Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia
5. September 2019
Wir beschreiben eine Methode zur Verwendung von Multiparameter-Durchflusszytometrie zum Nachweis von mitochondrialen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in murinen gesunden hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und Leukämiezellen aus einem Mausmodell akuter myeloischer Leukämie (AML), das von MLL-AF9.
Reaktive Sauerstoffspezies oder ROS sind hochreaktive Sauerstoffspezies, die von Zellen produziert werden und ihr Verhalten beeinflussen. Obwohl überschüssiges ROS kann auch weit verbreitete zelluläre Verwüstung verursachen, und in schweren Fällen, Zelltod. Daher ist die Aufrechterhaltung der ROS-Homöostase von grundlegender Bedeutung für die Zellfunktion und das Überleben.
Das hier vorgestellte Protokoll konzentriert sich auf die Messung einer bestimmten Art von ROS, die von Mitochondrien erzeugt wird, hauptsächlich als metabolisches Nebenprodukt in lebenden, normalen oder gesunden hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellpopulationen sowie in Leukämiezellen aus dem Mausmodell von Blutkrebs, akuter myeloischer Leukämie oder AML. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um zu bewerten, wie genetische Manipulation, wie Gen-Deletion oder Überexpression, mitochondriale ROS in mehreren gesunden und bösartigen hämatopoetischen Populationen beeinflusst. Und als Ergebnis, potenziell geben aufschlussreiche Informationen über Redux Zustand und möglicherweise den Stoffwechsel der Zellen.
Diese Technik erlaubt die Strömungsabgleichs-Metrikanalyse einer protogenen Sonde zur Überwachung der mitochondrialen ROS-Produktion in lebenden gesunden und bösartigen hämatopoetischen Stamm- und Vorläufer-Subpopulationen. Dieses Protokoll ist einfach und kann in wenigen Stunden abgeschlossen werden. Darüber hinaus eignet es sich für die Analyse von lebenden Zellen und ermöglicht die Unterscheidung und Analyse von mitochondrialem ROS in der Stammzellpopulation im Knochenmark unter Verwendung von Oberflächenmarkierungen der Färbung.
Nach dem Sammeln mononuklearer Knochenmarkzellen von wilden engen Mäusen und leukämischen MLL-AF9-Mäusen, laut Manuskript, aliquot 200 Mikroliter der Zellsuspension in jedem der neun einfarbigen Kontrollröhren. Aliquot die verbleibenden Zellen in andere experimentelle Röhren, jeweils 200 Mikroliter. Legen Sie dann in eine Zentrifuge zwei Versuchsröhren mit Knochenmarkzellen bzw. leukämischen Zellen und ein Kontrollrohr.
Zentrifuge bei 300 mal G für fünf Minuten. Als nächstes dekantieren Sie den Überstand und hängen Sie die Zellen bei Raumtemperatur F-PBS mit einem Lebenden/toten Zellfleck nach den Anweisungen des Herstellers wieder auf. 30 Minuten auf Eis bebrüten.
Fügen Sie danach 1 Milliliter Raumtemperatur F-PBS zu den drei lebenden/toten gebeizten Röhren und ein einziges Farbkontrollrohr für mitochondriale ROS-Färbung hinzu. Legen Sie die Rohre bei 300 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur in die Zentrifuge. Dann erhalten Sie eine 5 Millimolar mitochondriale ROS Farbstoff-Stock-Lösung durch erneutes Suspendieren von 50 Mikrogramm mitochondrialen ROS-Farbstoff in 13 Mikroliter DMSO.
Fügen Sie dann 13 Milliliter Raumtemperatur F-PBS in den 13 Mikroliter mitochondrialen ROS-Farbstoff, um eine endgültige Konzentration von fünf Mikromolaren zu verdünnen. Falls erforderlich, fügen Sie 13 Mikroliter 50 Millimolar Verapamil in die Lösung, um mitochondriale Efflux-Pumpen zu hemmen. Die Rohre aus der Zentrifuge beziehen und die Wäsche des lebenden/toten Zellflecks absaugen.
Fügen Sie 200 Mikroliter F-PBS in die Live/Dead-Färbungskontrolle ein und halten Sie sie im Eis, bis sie bereit sind, die Analyse zu starten. Fügen Sie 200 Mikroliter des mitochondrialen ROS-Farbstoffflecks, der Verapamil enthält, zu jedem Versuchsröhrchen sowie dem mitochondrialen ROS-Färbungskontrollrohr hinzu. Wirbel zu mischen und inkubieren für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius in der Dunkelheit.
Dann fügen Sie 1 Milliliter Raumtemperatur F-PBS in die Steuer- und Versuchsrohre. Zentrifuge fünf Minuten bei 300 mal G bei Raumtemperatur. Apirieren Sie das Überstand und waschen Sie die Zellen mit einem zusätzlichen Milliliter Raumtemperatur F-PBS.
Zentrifuge wieder für fünf Minuten bei 300 mal G, bei Raumtemperatur. Bereiten Sie zunächst zwei Antikörpercocktails für gesunde und Leukämie-Knochenmarkzellen zu. Aspirieren Sie den Überstand aus dem Versuchsröhrchen, der gesunde Knochenmarkzellen enthält, und fügen Sie 200 Mikroliter des Antikörpercocktails Nummer eins in die Röhre ein.
Wirbel zu mischen. Bereiten Sie auch die einzelnen Farbkontrollröhrchen vor, indem Sie 200 Mikroliter F-PBS und einen Mikroliter des entsprechenden Antikörpers hinzufügen. 60 Minuten auf Eis im Dunkeln bebrüten.
Aspirieren Sie den Überstand aus dem Versuchsröhre, das Leukämieknochenmark enthält, und fügen Sie 200 Mikroliter des Antikörpercocktails Nummer zwei in die Röhre ein. Wirbel zu mischen. 60 Minuten auf Eis im Dunkeln bebrüten.
Danach alle Schläuche mit 1 Milliliter kaltem F-PBS und Zentrifuge fünf Minuten bei 300-fachem G bei Raumtemperatur waschen. Die Zellen in 500 Mikroliter kaltem F-PBS wieder aussetzen. Übertragen Sie die Zellsuspension in jedes Durchflusszytometerrohr mit einem 40-Mikrometer-Filter zum Ausschließen von Aggregaten.
Legen Sie zunächst ein Fleckenregelrohr in die Durchflusszytometriemaschine und starten Sie die Erfassung, um die Durchflusszytometriemaschine zu kompensieren. Wiederholen Sie dies für andere Steuerrohre. Danach lesen Sie die Versuchsrohre, um die Tore aufzustellen.
Um die Größe und Komplexität der Zellpopulation zu analysieren, zuerst für gesunde HSPC, legen Sie die Vorwärtsstreufläche und die Seitenstreuungsflächen zu, die Populationen darstellen. Drücken Sie die Quadratische Tor-Taste, um fremde Trümmer aus dem vorderen und seitlichen Streudiagramm herauszuräumen. Verwenden Sie dann auf einem vorderen Streubereich und Höhendiagramm einen doppelten Diskriminator, um Doublets auszuschalten.
Wählen Sie lebende Zellen, Linien-niedrige Zellen und die verschiedenen gesunden HSPC. Analysieren Sie für jede Voninteressespopulation die mediane Fluoreszenzintensität des TRPE-Kanals in einem Histagram-Plot, um Unterschiede im mitochondrialen ROS-Signal zu bewerten. Wiederholen Sie das gleiche Verfahren der Größenanalyse, Gating und Histogramm-Plotting für Leukämiepopulationen.
Knochenmarkzellen, die von gesunden Mäusen isoliert wurden, wurden mit einem lebenden/toten Farbstoff und einem mitochondrialen ROS-Farbstoff gefärbt und anschließend mit Antikörpern gefärbt, die Linienmarker erkennen:plus CD48, C-Kit, Sca-1, CD34 und CD150. Darüber hinaus wurden Knochenmarkzellen von Leukämiemäusen auch mit CD45.2 gefärbt, um zwischen MLL-AF9-Leukämiezellen aus gesunden Empfängerknochenmarkzellen zu unterscheiden, die mit CD45.1 gefärbt sind. Ein Vergleich der mitochondrialen ROS-Färbung, zwischen gesunden CD48 negativen LSK, und myeloiden Vorläufern, zeigt, dass myeloische Vorläufer deutlich höhere Konzentrationen von mitochondrialer ROS-Färbung aufweisen.
Darüber hinaus zeigen c-Kit-Vorläufer mit hoher Leukämie signifikant höhere Konzentrationen von mitochondrialer ROS-Färbung im Vergleich zu c-Kit-Mittel-Niederleukämiezellen, gesunden CD48-negativen LSK- und myeloischen Vorläufern. C-Kit-Mittel-Niedrigleukämie-Zellen, zeigte auch einen deutlich höheren Wert im Vergleich zu CD48 negativen LSK-Zellen, aber nicht zu myeloischen Vorläufern. Mitochondriale ROS-Farbstoffe sind hochreaktiv und geeignete Waschschritte sind erforderlich, um sicherzustellen, dass ein Überschuss des Farbstoffs entfernt wurde, bevor die folgenden Schritte beginnen.
Es gibt mehrere chemisch unterschiedliche ROS fluorogene Farbstoffe, die in diesem Protokoll verwendet werden können, um ein wenig Wissen über den Redux-Status in lebenden hämatopoetischen Zellen zu erreichen. Diese Technik wurde in der Literatur ausgiebig verwendet und kann nützliche Einblicke in die stoffwechsel- und Signalwege liefern, die in Leukämiezellen differential reguliert werden, wenn sie mit ihren normalen Gegenstücken verglichen werden.
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Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Detektion von mitochondrialen reaktiven Sauerstoffverbindungen (ROS) in murinen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und Leukämiezellen vorgestellt. Der Schwerpunkt liegt auf dem Verständnis der Rolle von ROS bei der zellulären Funktion und dem Überleben, insbesondere im Kontext der akuten myeloischen Leukämie (AML).
Wesentliche Studienbestandteile
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Onkologie
Hintergrund
- Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) werden von Zellen produziert und beeinflussen ihr Verhalten.
- Ein Überschuss an ROS kann zu zellulären Schäden und Zelltod führen.
- Die Aufrechterhaltung der ROS-Homöostase ist entscheidend für die zelluläre Funktion.
- Die Studie konzentriert sich auf mitochondriale ROS, die in hämatopoetischen Populationen gebildet werden.
Zweck der Studie
- Um mitochondriale ROS in gesunden und Leukämiezellen zu messen.
- Um die Auswirkungen genetischer Manipulationen auf die Konzentration mitochondrialer ROS zu bewerten.
- Um Einblicke in den Redoxzustand und den Zellstoffwechsel zu erhalten.
Verwendete Methoden
- Multiparametrische Durchflusszytometrie zur ROS-Detektion.
- Analyse muriner gesunder HSPCs und Leukämiezellen.
- Beurteilung der Auswirkungen genetischer Modifikationen auf ROS.
- Verwendung eines Mausmodells der akuten myeloischen Leukämie (AML).
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Detektion von mitochondrialen ROS sowohl in gesunden als auch in Leukämiezellen.
- Erkenntnisse über die Auswirkungen genetischer Veränderungen auf ROS-Spiegel.
- Verständnis der Rolle von ROS im zellulären Stoffwechsel.
- Mögliche Implikationen für therapeutische Strategien bei AML.
Schlussfolgerungen
- Die Methode bietet eine zuverlässige Möglichkeit, mitochondriale ROS zu untersuchen.
- Die Ergebnisse könnten zukünftige Forschungsarbeiten zum zellulären Stoffwechsel bei Leukämie beeinflussen.
- Das Verständnis der ROS-Dynamik kann zu verbesserten therapeutischen Ansätzen führen.
Häufig gestellte Fragen
Praktische Bedeutung für die Industrie
Die Überwachung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen liefert eine quantitative Aussage über den zellulären Redoxzustand und die metabolische Aktivität, die entscheidende Parameter bei der frühen Zielvalidierung und der mechanistischen Entlastung von hämatologischen Erkrankungen darstellen. Dieser durchflusszytometrische Ansatz ermöglicht die Unterscheidung von ROS-Spiegeln in verschiedenen gesunden und malignen Subpopulationen und unterstützt somit die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen in präklinischen Entdeckungsabläufen. Die Verträglichkeit der Methode mit der Analyse lebender Zellen und die kurze Durchlaufzeit erleichtern die Integration in Screening- und Assay-Entwicklungsprozesse zur Identifizierung von Leitstrukturen und zum Aufbau vorhersagender Zuverlässigkeit.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem mitochondriale ROS als funktioneller Endpunkt der metabolischen Neuprogrammierung in Leukämie-Stamm- und Vorläuferzellen quantifiziert werden.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch direkten Vergleich der ROS-Signalgebung zwischen gesunden HSPCs und MLL-AF9-getriebenen Leukämie-Vorläuferzellen und verdeutlicht dabei krankheitsassoziierte Stoffwechselveränderungen.
- Prädiktiver Wert: Erzeugt quantitative Messungen mitochondrialer ROS, die zur Einschätzung der Zielvalidität und zur Priorisierung von Wirkstoffkandidaten beitragen, indem sie den Redoxzustand mit der Fitness und Überlebenssignalwegen leukämischer Zellen verknüpfen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte, reproduzierbare Messungen von mitochondrialen ROS mittels Durchflusszytometrie und ermöglicht so eine zuverlässige Substanzscreening-Identifizierung von Modulatoren der mitochondrialen Funktion in hämatopoetischen Zellen.
- Quantitative Ausgabe: Liefert Daten zur medianen Fluoreszenzintensität aus Histogrammen des TRPE-Kanals und stellt damit eine skalierbare Metrik für Dosis-Wirkungs-Analysen und die Validierung von Hits in Wirkstoffentdeckungskampagnen bereit.
- Plattformnutzung: Etabliert einen wiederverwendbaren Durchflusszytometrie-Workflow zur Beurteilung oxidativen mitochondriale Stress in verschiedenen präklinischen Modellen und unterstützt so die konsistente Durchführung mechanistischer Assays über Projekte hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Bedeutung für die Krankheit: Erfasst den unterschiedlichen Gehalt an mitochondrialen ROS in gesunden HSPC-Teilpopulationen und Leukämie-Progenitoren und schafft damit ein biomarkerbasiertes System zur Untersuchung der AML-Pathogenese.
- Übertragbarkeit und Kontinuität: Verbindet entdeckungsorientierte metabolische Erkenntnisse mit der präklinischen Validierung, indem sie eine langfristige Überwachung der ROS-Dynamik als Reaktion auf genetische oder pharmakologische Störungen ermöglicht.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Entscheidungen über die Fortführung oder Einstellung von Projekten, indem sie ROS-abhängige Schwachstellen in Leukämie-Stammzellen identifiziert und so die mechanistische Unsicherheit vor In-vivo-Wirksamkeitsstudien verringert.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Testung von Zielhypothesen über die Identifizierung von Leitsubstanzen bis hin zur präklinischen Validierung ein, insbesondere für Projekte, die auf die metabolische Umprogrammierung bei hämatologischen Krebserkrankungen ausgerichtet sind. Sie ermöglicht eine biologische Entlastung in einem frühen Stadium, indem sie funktionelle Messgrößen bereitstellt, die genetische und phänotypische Screening-Daten ergänzen.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch die Messung von mitochondrialen ROS als nachgeschalteten Effektor onkogener Signalübertragung in MLL-AF9-getriebenen Leukämie-Modellen.
- Screening: Liefert gebrauchsfertige, quantitative Messungen des mitochondrialen ROS-Spiegels, die die Bewertung von Substanzen und die Modellierung von Struktur-Wirkungs-Beziehungen in Screenings von Stoffwechselmodulatoren unterstützen.
- Analytik: Erzeugt histogrammbasierte Werte für die mediane Fluoreszenzintensität, die einen statistischen Vergleich der ROS-Spiegel unter verschiedenen experimentellen Bedingungen und genetischen Hintergründen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet in vitro beobachtete metabolische Phänotypen mit präklinischen Krankheitsmodellen durch die konsistente Detektion von mitochondrialen ROS in primären murinen Leukämiezellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als standardisierte, modulare Testplattform, die auf mehrere hämatopoetische Zielstrukturen und Krankheitsmodelle anwendbar ist und somit redundante Assay-Entwicklungen in verschiedenen therapeutischen Bereichen reduziert.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem die Produktion von mitochondrialen ROS mit der Identität und dem metabolischen Zustand von Leukämie-Stammzellen verknüpft wird, wodurch die Uneindeutigkeit bezüglich des Wirkmechanismus verringert wird.
- Operationaler Wert: Stellt die Reproduzierbarkeit durch standardisierte Färbungs-, Wasch- und Gating-Verfahren sicher und ermöglicht den Vergleich von Daten zwischen verschiedenen Laboren in multizentrischen Projekten.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem die frühzeitige Erkennung metabolisch aktiver Leukämie-Teilpopulationen ermöglicht wird und dadurch die Priorisierung von Zielstrukturen mit hohem therapeutischem Indexpotenzial unterstützt wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem mechanistische Biomarker bereitgestellt werden, die mit der Fitness von Leukämie-Stammzellen korrelieren, und somit die Entscheidungsfindung bei der Leitstruktur-Optimierung verbessern.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Flusszytometrie-Kompensation, der Färbung lebender Zellen und in Panelen für hämatopoetische Oberflächenmarker zur genauen Unterscheidung von Zellsubpopulationen.
- Hängt von der Verfügbarkeit von Durchflusszytometern ab, die mit geeigneten Lasern und Filtern ausgestattet sind, um fluorogene mitochondriale ROS-Farbstoffe (z. B. TRPE-Kanal) nachzuweisen.
- Erfordert die Standardisierung der Farbstoffkonzentration, Inkubationszeit und Waschschritte zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen, um die Variabilität bei der ROS-Signaldetektion zu minimieren.
- Muss die Reaktivität des Farbstoffs und die Aktivität von Effluxpumpen berücksichtigen; optional kann auf Inhibitoren wie Verapamil zurückgegriffen werden, um eine spezifische Detektion des mitochondrialen Signals sicherzustellen.
- Beschränkt sich auf die relative Quantifizierung von ROS; für absolute Konzentrationen ist eine Kalibrierung mit orthogonalen Methoden erforderlich, was bei der Interpretation vergleichender Daten zwischen Studien zu berücksichtigen ist.
