Name: Herstellung von Amyloid---Sekret alginat Mikroperlen für den Einsatz bei der Modellierung der Alzheimer-Krankheit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von Alginat-Mikroperlen zur Zellkapselung für die kontrollierte Freisetzung von Amyloid-β. Diese Methode ermöglicht langfristige Freisetzungsprofile für neurodegenerative Forschung.

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Die Autoren danken Herrn Kajen Suresparan, Dr. Jonathan Wubetu, Herrn Dominik Grudzinski, Frau Chen Zhao und Dr. Thierry Pilot für ihre Hilfe bei der Optimierung der Alginat-Mikroperlenherstellung, der Zellkultur und der A-Erkennung sowie für nützliche wissenschaftliche Diskussionen.

1. Vorbereitungen
<ol><li>Bereiten Sie 100 ml von 4 % (w/v) Alginat-Stammlösung vor.<ol>
<li>4,4 g Alginat-Natriumsalz wiegen und das Trockenpulver zu 100 ml HEPES-gepufferter Kochsalzlösung (HBS, 20 mM HEPES (0,477 g) mit 150 mM NaCl (0,877 g) in entionisiertem Wasser hinzufügen, das eine Hydratation ermöglicht.</li>
		<li>Verwenden Sie einen Magnetrührer mit einer Geschwindigkeit von 500 Umdrehungen pro Minute (Rpm) und erhitzen Sie bis zu 50 °C, um eine vollständige Alginathydratation zu ermöglichen. HINWEIS: Das Alginat kann ein oder zwei Stunden benötigen, um vollständig hydratisiert zu werden. Um Zeit zu sparen, kann die Alginatlösung einen Tag vor dem Verkapselungsprotokoll gebildet und bei 4 °C bis zum nächsten Tag gelagert werden. Wenn Alginat gekühlt wurde, vorsichtig auf 37 °C mit einem Wasserbad oder einer Kochplatte erhitzen und unmittelbar vor Gebrauch mit einem Magnetrührer rühren.</li>
		<li>Steriler Filter der Alginatlösung mit einem 0,22 m Porenpolyethersulfon (PES) Filter vor Gebrauch. Eine Filterung wird bei 37 °C empfohlen, um einen einfachen Fluss von Alginat zu ermöglichen. Die Viskosität steigt, wenn die Temperatur sinken darf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie 1.000 ml von 0,5 M CaCl2vor.<ol>
<li>Wiegen Sie 55,49 g wasserfreien CaCl2 und lösen Sie sich in 1.000 ml HBS auf (20 mM HEPES und 150 mM NaCl in 1.000 ml entionisiertem Wasser).</li>
		<li>Sterilfilter mit einem 0,22-mm-Poren-PES-Filter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>100 ml Auflösungsmischung vorbereiten.<ol>
<li>Bereiten Sie eine 100 mM HEPES (23,83 g) und 500 mM Trinatriumcitrat-Dihydrat (147,05 g) Lösung in phosphatgepufferter Salin vor.</li>
		<li>Stellen Sie sich mit NaOH oder HCl auf pH 7.4 ein.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Einrichten des Verkapselungssystems
<ol><li>Reinigen Sie die laminare Durchflusshaube.<ol>
<li>Sterilisieren Sie die laminare Durchflusshaube, die den Verkapselungskondensator enthält, mit UV-Exposition, gefolgt von Spritzen mit 70% v/v Ethanollösung.</li>
		<li>Spülen Sie das Verkapselungssystem mit 10 ml 70% v/v Ethanollösung gefolgt von 10 ml sterilem entionisiertem Wasser.</li>
		<li>Befestigen Sie die 300 m Düse und wiederholen Sie Schritt 2.1.2.</li>
		<li>Sprühen Sie die Flasche mit der gefilterten Alginatlösung, die Flasche mit gefilterter Calciumchloridlösung und allen Werkzeugen, Geräten und leeren Kulturplatten, die mit 70 % v/v Ethanollösung verwendet werden, und legen Sie sie in die laminare Durchflusshaube. Vor der Verwendung ein UV-Licht für 30 min wieder einschalten, um gründlich zu sterilisieren.</li>
		<li>Bereiten Sie einen Mitbecher mit einer biologischen Desinfektionslösung auf und legen Sie den Becher in die Haube.</li>
		<li>Füllen Sie ein Becherglas mit 100 ml steriler CaCl2 (wässriger) Lösung und fügen Sie einen magnetischen Rührer hinzu. Stellen Sie die Rührgeschwindigkeit auf 100 Rpm ein. Legen Sie das Becherglas auf eine magnetische Plattform in einer Höhe von 18 cm von der Spitze der Düse. Dieser Becher wird verwendet, um Alginat-Perlen zu sammeln und ihre Gelation zu ermöglichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie Zellen für die Kapselung vor.<ol>
<li>Entfernen Sie Zellen aus dem Inkubator und lösen Sie sich mit 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung vom konfluenten Kolben und inkubieren Sie bei 37 °C für 5-10 min.</li>
		<li>Isolieren Sie eine Probe zur Schätzung der Zelldichte und zentrieren Sie dann die verbleibenden Zellen bei 1.000 U/min für 5 min, um ein Zellpellet zu erhalten.</li>
		<li>Das Pellet in HBS (20 mM HEPES und 150 mM NaCl) wieder aufheben, um die endgültige gewünschte Zellkonzentration zu verdoppeln (z. B. für eine Endkonzentration von 1,5 x 106 Zellen/ml, setzen Sie die Zellen in HBS wieder auf, um eine Konzentration von 3 x 106 Zellen/ml zu erreichen).</li>
		<li>Mischen Sie in einem 50 ml Zentrifugenrohr die Zellsuspension im Verhältnis 1:1 mit einer Alginatlösung von 4 % (w/v), um eine Endsuspension mit der gewünschten Zellkonzentration (z. B. 1,5 x 106 Zellen/ml) in einer Alginatlösung von 2 % (w/v) zu erhalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie die Kapselungsparameter fest.<ol>
<li>Stellen Sie die Geschwindigkeit der Verkapselungsmaschine auf die maximale Extrusionsgeschwindigkeit (8,9 ml/min), die Spannung auf 1,0 kV und die Frequenz auf 5.500 Hz ein. HINWEIS: Diese Parameter wurden zuvor optimiert, um Mikroperlen mit einem Durchmesser von 550 m zu erhalten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Herstellung
<ol><li>Fertigen Sie die Mikroperlen.<ol>
<li>In einer 20 ml Spritze 5 ml der Zellalginatsuspension beladen und eine Spritze am Verkapselungsmittel befestigen.</li>
		<li>Starten Sie den Verkapselungskörper, indem Sie den Durchfluss aktivieren, der die Zellalginatsuspension durch den Feeder drückt. Ein Strom von Tröpfchen wird durch die Düse extrudiert.</li>
		<li>Sammeln Sie die ersten 1 ml im Abfallbecher, um den anfänglichen ungleichmäßigen Strom zu löschen.</li>
		<li>Fahren Sie die restlichen 4 ml weiter, sodass die Tröpfchen in das CaCl 2-Gelationsbad fallen können. Jeder Milliliter kann separat (aber sukzessive) ausgeführt und bei Bedarf in vier verschiedenen Gelationsbädern gesammelt werden. HINWEIS: Bei Kontakt mit dem Gelationsbad vernetzen sich die Alginatinatinin in den Tröpfchen sofort mit den Kalziumionen im Gelationsbad und bilden kugelförmige Mikroperlen.</li>
		<li>Nach einer Minute, entfernen Sie das Gelationsbecher von der magnetischen Plattform und lassen Sie die Mikroperlen für weitere 4 minuten ohne Rührung sitzen (Zeit notwendig, um eine vollständige Gelation über die Mikroperlen bei Raumtemperatur zu ermöglichen).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Holen Sie mikroperlen ab.<ol>
<li>Entfernen Sie alle großen Alginat-Trümmer oder Artefakte mit einer sterilen Pinzette, und verwenden Sie dann eine sterile Kunststoffpipette, um sie in einen 74-mm-Netzfilter zu übertragen, um die Mikroperlen aus dem Gelationsbad abzurufen.</li>
		<li>Übertragen Sie die Mikroperlen mit dem entsprechenden Kulturmedium in ein Zentrifugenrohr und lassen Sie sie 5 min im Zellkulturmedium ausdematrieren.</li>
		<li>Auf eine Kolben-, Teller- oder Petrischale zur Inkubation und weitere Experimente übertragen. HINWEIS: Gelationsbad sollte nicht wiederverwendet werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Prüfung und Verwendung von Mikroperlen
<ol><li>Testen Sie die Qualität der Mikroperlen.<ol>
<li>Um die Zelllebensfähigkeit (oder andere biologische Auslesungen) nach Verkapselung und Kultur zu bewerten, stören Sie die Mikroperlen vorsichtig, um die gekapselten Zellen mithilfe des Auflösungsmixes freizusetzen. HINWEIS: Das erforderliche Volumen der Auflösungsmischung hängt von der Anzahl der pro Test verwendeten Mikroperlen ab. Eine empfohlene Ration beträgt 4 ml Auflösungsmischung zu jeder 1 ml gekapselten Zellen. Dieser Schritt muss nur an einer einzigen Probe für jede Mikroperlenpopulation durchgeführt werden.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Zellen in einem Zellkultur-Inkubator, ergänzt mit 5%CO2 bei 37 °C für 10 min.</li>
		<li>Schätzen Sie die Zelllebensfähigkeit für Zellen, die jetzt wie üblich in Lösung sind, indem Sie Zellen mit Trypanblau färben und eine Hämozytometerkammer verwenden. HINWEIS: Wenn sie automatisierte Zellzähler für Schätzungen der Zelllebensfähigkeit verwenden, sollte darauf geachtet werden, dass Alginatartefakte die Anzahl stören. In diesen Fällen wird die Naualzellzählung empfohlen.</li>
		<li>Um die Stabilität von Mikroperlen zu bewerten, messen Sie den durchschnittlichen Durchmesser für eine Probe aus jeder Mikroperlenpopulation über einen Zeitverlauf mit einem Mikroskop und einer Bildgebungssoftware. Dramatische Nachleinen des Durchmessers können auf einen Alginatabbau hindeuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie Mikroperlen für die Erkennung von abgesonderten A.<ol>
<li>Probenzellkulturmedien aus 7PA2-Zellen, die in Standardbedingungen (2D) in 24-Stunden-Intervallen kultiviert werden und zur weiteren Analyse bei -20 °C speichern.</li>
		<li>Beispielzellkulturmedien aus gekapselten 7PA2-Zellen, die in Standardbedingungen (3D) in 24-Stunden-Intervallen kultiviert werden und zur weiteren Analyse bei -20 °C speichern.</li>
		<li>Nachweis der Sekretion von Aa von 7PA2-Zellen in gesammelte konditionierte Medien durch enzymgebundenen Immunsorbent-Assay (ELISA) (Abbildung 4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie die Mikroperlen für weitere Untersuchungen in relevanten Anwendungen. HINWEIS: Verkapselte 7PA2-Zellen können verwendet werden, um die Auswirkungen einer anhaltenden A-Sekretion in einem oder einem Modell zu bewerten.<ol>
<li>Für Mikroperlentransplantation innerhalb der Ratte Hippocampus in Gehirnen, erzeugen 1 mm dicke koronale Abschnitte der Ratte Gehirn und verwenden chirurgische Werkzeuge, um Mikroperlen in den gewünschten Bereich einfügen (Abbildung5).</li>
		<li>Verkapseln Sie verschiedene Zelltypen in Alginat-Mikroperlen nach den beschriebenen Protokollen, um die nachhaltige Freisetzung der Biomoleküle von Interesse zu bewerten. Relevante In-vitro- und In-vivo-Systeme können weiter modelliert werden.</li>
		<li>Detektieren Sie die Expression membrangebundener Marker von gekapselten Zellen mithilfe von Durchflusszytometrie und/oder Immunfluoreszenz. HINWEIS: Ein Beispiel für die Verwendung einer ähnlichen Methode zur Herstellung von Mikroperlen, die frühe Stadien des Tumormassenwachstums und der Biomarkerexpression modellieren, wird von Rios 20beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die in diesem Artikel beschriebene Methode ist nützlich, um Zellen zu kapseln, die eine schmale Größenverteilung von Alginat-Mikroperlen erreichen27. Es bietet auch den Vorteil des Anbaus von Zellen in einer immunisolierten Umgebung17,19, schutzt sie vor äußerem Stress. Darüber hinaus imitiert die Verkapselung von Zellen in Alginat die physiologischen Bedingungen genauer, insbesondere in Bezug auf Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen und Matrixsteifigkeit20. Diese Faktoren sind alle besonders entscheidend für die spätere Anwendung in relevanten Anwendungen, wie z.B. in vivo Engraftment, die mögliche Immunreaktionen im umgebenden Gewebe ausschließt17. Ein großer Vorteil dieses Protokolls ist zudem die einfache Abstimmung strotzt je nach Anwendung des Interesses: Es ist möglich, das Protokoll zu modifizieren und die Parameter für die Herstellung von größeren oder kleineren und weicheren oder steiferen Perlen zu optimieren. Die beschriebene Methode wird verwendet, um Perlen herzustellen, die klein genug sind, um mit minimalinvasiven Methoden injiziert zu werden, und ausreichend groß genug, um eine Reihe von Zellen zu beherbergen und eine ausreichende Freisetzung von Aa zu ermöglichen, um beobachtbare verhaltensbezogene und pathologische Effekte zu erzielen. bei Injektion in Tiermodelle.
Der Erfolg dieses Protokolls hängt von einer Reihe kritischer Schritte ab. Sorgfältige Zellhandhabung und optimale Zellkultivierungstechniken sind wichtig, um die Zelllebensfähigkeit und Funktion20,28zu erhalten. Die Verwendung von Standardkulturbedingungen gewährleistet die Erhaltung der normalen Funktion von 7PA2-Zellen, wie beobachtet. Dies ermöglicht ein ähnliches Freisetzungsprofil fürA-1-42 aus gekapselten Zellen im Vergleich zu 2D-Kulturen. Darüber hinaus garantiert eine Niedrigviskositätslösung mit niedriger Viskosität bessere Ergebnisse im Vergleich zu einer hochviskosen Alginatlösung. Dadurch wird sichergestellt, dass ein homogener Laminarstrahl durch die Düse extrudiert wird und eine gleichmäßige Zellverteilung innerhalb der Matrix der hergestellten Perlen27. Materialien, die zum Verkapseln von Zellen verwendet werden, müssen einen sehr schnellen Gelationsmechanismus haben, der die Beibehaltung der Form ermöglicht.
Ein weiterer wichtiger Schritt in diesem Protokoll ist der Umgang mit hergestellten Mikroperlen nach der Gelation. Hier zeigen wir das Abholen von Mikroperlen, indem wir eine große Blende Kunststoffpipette verwenden, um die Perlen zu übertragen. Alternativ kann das Gießen der Calciumchloridlösung, die die Mikroperlen enthält, in einen Netzfilter für den Perlenabruf verwendet werden. Eine große (5, 10 oder 25 ml) serologische Pipette kann verwendet werden, um die Mikroperlen zu erstellen und dann durch den Netzfilter gewaschen werden, anstatt zu gießen. Der Vorteil ist ein höheres Vertrauen in die Sterilität des Verfahrens im Vergleich zum Gießen. Die Einschränkungen sind jedoch, dass einige Perlen verzerrt werden können, wenn sie von der Pipette komprimiert werden, zusätzlich zu riskieren, eine geringere Ausbeute, wenn ein großer Teil der Mikroperlen nicht gerettet werden.
Dieser Ansatz wurde verwendet, um verschiedene Zelllinien zu verkapseln, um verschiedene Krankheiten zu modellieren und zu untersuchen (z. B. Freisetzung von Insulin aus verkapselter Pankreas-Islet). Die Neuheit unseres Ansatzes ist die Transplantation der Mikroperlen, die mit diesem Protokoll als nützliche Methode zur Modellierung wichtiger Aspekte der Alzheimer-Krankheit in vivo erzeugt werden. Vergleicht man das Freisetzungsprofil von Aa aus gekapselten Zellen (Abbildung 4) mit den durch eine Bolusinjektion erzeugten A-Werten (wie in anderen Studien3,26)kann eine chronischere und anhaltende Freisetzung von A erwartet. Abbildung 6 zeigt die vorhergesagte Tendenz, die erreicht werden kann. Die Verwendung dieses Systems für die In-vivo-Modellierung ist relevanter für den Fortgang der Krankheit und kann bei der Entdeckung und Entwicklung von Arzneimitteln nützlicher sein.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig6.jpg"> Abbildung 6 : Voraussichtliches Freisetzungsprofil vonA-1-42 aus gekapselten 7PA2-Zellen im Vergleich zu einer Bolusinjektion. Das Profil der A-Freisetzung aus transplantierten 7PA2-haltigen Mikroperlen ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen chronischer und anhaltender A-A-Freisetzung in einem Tiermodell, das für AD relevant ist. Umgekehrt würde eine Bolus-Injektion eine Spitze der A-Spiegel über einen kurzen Zeitraum erzeugen, gefolgt von einer schnellen Clearance von A a vom Gehirn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Die Modellierung neurodegenerativer Erkrankungen ist aufgrund der komplexen und komplizierten Natur des Gehirns eine Herausforderung. Bei der Alzheimer-Krankheit (AD) wird angenommen, dass der fortschreitende Verlust der synaptischen Funktion und der Tod von Neuronen eine nachgelagerte Wirkung einer anhaltenden Überproduktion und Akkumulation von Amyloid-Beta-Peptiden nach abnormaler Verarbeitung des Amyloid-Vorläufers sind. Protein (APP) nach der Amyloid-Kaskadenhypothese1.
Um die Mechanismen dieser Amyloid-induzierten Pathologie zu verstehen und bei der Identifizierung neuartiger Behandlungsziele zu helfen, haben Wissenschaftler verschiedene in vivo präklinische Modelle entwickelt. Eine Kategorie von Modellen nutzt eine Bolus-Injektion eines synthetischen A-Peptid in das Rattenhirn2,3,4. Die Hauptbeschränkung solcher Modelle ist, dass sie auf einem Einzigen-Punkt-oder wiederholten Behandlungen mit A-Peptiden in hohen Konzentrationen in einem Rutsch abgelagert verlassen. Dies steht im Widerspruch zu der chronischen, anhaltenden Natur der Freisetzung von Aa bei Krankheit5. Eine weitere Kategorie von In-vivo-Modellen sind transgene Tiermodelle, die eine oder mehrere genetische Mutationen im Zusammenhang mit den familiären Variationen der Krankheit 6 , 7 , 8 , 9 , 10. Da jedoch die familiäre AD nur weniger als 5 % aller Alzheimer-Fälleausmacht 11, ist die Relevanz dieser Modelle bei der Übersetzung in sporadische AD beim Menschen fraglich12. Ein weiterer Nachteil des transgenen Ansatzes ist die beschleunigte A-Formation von Geburt an, die sich in Defiziten in der kognitiven Funktion und pathologischen Veränderungen zu schnell und aggressiv niederschlägt, um das Fortschreiten der Krankheit bei sporadischen Ad bei Patienten zu ähneln12 . Zum Beispiel produziert das 5x FAD-Modell Plaques in nur 1,5 Monaten13.
Interessanterweise führen beide Kategorien zu Veränderungen der kognitiven Funktion von Relevanz für ad Forschung2,3,4,5,6, und manchmal werden sie von der Auftreten von pathologischen Kennzeichen der Krankheit wie Amyloid Plaques6,8, Tau Phosphorylation6,7 und/oder synaptischen und neuronalen Verlust7,9, 14. Aber während diese Arten von Modellen uns einen Einblick in die Auswirkungen hoher Amyloidkonzentrationen im Gehirn geben können, die oft mit späteren Stadien von AD in Verbindung gebracht werden, spiegeln sie nicht die früheren Veränderungen wider, die als Reaktion auf die chronische und anhaltende Exposition gegenüber dem A- Peptid12, wie z. B. veränderte Expression von synaptischen Markern15 und Komponenten in der extrazellulären Matrix16. Daher besteht nach wie vor die Notwendigkeit, ein chronisches Modell zu erstellen, das die Auswirkungen einer anhaltenden A-Sekretion auf die In-vivo-Kognition genauer veranschaulicht und Veränderungen in der Pathologie veranschaulicht.
Zu diesem Zweck haben wir ein System entwickelt, das die konstante, nachhaltige Sekretion von Aa in kontrollierter Weise ermöglicht, indem amyloid-sekretionszellen in Hydrogel-Mikroperlen immobilisiert werden, die anschließend innerhalb des erwachsenen Rattengehirns implantiert werden können, um Aspekte zu modellieren. sporadisch AD.
Alginat war das ausgewählte Biomaterial, da es biokompatibel ist und keine unerwünschten Reaktionen induziert, wenn es in vivo17implantiert wird. Die Zellverkapselung in Alginathydrogelen hat sich in den letzten vier Jahrzehnten gut etabliert. Das erste Beispiel für seine Übersetzung in die Klinik wurde für die Behandlung von Typ-1-Diabetes mellitus17berichtet. Der früheste Bericht über die erfolgreiche Verkapselung von Inselchen von Langerhans stammt aus dem Jahr 1980. Die Transplantation von Mikroperlen, die Insulin-Sekretzellen enthalten, revolutionierte die Behandlungsmöglichkeiten für Diabetiker, da sie die Bauchspeicheldrüsenfunktion wiederhergestellt enden, wodurch die Notwendigkeit einer Insulininjektionstherapie entfällt18. Diese Arbeiten berichten darüber, wie die Zellverkapselung sie vor äußeren Belastungen, ob mechanisch oder chemisch, schützen kann. In der Tat, Alginat Perlen wirken als Barriere und isolieren Zellen aus der Umgebung erhaltung ihren Phänotyp, während ausreichend Zugang zu den umgebenden Medien für Nährstoffe und Clearance der zellulären Nebenprodukte19. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von Alginat den Abgleich der mechanischen Eigenschaften von Weichgewebe20. Alginat-Hydrogele können auf eine Steifigkeit von 1-30 kPa abgestimmt werden, indem die Alginatkonzentration und die Vernetzungsdichte20,21einfach variiert werden. Dies ist ein wesentlicher Aspekt, nicht nur um die phänotypische Expression von verkapselten Zellen in vitro zu erhalten, sondern auch um entzündliche Effekte nach der Enpfropftierung in vivo22zu vermeiden.
In diesem Protokoll werden 7PA2-Zellen - eine chinesische Hamster-Ovarialzelllinie, die stabil mit einem menschlichen APP V717F mutierten Gen23 transfiziert wird - verwendet. Diese Zellen produzieren kontinuierlich katalytische Produkte von APP, einschließlich A-1-4224,25, und wurden verwendet, um A a als Alternative zur synthetischen Produktion in präklinischen, akuten in vivo Studien zu erzeugen26. Wir beschreiben eine Herstellungsmethode zur Immobilisierung von 7PA2-Zellen in "weichen" Alginat-Mikroperlen, die die nachhaltige Sekretion von Biomolekülen ermöglichen. Als Proof of Concept berichten wir über die Freisetzung des Peptids A1-42 im Laufe der Zeit. Das verwendete Alginat ist ein niedrigviskoses Alginat mit einem Molekulargewicht von 120.000-190.000 g/mol und einem mannuronischen zu guluronischen Verhältnis von 1,56 (M/G).
In weiteren Studien können diese Mikroperlen sicher innerhalb von Regionen des Rattenhirns transplantiert werden, die für AD relevant sind (z.B. der Hippocampus), um die Auswirkungen der chronischen A-Sekretion auf das Verhalten in vivo und die Pathologie ex vivo zuuntersuchen. Darüber hinaus kann dieses System verwendet werden, um die Auswirkungen der chronischen A-Freisetzung in In-vitro- und Ex-vivo-Anwendungen zu untersuchen. Zum Beispiel können 7PA2-haltige Alginat-Mikroperlen in vitro mit neuronalen oder astrozytischen Kulturen kokultiviert werden, um die Auswirkungen der chronischen A-Exposition auf zelluläre Mechanismen im Zusammenhang mit AD zu bewerten. Darüber hinaus kann diese Methode verwendet werden, um den Zusammenhang zwischen chronischer A-Produktion und Langzeitpotenzierung in der Ex-vivo-Elektrophysiologie zu untersuchen.
Das Highlight dieses Protokolls ist die Modularität und Flexibilität der Fertigungsmethode, die die Herstellung von Alginatperlen mit einer Zieldimension durch Feinabstimmung der Fertigungsparameter ermöglicht. Je nach Anwendung kann das Protokoll angepasst werden, um maßgeschneiderte Ziele in Bezug auf Mikroperlengröße, Dichte der gekapselten Zellen und Mikroperlensteifigkeit zu erhalten. Dieses Protokoll kann für die Verkapselung einer Vielzahl von Zelltypen verwendet werden, wodurch relevantere dreidimensionale (3D) In-vitro-Modelle entwickelt werden, um verschiedene Pathologien zu untersuchen. Wir berichteten vor kurzem darüber, wie Alginat-verkapselte Zellen verwendet werden können, um frühe Stadien der Krebsprogression zu modellieren20.
Das Konzept des Verkapselungsprozesses basiert auf der Extrusion eines laminaren Strahls von Zellen, die in Alginatlösung durch eine Düse schweben. Ein vibrierender Kopf stört den Jet mit einer kontrollierten Frequenz, was zu gleich großen Tröpfchen auf Alginatbasis führt. Ein externes elektrisches Feld ermöglicht die Trennung der gebildeten Alginat-tröpfchen, die bei Kontakt mit einer mit divalenten Ionen angereicherten Lösung, wie z.B. Kalziumionen, schnell miteinander vernetzen können, wobei ihre kugelförmige Form erhalten bleibt. Die Inkubation in der Gelationslösung ermöglicht die Bildung von kugelförmigen Mikroperlen, die Zellen in einem homogenen physikalischen Hydrogelenthalten 27. Die Zielgröße von Mikroperlen und Alginathydrogelen ermöglicht den Nährstoff- und Sauerstoffaustausch mit Zellkulturmedien über einen längeren Zeitraum (Wochen).<s></s> Abbildung 1 Eine zeigen eine schematische Darstellung des verwendeten Verkapselungsapparates (Abbildung 1B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig1.jpg"> Abbildung 1 : Das Verkapselungssystem. (A) Schematische Darstellung des Kapselungssystems. Eine Alginat-Zellsuspension wird in eine Spritze (2) geladen und mit einer Extrusionsgeschwindigkeit an der Spritzenpumpe (1) durch ein Reservoir geleitet. Im Reservoir vibriert ein Vibrationshut (3) bei einer Frequenz, die von einem Wellenformgenerator (4) eingestellt wird, um den Strom in gleichen Intervallen zu stören und gleich große Tröpfchen zu bilden. Da die Lösung durch eine Düse (5) gespeist wird und Tröpfchen gebildet werden, wird ein elektrostatisches Potential über eine Elektrode (7) aufgebracht, die von einem Spannungsgenerator (6) eingestellt wird, der die Oberfläche der Tröpfchen leicht auflädt, so dass sich der Strom infolge der Abstoßung ausbreiten kann. elektrostatischeKräfte. Wenn Tröpfchen mit dem Gelationsbad (8) interagieren, führt die von Ca2+gesteuerte Vernetzung von Alginat zur Bildung von kugelförmigen Mikroperlen. (B) Foto des Verkapselers vor der Herstellung von Alginat-Mikroperlen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die Größe der Mikroperle kann je nach Verwendungszweck verändert werden. Um die Größe der Mikroperle zu kontrollieren, werden die verschiedenen parameter, die in Abbildung 1A und im Protokoll beschrieben sind, entsprechend angepasst. Der Innendurchmesser der verwendeten Düse hat einen erheblichen Einfluss auf die Größe der Tröpfchen; Die weitere Anpassung der Verkapselungsparameter, nämlich Extrusionsgeschwindigkeit, Schwingungsfrequenz und Spannung, ist der Schlüssel zu einer konsistenten Größenverteilung. Tabelle 1 beschreibt, wie die verschiedenen Parameter die Größe von Mikroperlen ändern können, die mit diesem System erreicht werden.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Parameter</td>
			<td>Düsengröße</td>
			<td>Schwingungsfrequenz</td>
			<td>Durchflussrate</td>
			<td>Elektrodenspannung</td>
		</tr>
<tr>
<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
			<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
			<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
			<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
		</tr>
<tr>
<td>Perlengröße</td>
			<td>
<img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg">
</td>
			<td><img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/59597/59597img02.jpg"></td>
			<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
			<td>–</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Herstellungsparameter und deren Einfluss auf die Größe der Mikroperle. Die Tabelle zeigt, wie jeder Parameter die resultierende Größe der hergestellten Mikroperlen beeinflussen kann, unabhängig von der Düse und der Viskosität der verwendeten Lösung.

<table><tbody><tr><td>&Mikro; Manager Software</td><td>Vale Lab, UCSF, USA</td><td>v.1.46</td><td></td></tr><tr><td>0,22 μm PES-Filter</td><td>Merck, UK</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>15mm Netwell-Einsatz 74 μm Maschenfilter</td><td>Constar, USA</td><td>#3477</td><td></td></tr><tr><td>Alginsäure-Natriumsalz aus Braunalgen</td><td>Sigma-Aldrich,uk</td><td>A0682</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich,uk</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter96&nbsp; AQueous One Solution Zellproliferationsassay</td><td>Promega, USA</td><td>G3580</td><td></td></tr><tr><td>Verkapseler</td><td>Inotech</td><td>IE-50</td><td>Serien-Nr. 05.002.01-2005</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich,uk</td><td>H4024</td><td></td></tr><tr><td>Hu A&beta; 1-42 ELISA</td><td>ThermoFisher, UK</td><td>KHB3441</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>ImageJ</td><td>v1.49p</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Lichtmikroskop</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Leica Mikroskop</td><td>Leica Mikrosysteme, UK</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>Neo sCMOS Kamera</td><td>Ander, UK</td><td>5,5</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich,uk</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich,uk</td><td>433209</td><td></td></tr><tr><td>Trispdiumcitrat-Dihydrat</td><td>Sigma-Aldrich,uk</td><td>W302600-K</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich,uk</td><td>T4049</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von amyloid---sekret alginat mikroperlen für den einsatz bei der modellierung der alzheimer-krankheit

Fabrication of Amyloid-&#946;-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

Nach der Amyloid-Kaskadenhypothese ist der früheste Auslöser bei der Entwicklung der Alzheimer-Krankheit (AD) die Anhäufung toxischer Amyloid-Fragmente, die schließlich zu den klassischen Merkmalen der Krankheit führen: Amyloid-Plaques, neurofibrilläre Verwicklungen und synaptische und neuronale Verlust. Der Mangel an relevanten nicht-transgenen präklinischen Modellen, die das Fortschreiten der Krankheit reflektieren, ist einer der Hauptfaktoren, die die Entdeckung wirksamer medikamentöser Behandlungen behindern. Zu diesem Zweck haben wir ein Protokoll für die Herstellung von Alginat-Mikroperlen entwickelt, die Amyloid-Sekretionszellen enthalten, die für die Untersuchung der Auswirkungen der chronischen A-Produktion nützlich sind.
In dieser Studie wurden chinesische Hamster-Ovarialzellen verwendet, die zuvor mit einem menschlichen APP-Gen transfiziert wurden, das A -Zellen (d. h. 7PA2-Zellen) absonderte. Ein dreidimensionales (3D) In-vitro-Modell für die nachhaltige Freisetzung von Aa wurde durch Verkapselung von 7PA2-Zellen in Alginat hergestellt. Das Verfahren wurde optimiert, um einen Perlendurchmesser von 500-600 m für weitere In-vivo-Studien zu erreichen. Die Optimierung der 7PA2-Zellverkapselung in Alginat wurde durchgeführt, um Die Herstellungsparameter zu verändern, z.B. Alginatkonzentration, Geldurchflussrate, elektrostatisches Potential, Kopfvibrationsfrequenz, Gelierlösung. Die Konzentrationen der abgesonderten A a wurden im Laufe der Zeit analysiert und zwischen Alginatperlen und Standard-Zellkulturmethoden (bis zu 96 h) verglichen.
Eine Konzentration von 1,5 x 106 7PA2-Zellen/ml und eine Alginatkonzentration von 2% (w/v) gepuffert mit HEPES und anschließender Gelation in 0,5 M Calciumchlorid für 5 min wurden gefunden, um die stabilsten Mikroperlen herzustellen. Hergestellte Mikroperlen waren 1) von einheitlicher Größe, 2) mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 550 m, 3) mit etwa 100-150 Zellen pro Mikroperle und 4) in der Lage, Aa zu sezernieren.
Zusammenfassend könnte unsere optimierte Methode zur Herstellung stabiler Alginat-Mikroperlen, die Amyloid produzierende 7PA2-Zellen enthalten, die Modellierung wichtiger Aspekte von AD sowohl in vitro als auch in vivo ermöglichen.

7PA2-Zellen werden erfolgreich in Alginat-Mikroperlen verkapselt Nach der Vorbereitung werden mit diesem Protokoll erfolgreich einheitliche und sphärische Alginat-Mikroperlen erzeugt. Die Bilder in Abbildung 2A unten zeigen ein Beispiel dafür, wie das Ändern eines der Parameter (d. h. Spannung) den Fluss und die Streuung des Alginattröpfchenstroms verändert. Abbildung 2 B zeigt ein Beispiel für erhaltene Alginatperlen unmittelbar nach dem Gelationsprozess.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig2.jpg"> Abbildung 2 : Optimierung der Fertigungsmethode. (A) Fotos, die Veränderungen in der Strömungsdispersion zeigen. (B) Hellfeldbild mit alginatsphärischen Mikroperlen unmittelbar nach der Herstellung. (C) Beispiel für Optimierungsschritt: Abstimmung ausgewählter Fertigungsparameter, um die Zielgröße der Mikroperle zu erreichen. Ausgewählte Diagramme zur Veranschaulichung der Beziehung zwischen den einzelnen Parametern und der Größe der resultierenden Mikroperlen (Größenverteilung von mindestens n = 100 Mikroperlen). Beachten Sie, dass der Düseninnendurchmesser, die Viskosität der ausgeworfenen Lösung und die Gelierbedingungen auch die Größe der hergestellten Perlen beeinflussen können. Fehlerleisten stellen S.D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Das beschriebene Protokoll ist flexibel und ermöglicht die Herstellung unterschiedlicher Größen von Alginat-basierten Mikroperlen, die je nach Anwendung unterschiedlich in der Zusammensetzung sind. In Abbildung 2Cberichten wir über den Einfluss von Alginatdurchfluss, Spannung und Frequenz auf die Mikroperlengröße mit einer 2% (w/v) Alginatlösung in HEPES (pH 7.2), die durch eine 300 m Düse extrudiert wird.
Da der Umfang dieser Studie darin bestand, Mikroperlen herzustellen, die in das Rattenhirn eingebettet werden können, haben wir die Fertigungsparameter angepasst, um einen durchschnittlichen Mikroperlendurchmesser im Bereich von 500-600 m zu erhalten. Für Die Qualitätskontrolle wurde die Methode optimiert, um eine minimale Variabilität über die Grundgesamtheit der hergestellten Perlen zu haben (d. h. eine geringe Größenverteilung). Bitte beachten Sie, dass (1) produzierte Perlen in das Rattenhirn mit einer Hamilton-Spritze mit einer 20G-Nadel injiziert werden können; und (2) eine Hemisphäre des Rattenhirns kann bis zu zwei oder drei Perlen dieser Größe beherbergen.
Nach der Optimierung ergab die Verkapselung von 7PA2-Zellen in einer Konzentration von 1,5 x 106 Zellen/ml, die in einer 2% (w/v) Alginatlösung mit HEPES gepuffert und in einem 0,5 M Calciumchlorid-Gelationsbad abgelegt wurden, die gewünschten Mikroperlen. Abbildung 3 Eine unten zeigt gekapselte 7PA2-Zellen gleichmäßig in Mikroperlen nach einem Tag in Standard-ZellkulturBedingungen verteilt. Die 7PA2-Zellproliferation wurde mit einem MTS-Assay gemäß Herstellerprotokoll getestet. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen dem Verhalten von 7PA2-Zellen, die mit oder ohne Alginat über einen Zeitraum von sieben Tagen angebaut wurden (Abbildung 3B). Bei der Inkubation von gekapselten Zellen unter Standardkulturbedingungen wird erwartet, dass sich die Zellen während der Dauer des Experiments weiter ausbreiten, und es ist daher mit kleinen Graden des Zellaustritts zu rechnen, wie in anderen Werken berichtet28. Die Auswirkungen können dadurch gemildert werden, dass sie bei einer geringeren Zelldichte verkapselt werden oder die Serumkonzentration, in der Mikroperlen inkubiert werden, reduziert werden.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig3.jpg"> Abbildung 3 : Gekapselte 7PA2-Zellen. (A) Hellfeldbild von gekapselten 7PA2-Zellen, die eine gleichmäßige Zellverteilung in der Alginat-Mikroperle zeigen. Fertigungsparameter wurden so eingestellt, dass 150 7PA2-Zellen pro Perle erhalten werden. Über 7 Tage Kultur wurden keine signifikanten Unterschiede bei Alginatperlen beobachtet. (B) Es gab keinen beobachteten Unterschied zwischen der Gesamtproliferation von 7PA2-Zellen, die mit Alginat inkubiert wurden, im Vergleich zu Zellen, die ohne Alginat inkubiert wurden. 7PA2-Zellen wachsen und wandern über das Volumen der Alginatperlen; Verringerung der Serumkonzentration kann als Verlangsamung des Zellwachstums angesehen werden. Fehlerleisten stellen S.D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Alginat-Mikroperlen, die 7PA2-Zellen verkapseln, sind im Laufe der Zeit stabil Um die Größe und Form der erhaltenen Alginat-Mikroperlen zu untersuchen, wurde nach der Herstellung und Gelation eine Mikroskopanalyse durchgeführt. Der durchschnittliche Durchmesser für die Mikroperlen, die mit dem ausgewählten Protokoll erhalten wurden, beträgt 550 x 2 m.
Theoretisch kann die Anzahl der Zellen, die in einer Mikroperle mit einem Durchmesser von 550 m erwartet werden, wie folgt berechnet werden:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597eq1.jpg">
wobei V = Volumen und r = Radius. Das Volumen einer einzelnen Mikroperle ist V = 8,8 x 10-5 ml; daher die Anzahl der Zellen pro Mikroperle zum Zeitpunkt der Verkapselung = (1,5 x 106) x (8,8 x 10-5) bei 130 Zellen.
Experimentell haben wir die Anzahl der gekapselten Zellen unmittelbar nach der Herstellung gezählt. Alginatperlen wurden mit dem Auflösungsmix sanft gestört und Zellen mit Trypanblaulösung gefärbt. Die Lebensfähigkeitsschätzung und -zählung der Zellen wurde mit einem Hämozytometer durchgeführt; Die erzielten Ergebnisse zeigten durchschnittlich 116 x 17 lebende Zellen pro Mikroperle (n = 5, Daten nicht gemeldet). Wie erwartet wurde unmittelbar nach der Verkapselung ein geringer Unterschied zwischen theoretischer und experimenteller Zellzahl beobachtet. Für einige Anwendungen, und insbesondere um die Menge der freigegebenen A a im Laufe der Zeit zu bestimmen, ist es wichtig, die Anzahl der Zellen in jeder Alginat-Perle gekapselt vorherzusagen.
Interessanterweise hat der Verkapselungsprozess keinen signifikanten Einfluss auf die Zelllebensfähigkeit. Ergebnisse werden in einer früheren Arbeit berichtet, in der Darmkrebszellen (d. h. HCT-116) mit einer ähnlichen Methode gekapselt wurden, ohne Unterschiede in der Zelllebensfähigkeit in Alginat-Mikroperlen im Vergleich zu 2D-Kontrollen20.
Um die Stabilität des bei der Verkapselung verwendeten Alginats zu messen, haben wir Mikroperlendurchmesser über einen Zeitraum von 14 Tagen (n = 100) gemessen. Es wurden 14 Tage nach der Verkapselung keine Veränderungen des durchschnittlichen Durchmessers im Vergleich zu unmittelbar nach der Verkapselung beobachtet (Daten wurden nicht gemeldet).
Gekapselte 7PA2-Zellen geben im Laufe der Zeit A- frei Konditionierte Medien, die aus 2D- und 3D-Kulturen von 7PA2-Zellen analysiert werden, zeigen einen konstanten Anstieg derA-1-42-Spiegel. Zellkulturmedien wurden alle 24 Stunden und bis zu vier Tage abgetastet und mit ELISA analysiert. Unsere Daten zeigen, dass die Freisetzungsrate von A1-42 aus Mikroperlen (3D) im Profil der aus der 2D-Kultur freigesetzten rate ist (Abbildung 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig4.jpg"> Abbildung 4 : Rate derA-1-42-Sekretion aus 7PA2-Zellen. (A) Die A-Freisetzung (% normalisiert nach 4 Tagen) aus 2D- und 3D-In-vitro-Modellen hat ein ähnliches Profil. Beide Modelle weisen über den Zeitraum von vier Tagen einen konstanten Anstieg des A-Niveaus auf, und wie erwartet wird eine stetige Konzentration nicht erreicht. (B) Die Konzentration von A1-42 normalisierte sich auf die Anfangszellzahl und zeigte eine ähnliche Sekretion von A1-42 im Laufe der Zeit, unabhängig von den Kultivierungsmethoden. Weder das Vorhandensein von Alginat noch der Prozess der Verkapselung (3D-In-vitro-Modell) verändern die Sekretion von A1-42. Fehlerleisten stellen S.D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Mögliche Anwendung von gekapselten 7PA2-Zellen Wir berichten, dass 7PA2-Zellen, die in Alginat-Mikroperlen eingekapselt sind, effektiv für die nachhaltige Freisetzung von A1-42verwendet werden können und daher verwendet werden, um die Wirkung der chronischen A-Sekretion in jedem präklinischen Modell zu testen. In Abbildung 5 unten zeigen wir die Vorteile der Verwendung von Alginat-Mikroperlen, die leicht injiziert werden können und sich im Gehirn einer Ratte befinden. Ex-vivo-Abschnitte werden hier zu Illustrationszwecken verwendet, indem eine Millimeter-Alginatperle mit hergestellten Alginat-Mikroperlen verglichen wird.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig5.jpg"> Abbildung 5 : Verwendung von Mikroperlen für relevante präklinische Anwendungen. Mikroperlen für die Transplantation in das Rattenhirn müssen klein genug sein, um eingebettet zu werden, ohne eine Läsion zu groß zu erzeugen, um Schäden am Bauchdeschym des Gehirns zu vermeiden und die normale Gehirnfunktion zu beeinträchtigen. Bild (A) zeigt einen Größenvergleich zwischen einer millimetergroßen Perle und einer Mikrometer-Skala nebeneinander. (B) Das Implantieren einer millimetergroßen Perle im Gehirn für In-vivo-Zwecke würde nicht funktionieren. Bild (C) zeigt eine Mikroperle, die mit diesem Protokoll hergestellt wurde. Die Größe eignet sich zum Einsetzen in den Hippocampus der Ratte, ohne eine nachteilige Wirkung auf die normale Physiologie zu haben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die obigen Bilder unterstreichen die Bedeutung der Kontrolle der Größe der Mikroperle für solche Studien. Hier zeigen wir den Vorteil der Verwendung von Mikroperlen mit Durchmessern unter 600 m. Dies ermöglicht die Verwendung von minimal-invasiver Injektion (z. B. Hamilton-Spritze), um die Position der injizierten Perlen im Gehirn besser zu kontrollieren.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Verkapselung von 7PA2-Zellen die Kontrolle über die Größe von Mikroperlen, die Anzahl der gekapselten Zellen und die Vorhersage von Aa gibt, das von den Mikroperlen abgesondert wird (z. B. Konzentration, Freisetzungsprofil). Die Kontrolle der Größe der Mikroperlen ist aus zwei Gründen unerlässlich: 1) eine fein abgestimmte Kontrolle über die Konzentration des freigesetzten A- zu ermöglichen, und 2) um eine Implantation in einem kontrollierten Bereich des Rattengehirns zu ermöglichen. Die hier erzielten Ergebnisse beschreiben die einfache Abstimmung von Alginat-Mikroperlen und zeigen mögliche Anwendungen für weitere Studien auf.

Dieses Protokoll veranschaulicht eine Zellverkapselungsmethode durch schnelle physikalische Gelation von Alginat zur Immobilisierung von Zellen. Erhaltene Mikroperlen ermöglichen eine kontrollierte und nachhaltige Sekretion von Amyloid-B im Laufe der Zeit und können verwendet werden, um die Auswirkungen von abgesonderten Amyloid----Modellen in in vitro und in vivo zu untersuchen.

Herstellung von Amyloid---Sekret alginat Mikroperlen für den Einsatz bei der Modellierung der Alzheimer-Krankheit

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic ...

Dieses Protokoll erklärt die Herstellung von Mikroperlen, die verwendet werden, um die Freisetzungsrate und die Menge an Amyloid zu kontrollieren, die ein Protein von Interesse ist. Die Mikroperlen werden Zellen in einem geeigneten Biomaterial immobilisieren und sie vor ihrer Umgebung schützen und ihnen ermöglichen, Nebenprodukte und Nährstoffe mit ihrer Umgebung auszutauschen. Das Verkapseln von Zellen mit dieser Technik gewährleistet eine enge Kontrolle der Mikroperlengröße sowie der Zellzahl, und wir tun dies, indem wir verschiedene Fertigungsparameter anpassen.Die Verkapselung der in diesem Protokoll beschriebenen Zellen wird uns also mehr eine chronische Freisetzung von Amyloid geben, die sowohl in vitro als auch in vivo-Systemen verwendet werden kann, und die Idee wäre, dass dies uns ein besseres Verständnis der Mechanismen von Krankheiten geben und uns auch erlauben würde, neue Behandlungen zu testen. Diese Methode kann verwendet werden, um kontrolliertes System zu formulieren und die Freisetzung von Biomolekülen für viele Zelltypen zu untersuchen, ob allein oder in Kombination. Entfernen Sie zunächst einen nahezu konfluenten Kolben aus dem Inkubator.Behandeln Sie die Zellen mit 0,25%Trypsin-EDTA-Lösung und inkubieren Sie bei 37 C fünf bis zehn Minuten, um die Zellen zu lösen. Nach dem Hinzufügen von DMEM/F12 Medium, sammeln Sie die Zellen in einem 50 Milliliter Rohr. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1000 U/min für fünf Minuten.Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in HEPES gepufferter Saline wieder auf, um die endgültige gewünschte Zellkonzentration zu verdoppeln. Mischen Sie diese Zellsuspension in einem 50-Milliliter-Zentrifugenrohr in einem Verhältnis von 1 zu Eins mit 4%Gewichts- und Volumenalginatlösung, um eine endliche Suspension zu erhalten, die die gewünschte Zellkonzentration in einer 2%-Gewichts- und Volumenalginatlösung enthält. Um die Kapselungsparameter festzulegen, legen Sie die Geschwindigkeit der Verkapselungsmaschine auf die maximale Extrusionsgeschwindigkeit fest, und legen Sie dann die Spannung und die Frequenz fest.Um die Mikroperlen herzustellen, in einer 20-Milliliter-Spritze fünf Milliliter der Zellalginatsuspension zu laden und eine Spritze am Verkapseler zu befestigen. Um den Verkapselungskörper zu starten, aktivieren Sie den Fluss, der die Zellalginatsuspension durch den Feeder drückt, und ein Strom von Tröpfchen wird durch die Düse extrudiert. Sammeln Sie den ersten Milliliter im Abfallbecher, um den anfänglichen ungleichmäßigen Strom zu vermeiden.Dann fahren Sie weiter die restlichen vier Milliliter, so dass die Tröpfchen in das Calciumchlorid-Gelationsbad fallen. Bei Kontakt mit dem Gelationsbad kreuzt das Alginat in den Tröpfchen sofort mit den Kalziumionen im Gelationsbad und bildet sphärische Mikroperlen. Nach einer Minute entfernen Sie das Gelationsbecherglas von der magnetischen Plattform und lassen Sie die Mikroperlen für weitere vier Minuten ohne Rührung ruhen, um ihre Gelation bei Raumtemperatur abzuschließen.Um die Mikroperlen abzurufen, verwenden Sie zuerst eine sterile Pinzette, um große Alginat-Trümmer oder Artefakte zu entfernen. Nachdem Sie das Ende einer Kunststoffpipette geschnitten haben, verwenden Sie sie, um die Mikroperlen aus dem Gelationsbad auf einen 74-Mikrometer-Netzfilter zu übertragen, der über einem Abfallbecher gehalten wird. Um den Erfolg zu gewährleisten, schneiden wir immer das Ende einer Kunststoffpipette, um die Mikroperlen nicht zu beschädigen, und wir tun dies jedes Mal, wenn wir Perlen nach der Verkapselung von einem Gefäß auf ein anderes übertragen.Invertieren Sie den Netzfilter über ein Zentrifugenrohr. Pipette das entsprechende Kulturmedium darüber, um die Perlen in die Röhre zu waschen und sie in diesem Medium für fünf Minuten aushalten lassen. Dann übertragen Sie sie in einen Kolben, der zuvor mit dem entsprechenden Medium für die Inkubation und weitere Experimente gefüllt war.Um die Zelllebensfähigkeit nach Verkapselung und Kultur zu bewerten, fügen Sie Auflösungsmischung hinzu, um die Mikroperlen sanft zu stören und die gekapselten Zellen freizusetzen. Inkubieren Sie die Zellen in einem Zellkultur-Inkubator, ergänzt mit 5% Kohlendioxid bei 37 C für 10 Minuten mit sanfter Rührung. Schätzen Sie die Zelllebensfähigkeit dieser Zellen, indem Sie sie mit Trypanblau beflecken und eine Hämozytometerkammer verwenden.Um die Stabilität von Mikroperlen zu bewerten, messen Sie den durchschnittlichen Durchmesser für eine Probe aus jeder Mikroperlenpopulation über einen Zeitverlauf mit einem Mikroskop und einer Bildgebungssoftware. Nach der Vorbereitung wurden mit diesem Protokoll erfolgreich einheitliche und sphärische Alginat-Mikroperlen erzeugt. Nach einem Tag in Standard-Zellkulturbedingungen wurden gekapselte 7PA2-Zellen gleichmäßig in Mikroperlen verteilt.Als die 7PA2-Zellproliferation mit einem MTS-Assay getestet wurde, gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen dem Verhalten von 7PA2-Zellen, die mit oder ohne Alginat über einen Zeitraum von sieben Tagen angebaut wurden. Konditionierte Medien, die aus 2D- und 3D-Kulturen von 7PA2-Zellen analysiert wurden, zeigten einen konstanten Anstieg der Amyloid-Beta-Spiegel 1-42 in beiden Kulturen. Die Freisetzungsrate von Amyloid-Beta 1-42 aus Mikroperlen oder 3D-Kultur ist im Profil ähnlich wie die, die aus der 2D-Kultur freigesetzt wird.7PA2-Zellen, die in Alginat-Mikroperlen eingekapselt sind, können effektiv für die nachhaltige Freisetzung von Amyloid-Beta verwendet werden. Mikroperlen für die Transplantation in das Rattenhirn müssen klein genug sein, um eingebettet zu werden, ohne eine große Läsion zu erzeugen. Eine millimetergroße Perle im Gehirn für In-vivo-Zwecke würde nicht funktionieren, während eine Mit diesem Protokoll hergestellte Mikroperle eine geeignete Größe für die Einfügung in den Hippocampus der Ratte aufweist.Um sicherzustellen, dass wir eine gleichmäßige Verteilung der Zellen im Endprodukt haben, ist es wichtig, die Zellen in der Zellalginatsuspension gründlich zu mischen, und dies garantiert eine gleichmäßige Freisetzung von Amyloid aus jeder Mikroperle.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein Merkmal der Alzheimer-Krankheit ist die Erhöhung der...

Herstellung von oligomeren β-Amyloid 1-42 Und Induktion der synaptischen Plastizität Impairment auf Schnitten des Hippocampus

In den folgenden Abschnitten beschreiben wir Verfahren zur Herstellung von Alginat-Mikrokugeln für den Einsatz in biomedizinischen Anwendungen. Wir illustrieren speziell eine Technik zur Erstellung mehrschichtiger Alginat-Mikrokugeln für den doppelten Zweck der Zell-und Protein-Kapselung als potenzielle Therapie für Typ 1 Diabetes.

Erzeugung von Alginat-Mikrokugeln für biomedizinische Anwendungen

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Etablierung eines Alzheimer-Modells im Gehirn von Zebrafischen durch Amyloid-Peptid-Injektion

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Injektion von Amyloid-Beta-Peptiden, Aluminiumchlorid und einem neuroinflammatorischen Wachstumsfaktor, die zusammen bei der Bildung von toxischen Amyloid-Plaques in der Hippocampus-Region helfen. Dies führt bei der Ratte zu Gedächtnisstörungen, die für die Alzheimer-Krankheit charakteristisch sind.

Etablierung eines Alzheimer-Rattenmodells durch eine Amyloid-Beta-Peptid-Injektion

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Herstellung von Polymer-Mikrokügelchen, die neurotoxische Amyloid-beta-sezernierende Zellen verkapseln. Die Zell-Polymer-Suspension wird durch eine Mikrokügelchen-Herstellungsvorrichtung verarbeitet, wobei die Polymergelierung durch Kalziumvernetzung erreicht wird, wodurch kugelförmige Mikrokügelchen um die Zellen herum gebildet werden. Das Polymer ermöglicht die Zellproliferation und ermöglicht gleichzeitig eine kontrollierte, langfristige...

Herstellung von Amyloid-Beta-freisetzenden Polymer-Mikrokügelchen zur Modellierung der Alzheimer-Krankheit

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die direkte stereotaktische Gehirninfusion von Amyloid-beta. Diese Methodik bietet ein alternatives In-vivo-Mausmodell, um die kurzfristigen Auswirkungen von Amyloid-Beta auf Gehirnneuronen zu untersuchen.

Stereotaktische Infusion von oligomeren Amyloid-beta in die Maus-Hippocampus

Um die Wirkungen von Aβo in vivo zu untersuchen, haben wir ein Modell entwickelt, das auf wiederholten hippokampalen Infusionen von löslichem Aβo in Verbindung mit einer kontinuierlichen Infusion von Aβo-Antikörpern (6E10) im Hippocampus unter Verwendung osmotischer Pumpen basiert, um der neurotoxischen Wirkung von Aβo entgegenzuwirken.

Neurodegenerative Erkrankungen im Tiermodell der chronischen Amyloid-beta-Oligomers Infusion wird durch Antikörper-Behandlung Angereichert mit osmotische Pumpen entgegen gewirkt

Wir entwickelten eine Methode für die quantitative 3D in silico - Modellierung (q3DISM) zerebraler Amyloid-β (Aß) Phagozytose durch mononukleäre Phagozyten in Nagetiermodellen der Alzheimer-Krankheit. Dieses Verfahren kann für die Quantifizierung von praktisch jedem phagozytischen Ereignis in vivo verallgemeinert werden.

Quantitative 3D In Silico Modellierung (q3DISM) zerebraler Amyloid-beta Phagozytose in Nagetiermodellen der Alzheimer-Krankheit

Dies ist ein Protokoll zur Alzheimer-Krankheit bei Ratten durch Bewertung der Beeinträchtigung des räumlichen Gedächtnisses, neuronale pathologischen Veränderungen, neuronale Amyloid Beta Protein (Aβ) Belastung zu imitieren, und kombiniert neurofibrillären Verschlingungen Aggregation, induziert durch die Injektion von Aβ25-35 mit Aluminium Bortrichlorid und rekombinante menschliche Umwandlung Wachstumsfaktor-β1.

Etablierung einer wertvollen Nachahmung der Alzheimer-Krankheit im Rattentiermodell durch intrazerebroventrikuläre Injektion von kompositiertem Amyloid-Beta-Protein

Dieses Protokoll beschreibt, wie Aβ Oligomere aus einem synthetischen Peptid in Vitro vorzubereiten und relative Mengen der Aβ Oligomer durch eine Dot-Blot-Analyse zu bewerten.

A11-positiver β-Amyloid Oligomer Vorbereitung und Bewertung mit Dot-Blot-Analyse

Hier beschreiben wir ein Hefesystem, das die humane γ-Sekretase rekonstituiert. Dieses System ermöglicht die Identifizierung und Untersuchung von Mutationen, die die Aktivität beeinflussen, sowie das Screening von γ-Sekretase-Inhibitoren (GSIs). Unter Ausnutzung des Verlusts der Funktionseigenschaften familiärer Alzheimer-Mutanten ist es möglich, nach γ-Sekretase-Modulatoren (GSMs) zu suchen.

Saccharomyces cerevisiae Modelle der Alzheimer-Krankheit zum Screening von Genen, Mutationen und Chemikalien, die die Amyloid-Beta-Produktion durch γ-Sekretase beeinflussen

Erfahren Sie die Herstellung von Alginat-Mikroperlen zur Zellkapselung für die kontrollierte Freisetzung von Amyloid-β. Diese Methode ermöglicht langfristige Freisetzungsprofile für neurodegenerative Forschung.

Herstellung von Amyloid---Sekret alginat Mikroperlen für den Einsatz bei der Modellierung der Alzheimer-Krankheit

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