucuronidase-Proben nach dem Auftauen nicht wieder einfrieren, um eine Enzymabbauung durch das Einfrieren zu verhindern.</li>
</ol>4. Liposomproduktion
<ol><li>Zur Vorbereitung der Liposome für den Vergleich mit Elektrofahrzeugen, 1, 2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DMPC) und 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DPPC) in einer 2:3 Molarenform in Chloroform auf eine Endkonzentration von 5 mM auflösen. Bereiten Sie 1 mL Aliquots in Hochleistungs-Flüssigchromatographien (HPLC) vor und lassen Sie sie über Nacht zu einem Lipidfilm trocknen. CAUTION: Chloroform ist giftig und vermutet, dass es sich um eine Cancerogenik handelt. TNeine Vorsichtsmaßnahmen bei der Handhabung.</li>
	<li>Die Lipidfolie mit 1 mL PBS mit 1,5 mg/mL Glucuronidase erniedrigen. Die Extrudermontage auf 42 ° C erhitzen und die Lipidaufhängung 11x durch eine 200 nm Polycarbonatmembran extrudieren. Direkt durch SEC reinigen (siehe Abschnitt 5).</li>
</ol>5. Reinigung durch SEC
<ol><li>Bereiten Sie die SEC-Spalte mit dem folgenden Protokoll vor.<ol>
<li>Verwenden Sie nur frisches gereinigtes Wasser und frisch zubereitete Puffer. Alle Puffer durch einen 0,2 μm Membranfilter filtern und entgas geben, um die Bildung von Luftblasen in der Säule zu verhindern.</li>
		<li>Für die Herstellung einer SEC-Säule verwenden Sie eine agarose Gel-Filtrationsmatrix (z.B. Sepharose Cl-2b) oder ein anderes SEC-Medium, das geeignet ist, Elektro-und Liposome von Proteinverunreinigungen und überschüssigem Enzym zu trennen. Entfernen Sie zunächst die 20% EtOH-Lösung, in der das Medium gespeichert ist, um eine Luftblasenbildung in der Säule zu verhindern. Zu diesem Zweck zentrifugen Sie das SEC-Medium bei 3.000 x g für 10 min, entfernen Sie die EtOH und ersetzen Sie es durch entgiftetes Wasser.</li>
		<li>Füllen Sie eine Glassäule (mit einem Innendurchmesser von 10 mm) mit dem SEC-Medium auf die 15 mL-Marke. Hinweis: Die Lautare unterscheiden sich bei Spalten mit unterschiedlichen Abmessungen. Achten Sie darauf, dass sich das Gel vollständig ansiedeln lässt.</li>
		<li>Vor einem Durchlauf die Spalte mit mindestens zwei Spaltenbänden PBS ausgleichen. Um die Säule zu lagern, waschen Sie sie zuerst mit einem Säulenvolumen Wasser, gefolgt von mindestens zwei Säulenbänden von 20% EtOH. Nach der Lagerung die Säule zuerst mit einem Säulenvolumen Wasser waschen, bevor Sie mit PBS ausgleichen.</li>
		<li>Verwenden Sie bis zu 400 μL EV oder Liposomaufhängung in einer Trennung. Sammeln Sie Bruchteile von 1 mL. Nach SEC lagern Sie entweder die gereinigten Elektrofahrzeuge (siehe Abschnitt 7) oder unterziehen sie einem Glucuronidase-Test (siehe Abschnitt 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bestätigen Sie die Trennung von Elektro-und Liposomen von kontaminierenden Proteinen und freier Glucuronidase. Dazu korrelieren die Partikelkonzentrationen der gesammelten Bruchteile mit der Proteinkonzentration und der Glucuronidase-Aktivität.<ol>
<li>Die Partikelkonzentration durch NTA bewerten (siehe 2.5)</li>
		<li>Bewerten Sie den Proteingehalt anhand von Bicinchoninsäure-Assay (BCA) oder einem anderen geeigneten Proteinquantifizierungs-Test. Führen Sie den Test nach dem Herstellerprotokoll durch.</li>
		<li>Bewerten Sie die Glucuronidase-Aktivität durch Glucuronidase-Assay (siehe Abschnitt 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bewerten Sie optional die EV-Morphologie durch die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und die Rasterelektronenmikroskopie (SEM).<ol>
<li>Für die Vorbereitung von TEM-Proben, 10 μL EV-Aufhängung in ein TEM-Gitter, Inkubat für 10 min, und dann mit einem Filterpapier überschüssige Flüssigkeit wegzublättern. Führen Sie die Fixierung für 10 min mit 10 μL von 4% Paraformaldehyd und blot away von überschüssigem. 3x mit Wasser waschen. Mit 30 μL von 1% Phosphor-Zungsiesäure-Hydrat werden die Bläschen um 20 s inkubiert. Nach dem Abblenden die Exzesse, trocknen Sie die Bläschen über Nacht. Visualisieren durch TEM. CAUTION: Phospho-Täsensäure ist hochgradig ätzend; So schützen Haut und Augen.</li>
		<li>Für SEM die zuvor vorbereiteten TEM-Proben auf Carbon-Scheiben fixieren und mit einer 50 nm dicken Goldschicht ausspülen. Visualisieren durch SEM.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Glucuronidase Assay
<ol><li>Um einen Vergleich zwischen verschiedenen Proben und Lagerbedingungen durch die Korrelation von Partikelzahl und Enzymaktivität zu ermöglichen, messen Sie zunächst die Partikelkonzentration der Probe durch NTA (siehe Schritt 2.5).</li>
	<li>Bereiten Sie eine funktionierende Lösung für Fluorescein di-β-D-Glucuronide vor, indem Sie 1 μL der Verbindung (10 mg/mL in H2 O)auf 199 μL von PBS hinzufügen. Um eine endgültige Konzentration von 8,3 μg/mL zu erhalten, können Sie 25 μL dieser Lösung auf 125 μL gereinigte Elektroautos hinzufügen. Die Probe in eine schwarze 96-Wellplatte pikieren. Messen Sie den Zeitpunkt 0 h mit einem Plattenleser, mit 480 nm als Anregung und 516 nm als Emissionswellenlänge.</li>
	<li>Die Platte fest bedecken (z.B. mit transparenter Kunststofffolie, die für PCR-Platten verwendet wird), um die Verdunstung zu minimieren und im Dunkeln 18 h bei 37 ° C zu inkubieren. Messen Sie die Fluoreszen-Produktion mit den in Schritt 6.2 aufgeführten Plattenleserparametern.</li>
</ol>7. Lagerung von Elektro-und Liposomen
NOTE: Für alle Speicherzwecke ist es ratsam, mit niedrig bindenden Rohren den EV-Verlust durch Adsorption zu reduzieren.
<ol><li>Befolgen Sie die Parameter in diesem Abschnitt, um die unten angegebenen repräsentativen Ergebnisse zu reproduzieren. Verwenden Sie Proben, die aus 400 μL EV-Aufhängung bestehen.<ol>
<li>Bei 4 ° C oder-80 ° C aufbewahren oder zu den unten aufgeführten Schritten gehen.</li>
		<li>Lyophilize die EVs.<ol>
<li>Trehalose (40 mg/mL in H2 O)bis zu einer Endkonzentration von 4 mg/mL zu den gereinigten Elektrofahrzeugen hinzufügen. Die Proben bei-80 ° C mindestens 1 Stunde einfrieren.</li>
			<li>Lyophilisieren Sie die Proben mit den folgenden Parametern. Für die Haupttrocknung die Regaltemperatur auf 15 ° C und den Druck auf 0,180 mbar stellen und die Proben 46 h trocknen lassen. Für die abschließende Trocknung die Regaltemperatur auf 25 ° C und den Druck auf 0,0035 mbar stellen und die Proben 2 Stunden trocknen lassen.</li>
			<li>Um die Proben zu rehydrieren, fügen Sie H2 O hinzu, was der Menge der EV-Aufhängung entspricht, die am Anfang vorhanden ist (typischerweise 400 μL). Verwenden Sie keinen Puffer für die Rehydratation.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Analyse nach der Lagerung
<ol><li>Um die Enzymaktivität zu beurteilen, entfernen Sie zuerst die freie Glucuronidase, die während der Lagerung aus dem EVs durchgesickert sein kann. Dies wird durch einen zusätzlichen Reinigungsschritt erreicht, der entweder von SEC (siehe Schritt 5) oder asymmetrischer Strömungsfeldfraktionierung (AF4) durchgeführt wird (siehe Schritt 8.1.2). Hinweis: Bitte beachten Sie, dass beide Methoden zu einer Verdünnung der EV-Probe führen; Verwenden Sie also ausreichend EV-Konzentrationen vor der Speicherung, um zu vermeiden, dass Sie sich unterhalb der NTA-Quantifizierungsgrenze bewegen. Erwarten Sie eine 1:10 Verdünnung der Partikel durch SEC oder AF4.<ol>
<li>Für die SEC-Reinigung folgen Sie dem oben beschriebenen Protokoll (siehe Abschnitt 5).</li>
		<li>Die AF4-Reinigung durchführen.<ol>
<li>Das Instrument mit einem kleinen Kanal mit einem 350 μm-Abstandshalter und einer 30 kD-Molekularen Gewichtsabschnitt-Zellulose-Membran einrichten. Legen Sie einen 0,1 μm Porengrößenfilter zwischen der HPLC-Pumpe und dem AF4-Kanal. Verwenden Sie frisch zubereitete 0,1 μm gefilterte PBS als mobile Phase, um die Partikelbelastung und Geräusche in den lichtstreubenden Detektoren zu reduzieren.</li>
			<li>Erkennen Sie Proteine mit einem UV-Detektor auf 280 nm. Um Partikel zu erkennen, verwenden Sie die Mehrwinkellichtstreuung mit dem Laser-Set auf 658 nm.</li>
			<li>Verwenden Sie die folgende Laufmethode. Vorfokus für 1 min mit einem Fokusfluss von 1 mL/min; Dann 300 μL der Probe mit einer Geschwindigkeit von 0,2 mL/min einspritzen und den Fokusfluss 10 min hochhalten. Nach der Injektion wird die Probe bei 1 mL/min bei einem Kreuzfluss, der von 2 mL/min auf 0,1 mL/min im Verlauf von 8 min abnimmt, abgeltzt. Sammeln Sie Bruchteile von 1 mL, beginnend nach 12,5 min und fortgesetzt bis 27 Minuten.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Führen Sie den Glucuronidase-Test wie oben beschrieben durch (siehe Abschnitt 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um die Größe und Konzentration zu beurteilen, verwenden Sie die NTA wie oben beschrieben (siehe Schritt 2.5).</li>
	<li>Optional können TEM und SEM durchgeführt werden, um die Morphologie des EVitens nach der Lagerung zu beurteilen (siehe 5.3).</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In diesem Manuskript stellen wir ein umfassendes Protokoll vor, um die Stabilität von Elektrofahrzeugen unter verschiedenen Lagerbedingungen zu untersuchen. Mit der Kombination aus verkapselter Glucuronidase als funktioneller Auslesung und der Auswertung der physikalisch-chemischen Parameter der EVs ermöglicht das Protokoll eine einfache Speicherstabilitätsbewertung von Elektroautos und den Vergleich von Elektrofahrzeugen aus verschiedenen Zellen text. SEM und TEM als komplementäre Methoden ermöglichen einen Einblick in ...

Es handelt sich dabei um membrangebundene Nanopartikel, die von fast allen Zelltypen hergestellt werden. Für Säugetierzellen können Elektroautos in zwei Hauptgruppen mit unterschiedlichen Produktionswegen 1,2 unterteilt werden. Membranbläschen mit einer Größe von ca. 100-1000 nm werden durch direktes Kleben aus der Zellmembran hergestellt. Exosome, die 30-200 nm groß sind, werden von multivesiculären Körpern abgeleitet, die durch innere Einkeimende in Endosomen gebildet werden, die sich anschließend mit der Zellmembran verschmelzen, um mehrere Exosomen auf einmal freizugeben. Die Hauptfunktion dieser Bläschen ist der Transport von Informationen zwischen denZellen 3. Dazu werden Ladungen wie RNA, DNA und Proteine aktiv in sie einsortiert. EVs können eine Vielzahl von Auswirkungen auf ihre Ziele vermitteln, mit Auswirkungen auf Gesundheit und Krankheitszustand. Auf der einen Seite vermitteln sie positive Effekte wie Geweberegeneration, Antigen-Präsentation oder Antibiotika-Effekte, die sie zu günstigen Zielen für ihre Entwicklung als Therapeutika4,5machen. Auf der anderen Seite können Elektrofahrzeuge die Tumorvasskularisierung 6fördern, bei Stressreaktionen 7 zu Nebenwirkung von Gegensenzeneffektenführenund bei Autoimmunerkrankungen 8 und Entzündungskrankheiten 9 eine Rolle spielen. Sie könnten daher eine Schlüsselkomponente für ein besseres Verständnis vieler pathologischer Effekte sein. Das Vorhandensein von veränderten Elektroautos bei vielfältigen Erkrankungen, wie Krebs10, 11,12undHerz-Kreislauf-Erkrankungen 13,und ihre einfache Zugänglichkeit in Blut und Urin macht sie ideal Biomarker. Schließlich machen ihre gute Bioverträglichkeit 14 und ihre ihm innewohnende Targeting-FähigkeitEVs auch für die Medikamentenzufuhr 15 interessant. In diesem Manuskript beschreiben wir ein Protokoll zur Bewertung der Speicherstabilität von Elektrofahrzeugen, die von Säugetierzellen abgeleitet werden, eine wichtige Eigenschaft, die noch wenig erforscht ist.
Für die klinische Entwicklung von Elektrofahrzeugen gibt es noch viele Hindernisse für die Übermontage 16, einschließlich der Bewertung ihrer therapeutischen Wirkungen, Produktion, Reinigung und Lagerung17. Während-80 ° C weithin als Goldstandardfürdie EV-Lagerung 18 angesehen wird, sind die benötigten Gefrierschränke teuer, und die Aufrechterhaltung der benötigten Kühlkette von der Produktion bis zum Patienten kann eine Herausforderung sein. Darüber hinaus deuten einige Berichte darauf hin, dass die Lagerung bei-80 ° C den Elektro-und Restbetrag noch nicht optimal bewahrt und einen Verlust an EV-Funktionalität19,20verursacht. Andere Methoden, wie das Gefriertrocknen 21,22 oder die Spritztrocknung 23, wurden als mögliche Alternativen zur Tiefkühllagerung von Elektrofahrzeugen vorgeschlagen.
Die optimale Möglichkeit, die Speicherstabilität zu beurteilen, wäre, die EVs in funktionellen Assays zu testen oder durch die Auswertung eines bestimmten Markers, zum Beispiel ihrer antibakteriellenAktivität 19. Dies ist möglich, wenn die gewünschte Wirkung der Bläschen bekannt ist und eine bestimmte Gruppe von Elektrofahrzeugen untersucht werden soll. Wenn Elektro-und Zellquellen verglichen werden sollen (z.B. für die Medikamentenverkapselung) oder wenn es keine funktionelle Auslesung gibt, ist es nicht mehr möglich, Veränderungen aufgrund der Lagerung direkt zu beurteilen.
Auf der anderen Seite prognostiziert die einfache Bewertung von Veränderungen ihrer physikalisch-chemischen Parameter, wie Größe, Partikelwiederherstellung und Proteinkonzentration, nicht immer Veränderungen in der EV-Aktivität, wie in einem kürzlichveröffentlichten Patent 20 gezeigt wurde.
Hier stellen wir ein leicht anwendbares Protokoll zur Messung der Lagerstabilität von Elektrofahrzeugen zur Verfügung, indem wir ihre physikalisch-chemischen Parameter in Kombination mit der Aktivität eines verkapselten Beta-Glucuronidase-Enzyms als Ersatz für die Ladung der Elektrofahrzeuge bewerten. Die Belastung des Enzyms erfolgt durch Saponin-Inkubation, eine milde Methode,die mit EVs aus verschiedenen Quellen 21,24,25hergestelltwird. Saponin bildet in der EV-Membran vergängliche Poren, die die Enzymaufnahme in die Bläschen ermöglichen. Da Enzyme dazu neigen, ihre Aktivität zu verlieren, wenn sie ungünstigen Lagerbedingungen ausgesetzt sind, sind sie ein idealer Ersatz für die Bewertung der Erhaltung der Funktionsgüter der Elektrofahrzeuge.
Wir haben gezeigt, dass die Anwendung dieses Protokolls auf alle, die von menschlichen mesenchymalen Stammzellen (MSCs), menschlichen Nabelvein-Endothelzellen (HUVECs) und menschlichen Adenokarzinomen alveolare Epithelzellen (A549) abgeleitet werden, tatsächlich zu großen Unterschieden in der Speicherstabilität zwischen verschiedenen Zelllinien, die bei der Auswahl der EV-Quelle 21 berücksichtigt werden sollte.

<table><tbody><tr><td>1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-cholin (DMPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2663-25MG</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-cholin (DPPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4329-25MG</td><td></td></tr><tr><td>225 cm&sup2; Zellkulturkolben</td><td>Corning</td><td>431082</td><td>Verwendung mit 25 ml Medium</td></tr><tr><td>30 kDa regenerierte Zellulosemembran</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td>1854</td><td></td></tr><tr><td>350 &Mikro; m Abstandhalter</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatisierter Fraktionssammler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beta-Glucuronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7646-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher scientific</td><td>C/4966/17</td><td></td></tr><tr><td>Säulenofen</td><td>Hitachi High-Technologies Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Trehalose-Dihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9531-10G</td><td></td></tr><tr><td>DAWN HELEOS II, Mehrwinkel-Lichtstreudetektor</td><td> Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Durapore Membranfilter, PVDF,&nbsp; 0,1&nbsp; &Mikro; m, 47&nbsp; mm</td><td>Merck</td><td>VVLP04700</td><td>Wird zur Vorbereitung von Puffern für AF4</td></tr><tr><td>EBM-2</td><td>Lonza Verviers, S.p.r.</td> verwendet<td>CC-3156</td><td>Basalmedium für das Wachstum von Endothelzellen, das für die serumfreie Kultur von HUVEC-Zellen verwendet</td></tr><tr><td>wird Eclipse dualtec</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGM-2</td><td>Lonza Verviers, S.p.r.</td><td>CC-3162</td><td>Endothelzell-Wachstumsmedium, verwendet für die normale Kultur von HUVEC-Zellen</td></tr><tr><td>ELISA-Plattenversiegelungen</td><td>R& D Systems</td><td>DY992</td><td>zur Versiegelung von 96-Well-Platten für den Glucuronidase-Assay</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher scientific</td><td>E/0665DF/17</td><td></td></tr><tr><td>Extruder Set mit Halter/Heizblock</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Filterträger</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610014-1EA</td><td>zur Liposomenvorbereitung</td></tr><tr><td>Fluorescein di-&beta;-D-Glucoronid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F2915</td><td></td></tr><tr><td>Gibco PBS-Tabletten+CA10:F36</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>Hettich Universal 320 R</td><td>Andreas Hettich GmbH & Co.KG</td><td></td><td>Wird zum Pelletieren von Zellen bei 300 g</td></tr><tr><td>verwendet Hettich Rotina 420 R</td><td>Andreas Hettich GmbH & Co.KG</td><td></td><td>Wird zum Pelletieren von größeren Abfällen bei 3000 g</td></tr><tr><td>verwendet HUVEC Zellen</td><td>Lonza Verviers, S.p.r.</td><td>C2517A</td><td></td></tr><tr><td>Kimble&nbsp; FlexColumn 1X30CM</td><td>Kimble</td><td>420401-1030</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilisierer ALPHA 2-4 LSC</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen, Polypropylen</td><td>VWR international</td><td>5255</td><td>die Röhrchen, die für alle EV-Handhabungen verwendet werden, erwiesen sich als günstiger als vergleichbare Produkte anderer Anbieter in Bezug auf die Partikelrückgewinnung</td></tr><tr><td>Nanosight LM14 ausgestattet mit einem grünen Laser</td><td>Malvern Pananalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanosight-Software Version 3.1</td><td>Malvern Pananalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleopore 200 nm Track-Etch Polycarbonat-Membranen</td><td>Whatman/GE Healthcare</td><td>110406</td><td>für die Liposomenpräparation verwendet</td></tr><tr><td>PEEK Inline-Filterhalter</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphotungssäurehydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79690-25G</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonat-Flaschen für die Ultrazentrifugation</td><td>Beckman Coulter</td><td>355622</td><td></td></tr><tr><td>QuantiPro BCA Assay Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>QPBCA-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Rasterelektronenmikroskopie Zeiss EVO HD 15</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sepharose Cl-2b</td><td>GE Gesundheitswesen</td><td>17014001</td><td></td></tr><tr><td>REM Kupfer Gitter mit Kohlenstofffolie</td><td>Plano</td><td>S160-4</td><td></td></tr><tr><td>Kleiner AF4-Kanal</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sputter-Coater Q150R ES</td><td>Quorum Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transmissionselektronenmikroskopie JEOL JEM 2011</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typ 45 Ti Ultrazentrifugationsrotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Dionex Autosampler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Dionex isokratische Pumpe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Dionex Online-Vakuumentgaser</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge OptimaTM L-90 K</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-Detektor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman 0.2 &Mikro; Mischzellulosefilter mit Porengröße</td><td>Whatman/GE Healthcare</td><td>10401712</td><td>Wird für die Filtration aller Puffer verwendet, die mit Elektrofahrzeugen und in SEC verwendet werden</td></tr></tbody></table>

bewertung der speicherstabilität von extrakellulären bläschen

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Extrakelluläre Bläschen (EVs) sind vielversprechende Ziele in der aktuellen Forschung, die als Medikamente, Drogenträger und Biomarker eingesetzt werden sollen. Für ihre klinische Entwicklung ist nicht nur ihre pharmazeutische Aktivität wichtig, sondern auch ihre Produktion muss bewertet werden. In diesem Zusammenhang konzentriert sich die Forschung auf die Isolierung von Elektrofahrzeugen, ihre Charakterisierung und ihre Lagerung. Das vorliegende Manuskript zielt darauf ab, ein oberflächliches Verfahren zur Beurteilung der Auswirkungen unterschiedlicher Lagerbedingungen auf Elektrofahrzeuge zu ermöglichen, ohne genetische Manipulation oder spezifische funktionale Untersuchungen. So kann man sich schnell einen ersten Eindruck von der Stabilität von Elektrofahrzeugen unter einem bestimmten Speicherzustand verschaffen und aus verschiedenen Zellquellen abgeleitete Varianten leicht vergleichen. Die Stabilitätsmessung basiert auf den physikalisch-chemischen Parametern der EVs (Größe, Partikelkonzentration und Morphologie) und der Erhaltung der Ladungsaktivität. Letzteres wird durch die Saponin-vermittelte Verkapselung des Enzyms Beta-Glucuronidase in die EVs bewertet. Glucuronidase fungiert als Leihmutter und ermöglicht eine einfache Quantifizierung über die Spaltung eines fluoreszierenden Reportermoleküls. Das vorliegende Protokoll könnte ein Instrument für Forscher bei der Suche nach Speicherbedingungen sein, die die EV-Eigenschaften optimal behalten, um die EV-Forschung in Richtung klinischer Anwendung voranzutreiben.

Abbildung 1 zeigt die Speichereigenschaften von von HUVECs isolierten Elektrofahrzeugen. Die EVs wurden von UC isoliert, die Glucuronidase gekapselt, und nach SEC wurden die gereinigten Elektrofahrzeuge von NTA auf ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften hin bewertet. Eine Probe der Bläschen wurde anschließend einer AF4-Reinigung unterzogen und die Glucuronidase-Aktivität gemessen.
Die Bläschen wurden dann für 7 d bei 4 ° C oder-80 ° C und bei 4 ° C in lyophilisierter Form ...

Hier legen wir ein leicht anwendbares Protokoll vor, um die Speicherstabilität von extrazellulären Bläschen zu beurteilen, einer Gruppe natürlich vorkommender Nanopartikel, die von Zellen produziert werden. Die Vesikel werden als Modellenzym mit Glucuronidase beladen und unter unterschiedlichen Bedingungen gelagert. Nach der Lagerung werden ihre physikalisch-chemischen Parameter und die Aktivität des verkapselten Enzyms ausgewertet.

Bewertung der Speicherstabilität von extrakellulären Bläschen

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Die Speicherstabilität von extrazellulären Vesikeln ist ein wichtiger Parameter für ihre prospektive therapeutische Anwendung. Unser Protokoll bietet ein leicht anwendbares Werkzeug zur Bewertung der Auswirkungen der Lagerung auf die Vesikel. Der Hauptvorteil unserer Technik besteht darin, dass durch die Einführung von Glucuronidas e als exogener Marker, extrazellulären Vesikeln, die von verschiedenen Elternzellen abgeleitet werden, leicht in Bezug auf ihre Storierbarkeit verglichen werden kann.Asymmetrische Strömungsfeldflussfraktionierung, oder AF4, ist eine milde Alternative zur Größenausschlusschromatographie-Reinigung für sehr empfindliche Verbindungen. Denn die Verbindungen stoßen im Kanal auf weniger Stress. Da Glucuronidase ein empfindliches Enzym ist, profitiert die Qualität der residierenden von einer gründlichen Planung und Durchführung der Schritte zur Reinigung und Analyse von hinten nach hinten.Nach der Kultivierung der Zelllinie von Interesse unter den Standardbedingungen für diese Zellen, ersetzen Sie den Überstand mit Serum frei oder extra zellulären Vesikel erschöpft Medium und die Zelle in den Zellkultur-Inkubator für weitere 24 bis 72 Stunden zurück. Am Ende der

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dies ist ein Protokoll, um Gewebe extrazelluläre Vesikel (EVs) aus der Leber zu isolieren. Das Protokoll beschreibt einen zweistufigen Prozess mit Kollagenaseperfusion, gefolgt von differentialer Ultrazentrifugation, um Lebergewebe-EVs zu isolieren.

Isolierung von Gewebe extrazellulären Vesikeln aus der Leber

Das Protokoll beschreibt eine reproduzierbare Methode zur Verwendung mit Zelle Kultur Überstände, Oberfläche Epitope auf kleine extrazelluläre Vesikel (EV) zu erkennen. Es nutzt spezifische EV Immunopräzipitation mit Perlen mit Antikörpern, die Oberflächenantigen CD9, erkennen CD63 und CD81 gekoppelt. Die Methode ist für nachgeschaltete Flow Cytometry Analyse optimiert.

Fließen Sie durchflusszytometrischen Analyse der extrazellulären Vesikel aus Zelle konditioniertes Medien

Der vorliegende Bericht hebt die chronologischen Anforderungen an die extrazelluläre Vesikel-Isolierung (EV) von Mikroglia oder Blutmakrophagen hervor. Mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge wurden als Regulatoren des Neuritenwachstums evaluiert, während von Blutmakrophagen abgeleitete Elektrofahrzeuge bei der Kontrolle der C6-Gliomzellinvasion in In-vitro-Assays untersucht wurden. Ziel ist es, diese EV-Funktionen als Immunvermittler in bestimmten Mikroumgebungen besser zu verstehen.

Charakterisierung von immunzellulären Vesikeln und Untersuchung der funktionellen Auswirkungen auf die Zellumgebung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Kennzeichnung von extrazellulären Vesikeln aus Thrombozytenlysat vor, um ihre Migration und Aufnahme in Knorpelexplantaten zu überwachen, die als Modell für Osteoarthritis verwendet werden.

Markierung extrazellulärer Vesikel zur Überwachung der Migration und Aufnahme in Knorpelexplantaten

Das vorliegende Protokoll enthält detaillierte Beschreibungen für die Isolierung, Konzentration und Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus Cyanobakterienkulturen. Ansätze zur Reinigung von Vesikeln aus Kulturen auf verschiedenen Skalen, Kompromisse zwischen den Methoden und Überlegungen zur Arbeit mit Feldproben werden ebenfalls diskutiert.

Isolierung und Charakterisierung von zyanobakteriellen extrazellulären Vesikeln

Wir stellen ein Protokoll zur Isolierung und Gefrierfraktur von extrazellulären Vesikeln (EVs) vor, die aus krebsartigen Urothelzellen stammen. Die Gefrierbruchtechnik enthüllte den Durchmesser und die Form der EVs und - als einzigartiges Merkmal - die innere Organisation der EV-Membranen. Diese sind von immenser Bedeutung, um zu verstehen, wie Elektrofahrzeuge mit den Empfängermembranen interagieren.

Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie zur extrazellulären Vesikelanalyse

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Extraktion extrazellulärer Vesikel aus dem peripheren Blut und festem Gewebe mit anschließender Profilierung von Oberflächenantigenen und Proteinladungen.

Isolierung und Analyse von nachweisbaren und funktionalisierten extrazellulären Vesikeln aus dem Plasma und festen Geweben

Dieses Protokoll bietet eine detaillierte Beschreibung der Sortierung extrazellulärer Vesikel (EVs), die von mesenchymalen Stromazellen freigesetzt werden. Dabei geht es insbesondere um die Geräteeinstellung und die Optimierung der Sortierbedingungen. Ziel ist es, extrazelluläre Vesikel zu sortieren und dabei ihre Eigenschaften zu erhalten.

Festlegen einer erfolgreichen Sortierung für die Isolierung extrazellulärer Vesikel

Hier beschreiben wir die in vitro Kulturbedingungen, die Isolierung und die verstärkte Bildung von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus Echinococcus granulosus. Die kleinen EVs wurden durch dynamische Lichtstreuung und Transmissionselektronenmikroskopie charakterisiert. Die Aufnahme durch dendritische Zellen aus dem Knochenmark und ihre phänotypische Modulation wurden mittels konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie untersucht.

Isolierung und dendritische Zellaufnahme von kleinen extrazellulären Vesikeln aus Echinococcus granulosus

Hier demonstrieren wir die Charakterisierungsmethode für extrazelluläre Vesikel (EVs), die aus biologischen Flüssigkeiten wie Tränen und Speichel von menschlichen Probanden gewonnen wurden. Der bei dieser Methode verwendete Scanner ist in der Lage, den Phänotyp, die Größe und die Gesamtpartikelzahl von EVs aus 1 μl der Probe zu erkennen.

Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus biologischen Flüssigkeiten

Erfahren Sie, wie Sie die Speicherstabilität von extrazellulären Vesikeln mit Glucuronidase als Marker und AF4-Reinigung bewerten. Dieses Protokoll ermöglicht den Vergleich verschiedener Zellherkünfte für therapeutische Anwendungen.

Bewertung der Speicherstabilität von extrakellulären Bläschen

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