Name: Verwenden von CRISPR/Cas9 zum Knock Out von GM-CSF in CAR-T-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Lernen Sie die CRISPR/Cas9-gestützte Genmodifikation von CAR-T-Zellen während der Herstellung zur Verbesserung der Wirksamkeit und Reduktion der Toxizität. Diese Methode ermöglicht effiziente genetische Manipulation in einem Schritt.

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Diese Arbeit wurde durch Stipendien von K12CA090628 (SSK), dem National Comprehensive Cancer Network (SSK), dem Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK), der Predolin Foundation (SSK), dem Mayo Clinic Office of Translation to Practice (SSK) und das Mayo Clinic Medical Scientist Training Program Robert L. Howell Physician-Scientist Scholarship (RMS).

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des Institutional Review Board (IRB) und des Institutional Biosafety Committee (IBC) der Mayo Clinic.
1. CART19 Zellproduktion
<ol><li>T-Zell-Isolierung, Stimulation und Ex-Vivo-Kultur<ol>
<li>Führen Sie alle Zellkulturarbeiten in einer Zellkulturhaube mit entsprechender persönlicher Schutzausrüstung durch. Ernte peripherer mononukleischer Blutzellen (PBMCs) aus nicht identifizierten normalen Spenderblutkegeln, die während der Apherese gesammelt wurden, da diese bekanntermaßen eine lebensfähige Quelle von PBMCs sind.13
</li>
		<li>Um PBMCs zu isolieren, fügen Sie 15 ml eines Dichtegradientenmediums zu einem 50 ml Dichtegradiententrennrohr hinzu. Verdünnen Sie das Spenderblut mit einem gleichen Volumen an phosphatgepufferter Saline (PBS), die 2% fetales Rinderserum (FBS) enthält, um Zellabfangen zu vermeiden.<ol>
<li>Fügen Sie das verdünnte Spenderblut aus dem Kegel in das Trennrohr, achten Sie darauf, nicht die Schnittstelle zwischen dem Blut und der Dichte Gradient medium stören. Zentrifuge bei 1.200 x g für 10 min bei RT.</li>
			<li>Den Überstand in ein neues 50 ml konisches Dekanat dekantieren, mit PBS + 2% FBS waschen, indem man bis zu 40 ml, Zentrifuge bei 300 x g für 8 min bei RT, Aspirat-Überstand, in 40 ml Puffer wieder aufsetzen und Zellen zählen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Isolieren Sie T-Zellen von PBMCs über ein magnetisches Perlenset mit negativer Auswahl mit einem vollautomatischen Zellabscheider gemäß dem Herstellerprotokoll.</li>
		<li>Um die isolierten T-Zellen zu kultiieren, bereiten Sie T-Zellmedium (TCM) vor, das aus 10% humanem AB-Serum (v/v), 1% Penicillin-Streptomycin-Glutamin (v/v) und serumfreiem hämatopoetischem Zellmedium besteht. Sterilisieren Sie das Medium durch Filterung durch einen 0,45 m sterilen Vakuumfilter und dann mit einem 0,22 m sterilen Vakuumfilter.</li>
		<li>Am Tag 0 (dem Tag der T-Zellstimulation) CD3/CD28-Perlen vor der Stimulation von T-Zellen waschen. Zum Waschen das erforderliche Volumen der Perlen (verwenden Sie genügend CD3/CD28 Perlen für ein Verhältnis von 3:1 Perlen: T-Zellen; beachten Sie, dass die Konzentration der Perlen variabel sein kann) in einem sterilen 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und resuspendieren in 1 ml TCM.</li>
		<li>Mit einem Magneten in Kontakt setzen.</li>
		<li>Nach 1 min, saugen Sie die TCM und resuspend in 1 ml frische TCM, um die Perlen zu waschen.</li>
		<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang für insgesamt drei Wähbe.</li>
		<li>Nach der dritten Wäsche, setzen Sie die Perlen in 1 ml TCM.</li>
		<li>Zählen Sie die T-Zellen.</li>
		<li>Übertragen Sie Perlen in die T-Zellen im Verhältnis 3:1-Perlen:Zellen.</li>
		<li>Verdünnung der Zellen bis zu einer Endkonzentration von 1 x 106 Zellen/ml.</li>
		<li>Bei 37 °C inkubieren, 5% CO2 für 24 h.</li>
	</ol></li>
	<li>T-Zell-Transfektion und Transduktion<ol>
<li>Durchführung von lentiviralen Arbeiten mit BSL-2+-Vorkehrungen, einschließlich Zellkulturhauben, persönlicher Schutzausrüstung und Desinfektion von gebrauchten Materialien mit Bleichmittel vor der Entsorgung.</li>
		<li>Erwerben Sie ein CART19-Konstrukt in einem lentiviralen Vektor. HINWEIS: Das cart19-Konstrukt, das hier verwendet wird, wurde entworfen und dann mit einem handelsüblichen Hersteller von Proteinsynthese synthetisiert. Das CAR-Konstrukt wurde anschließend unter der Kontrolle eines EF-1-Promotors in ein Lentivirus der dritten Generation geklont. Das Fragment der einzelnen Kette variabler Bereichswird wird vom FMC63-Klon abgeleitet und erkennt menschliche CD19. Das CAR19-Konstrukt verfügt über eine 4-1BB-Kostendomäne der zweiten Generation und CD3-Stimulation (FMC63-41BBz). 12
</li>
		<li>Führen Sie die lentivirale Produktion wie zuvor beschrieben durch. 12<ol>
<li>Kurz gesagt, um Lentivirus zu produzieren, nutzen 293T Zellen, die 70-90% Konfluenz erreicht haben.</li>
			<li>Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur von Transfektionsreagenzien, einschließlich 15 g des lentiviralen Plasmids von Interesse, 18 g eines Gag/Pol/Tat/rev-Verpackungsvektors, 7 g eines VSV-G-Hüllkurvenvektors, 111 Transfektionsreagenz und 9,0 ml des Transfektionsmediums vor Zugabe zu den 293T-Zellen. Dann kulturieren Sie die transfizierten Zellenbei 37 °C, 5% CO2 .</li>
			<li>Ernte, Zentrifuge (900 x g für 10 min), Filter (0,45 m Nylonfilter) und Konzentrat über Standarbeit bei 24 und 48 h durch Ultrazentrifugation bei 13.028 x g für 18 h oder 112.700 x g für 2 h.</li>
			<li>Bei -80 °C für die zukünftige Verwendung einfrieren.</li>
		</ol>
</li>
		<li>An Tag 1 die T-Zellen vorsichtig wieder aufsetzen, um die Rosetten von T-Zellen aufzubrechen, die an Tag 0 mit 1 x 106/ml stimuliert worden waren.</li>
		<li>Unter geeigneten BSL-2+-Vorkehrungen für alle lentiviralen Arbeiten fügen Sie den stimulierten T-Zellen frische oder gefrorene geerntete Viren bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 3,0 hinzu.</li>
	</ol></li>
	<li>CAR-T Zellerweiterung<ol>
<li>Während der Expansionsphase die transduzierten T-Zellen bei 37 °C, 5%CO2weiter inkubieren. Zählen Sie CAR-T-Zellen an den Tagen 3 und 5 und fügen Sie der Kultur frische, vorgewärmte TCM hinzu, um eine CAR-T-Zellkonzentration von 1 x 106/ml aufrechtzuerhalten.</li>
		<li>Entfernen Sie Perlen aus den transduced T-Zellen 6 Tage nach der Stimulation (Tag 6) mit einem Magneten. Ernte, Resuspend und Legen T-Zellen in 50 ml konischen Rohren in einem Magneten für 1 min. Dann sammeln Sie den Überstand (enthält die CAR-T-Zellen), und entsorgen Sie die Perlen.</li>
		<li>Stellen Sie die gesammelten CAR-T-Zellen in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml wieder in Kultur, um die Expansion wieder aufzunehmen.</li>
		<li>Bewerten Sie am 6. Tag die Oberflächenexpression der CAR durch Durchflusszytometrie. HINWEIS: Es können mehrere Methoden verwendet werden, um die Oberflächenexpression von CAR zu erkennen, wie z. B. die Färbung mit einem Ziegenanti-Maus-IgG (H+L) kreuzadsorbierten Sekundärantikörper oder durch Färbung mit einem CD19-spezifischen Peptid, konjugiert mit einem Fluorchrom. Hier nehmen Sie ein Aliquot (ca. 100.000 T-Zellen) aus der Kultur und waschen Sie mit Strömungspuffer, der mit Dulbeccos phosphatgepufferter Salzsäure, 2% fetalem Rinderserum und 1% Natriumazid zubereitet wird. Die Zellen mit dem Anti-CAR-Antikörper beflecken und zweimal waschen. Färben Sie die Zellen mit lebendem/totem Fleck und CD3 monoklonalen Antikörpern (OKT3). Waschen Sie die Zellen, und setzen Sie sie im Strömungspuffer wieder auf. Erwerben Sie auf einem Zytometer, um die Transduktionseffizienz zu bestimmen.</li>
	</ol></li>
	<li>CAR-T-Zell-Kryokonservierung<ol>
<li>Um CAR-T-Zellen 8 Tage nach der Stimulation (Tag 8 der T-Zellexpansion) zu ernten und zu kryoservieren, ernten Sie die Zellen aus der Kultur.</li>
		<li>Spin down für 5 min bei 300 x g.</li>
		<li>Resuspend ieren im Gefriermedium bei 10 Millionen Zellen pro ml pro Durchstechflasche im Gefriermedium, bestehend aus 10% Dimethylsulfoxid und 90% fetalem Rinderserum.</li>
		<li>In einem Gefrierbehälter einfrieren, um eine Abkühlrate von -1 °C/min in einem Gefrierschrank von -80 °C zu erreichen, und dann nach 48 h in flüssigen Stickstoff geben.</li>
		<li>Vor ihrer Verwendung für In-vitro- oder In-vivo-Experimente, tauen CAR-T-Zellen in warmen TCM.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen, um das Dimethylsulfoxid zu verdünnen und zu entfernen und auf eine Konzentration von 2 x 106 Zellen/ml in warmem TCM wieder aufzusetzen. Über Nacht bei 37 °C, 5% CO2ruhen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. GM-CSF k/o CART19 Produktion
<ol><li>Um GM-CSF zu stören, verwenden Sie eine Guide-RNA (gRNA), die auf Exon 3 des humanen GM-CSF (CSF2) abzielt, das über Screening-gRNAs ausgewählt wurde, die zuvor eine hohe Effizienz für das CSF2-Gen haben sollen, das für das menschliche Cytokin GM-CSF kodiert. 14 HINWEIS: Es wurde ein kommerziell synthetisiertes Forschungskonstruum Cas9 der dritten Generation verwendet, das diese gRNA (unter einem U6-Promotor) enthält. Das Konstrukt enthält ein Puromycin-Resistenzgen. Die Sequenz der gRNA ist GACCTGCCTACAGACCCGCC. 12
</li>
	<li>Um Lentivirus zu produzieren, verwenden Sie 293T-Zellen, die 70-90% Konfluenz erreicht haben.</li>
	<li>Erlauben Sie 15 g des lentiviralen Plasmids von Interesse, 18 g eines Knebel-/Pol/Tat/rev-Verpackungsvektors, 7 g eines VSV-G-Hüllkurvenvektors, 111 l des vorkomplexenden Reagenzes, 129 l des Transfektionsreagenzes und 9,0 ml des Transfektionsmediums, um 30 min in Raum te Mperatur.</li>
	<li>Fügen Sie den 293T-Zellen Transfektionsreagenzien hinzu. Dann Kultur bei 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Ernte, Zentrifuge (900 x g für 10 min), Filter (0,45 m Nylonfilter) und Konzentratüberstand bei 24 und 48 h durch Ultrazentrifugation bei 13.028 x g für 18 h oder 112.700 x g für 2 h und Einfrieren bei -80 °C für den späteren Einsatz.</li>
	<li>An Tag 1 die T-Zellen vorsichtig wieder aussetzen, um Rosetten aufzubrechen.</li>
	<li>In einem Von BSL-2+ zugelassenen Labor fügen Sie den stimulierten T-Zellen gefroreneoder oder frisch geerntete Viren hinzu, um CAR-T-Zellen zu erzeugen. Transduce T-Zellen mit dem CAR19 Lentivirus und GM-CSF, die auf das CRISPR-Lentivirus abzielen. Car19 lentivirus bei einem MOI von 3 hinzufügen. Da die Titration des CRISPR-Lentivirus nicht möglich war, verwenden Sie Viruspartikel, die aus einem 15-ug-Plasmidpräparat erzeugt wurden, um 10 x 106 T-Zellen zu transducieren.</li>
	<li>Sehen Sie sich die verbleibenden Schritte der T-Zellstimulation, -Dehnung und -Kryokonservierung an, wie in Schritt 1 erläutert.
</li>
	<li>Für lentiCRISPR-bearbeitete T-Zellen mit Puromycinresistenz, behandeln Sie Zellen mit Puromycin-Dihydrochlorid in einer Konzentration von 1 g Puromycin pro 1 ml an Tag 3 und Tag 5 .</li>
</ol>3. GM-CSF Störungeffizienz und funktionelle Bewertung von GM-CSF k/o CART19
<ol><li>GM-CSF Disruption Efficiency: Tracking von Indels durch Zersetzung (TIDE) Sequenzierung und Analyse<ol>
<li>Um das Interesse am GEN-CSF-Gen zu sequenzieren, verwenden Sie die folgenden Primer. Verwenden Sie eine Vorwärtsprimersequenz für GM-CSF (CSF2) von TGACTACAGAGAGGCACAGA und eine Reverse Primer-Sequenz von TCACCTCTGACCTCATTAACC.</li>
		<li>Extrahieren Sie DNA aus bis zu 5 Millionen CAR-T-Zellen mit einem genomischen Extraktionskit. Für die PCR-Reaktion verwenden Sie 25 L eines Taq-Mastermix pro Reaktion mit einer Endkonzentration jedes Primers in der PCR-Reaktion von M, 0,1-0,5 g Vorlagen-DNA und einem Gesamtvolumen der PCR-Reaktion, die bis zu 50 l mit nukleasefreiem Wasser erreicht wird.</li>
		<li>Siehe die in Tabelle 1beschriebenen PCR-Zyklusbedingungen .</li>
		<li>Führen Sie PCR-Proben auf einem 1-2% Agarose-Gel bei 100 V für 30 min und extrahieren Sie mit einem Gel-Extraktions-Kit.</li>
		<li>Sequenz PCR-Amplicons. Berechnen Sie die Häufigkeit der Allelmodifikation, indem Sie Rohdaten in eine entsprechende TIDE-Software hochladen. 15
</li>
	</ol>
</li>
	<li>GM-CSF Produktion und funktionelle Bewertung von GM-CSFk/o CART19<ol>
<li>Zur Bestimmung der Zytokinproduktion von CAR-T-Zellen, inkubieren Wildtyp CART19 Zellen und GM-CSFk/o CART19 mit dem CD19 exemitenkt akute lymphatolastische Leukämie-Zelllinie NALM6 im Verhältnis 1:5 für 4 h bei 37 °C, 5%CO2 in Gegenwart von Monensin Anti-Human CD49d, Anti-Human CD28 und Anti-Human CD107a.</li>
		<li>Ernten Sie Zellen aus der Kultur für Diedurchflusszytometrie. Waschen Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometriepuffer. Färben Sie die Zellen mit einem lebenden/toten Färbeset. Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 15 min. Fixieren Sie die Zellen mit einem Fixierungsmedium und inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 15 min.</li>
		<li>Nach dem Waschen die Zellen intrazellulär mit Permeabilisationsmedium in Kombination mit antihumanem, monoklonalen IFN-Antikörper, antihumanem GM-CSF, antihumanem MIP-1, Anti-Human IL-2 und Anti-Human-CD3 färben und im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 min. Waschen und setzen Sie die Proben wieder aus. Erfassen Sie Proben auf einem Durchflusszytometer und analysiert auf den Prozentsatz der intrazellulären GM-CSF-Expression.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+to+target+hematologic+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies.</a> Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).</li>
<li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li>
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<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+Children+and+Young+Adults+with+B-Cell+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li>
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<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
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<li>Gust, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Activation+and+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+Neurotoxicity+after+Adoptive+Immunotherapy+with+CD19+CAR-T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).</li>
<li>Fitzgerald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+Release+Syndrome+After+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cell+Therapy+for+Acute+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).</li>
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<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168(2014).</li>
</ol>

SSK ist ein Erfinder auf dem Gebiet der CAR T-Zell-Therapie, die an Novartis lizenziert sind (im Rahmen einer Vereinbarung zwischen Mayo Clinic, University of Pennsylvania und Novartis). Diese Studien wurden zum Teil durch ein Stipendium von Humanigen (SSK) finanziert. RMS, MJC, RS und SSK sind Erfinder von Patenten im Zusammenhang mit dieser Arbeit. Das Labor (SSK) wird von Tolero, Humanigen, Kite, Lentigen, Morphosys und Actinium gefördert.

In diesem Bericht beschreiben wir eine Methodik zur Nutzung der CRISPR/Cas9-Technologie, um sekundäre Modifikationen in CAR-T-Zellen zu induzieren. Insbesondere wird dies mit hilfe einer lentiviralen Transduktion mit einem viralen Vektor demonstriert, der gRNA enthält, die auf das Gen von Interesse und Cas9 zur Erzeugung von GM-CSFk/o CART19-Zellen abzielt. Wir hatten zuvor gezeigt, dass die GM-CSF-Neutralisation CRS und NT in einem Xenograft-Modell verbessert. 12 Wie bereits beschriebe...

Chimäre Antigenrezeptor T (CAR-T) Zelltherapie zeigt großes Versprechen in der Behandlung von Krebs. 1 , 2 Zwei CAR-T-Zelltherapien, die auf CD19 (CART19) abzielen, wurden kürzlich in den Vereinigten Staaten und in Europa für die Anwendung bei B-Zell-Malignitäten zugelassen, nachdem sie auffällige Ergebnisse in multizentrischen klinischen Studien nachgewiesen hatten. 3 , 4 , 5 Hindernisse für eine breitere Nutzung von CAR-T-Zellen sind begrenzte Aktivität bei soliden Tumoren und damit verbundenen Toxizitäten wie Zytokin-Freisetzungssyndrom (CRS) und Neurotoxizität (NT). 3 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 Um den therapeutischen Index der CAR-T-Zelltherapie zu verbessern, werden Genom-Engineering-Tools wie Zinkfingernukleasen, TALENs und CRISPR eingesetzt, um CAR-T-Zellen weiter zu modifizieren, um weniger toxische oder effektivere CAR-T-Zellen zu erzeugen. 10 , 11
In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zum Generieren von CRISPR/Cas9-bearbeiteten CAR-T-Zellen. Das spezifische Ziel dieser Methode ist es, CAR-T-Zellen während der HERSTELLUNG von CAR-T-Zellen über CRISPR/Cas9 genetisch zu modifizieren, um weniger toxische oder effektivere CAR-T-Zellen zu erzeugen. Die Gründe für die Entwicklung dieser Methodik basieren auf den Erkenntnissen aus klinischen Erfahrungen mit der CAR-T-Zelltherapie, die auf die dringende Notwendigkeit neuer Strategien hinweisen, um das therapeutische Fenster der CAR-T-Zelltherapie zu erhöhen und die Anwendung auf andere Tumoren und wird durch die jüngsten Fortschritte in der synthetischen Biologie unterstützt, die mehrere Modifikationen von CAR-T-Zellen ermöglichen, die begonnen haben, in die Klinik zu gelangen. Während mehrere Genom-Engineering-Tools entwickelt und in verschiedenen Umgebungen eingesetzt werden, wie Z.B. Zinkfingernukleasen, TALENs und CRISPR, beschreibt unsere Methodik die CRISPR/Cas9-Modifikation von CAR-T-Zellen. 10 , 11 CRISPR/Cas9 ist ein RNA-basierter bakterieller Abwehrmechanismus, der entwickelt wurde, um fremde DNA zu eliminieren. CRISPR stützt sich auf Endonukleasen, um eine Zielsequenz zu spalten, die durch eine Guide-RNA (gRNA) identifiziert wurde. Die CRISPR-Bearbeitung von CAR-T-Zellen bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Genom-Engineering-Tools. Dazu gehören die Genauigkeit der gRNA-Sequenz, die Einfachheit bei der Entwicklung einer gRNA, die auf das Gen von Interesse abzielt, eine hohe Gen-Editing-Effizienz und die Fähigkeit, mehrere Gene anzusprechen, da mehrere gRNAs gleichzeitig verwendet werden können.
Insbesondere in den hier beschriebenen Methoden verwendeten wir eine Lentivirus-Codierung von CRISPR-Guide-RNA und Cas9, um ein Gen während der CAR-Transduktion von T-Zellen zu stören. Bei der Auswahl einer geeigneten Technik zur Bearbeitung von CAR-T-Zellen schlagen wir vor, dass die hier beschriebene Technik ein effizienter Mechanismus zur Erzeugung von CAR-T-Zellen der Forschungsstufe ist, aber da die langfristige Wirkung einer dauerhaften Integration von Cas9 in das Genom unbekannt ist, schlagen diese Methode vor, um den Nachweis der Konzeptforschung Car-T-Zellen zu entwickeln, aber nicht für die Herstellung guter Herstellungspraxis Grade CAR-T-Zellen.
Insbesondere beschreiben wir hier die Erzeugung von Granulozyten-Makrophagen-Makrophagenkolonie stimulierenden Faktor (GM-CSF) Knockout CAR-T-Zellen, die auf menschliche CD19 abzielen. Diese CAR-T-Zellen wurden durch Transduktion mit lentiviralen Partikeln erzeugt, die eine Fürleitungs-RNA spezifisch für GM-CSF (Genname CSF2) und Cas9 kodieren. Wir haben zuvor festgestellt, dass die GM-CSF-Neutralisation CRS und NT in einem Xenograft-Modell verbessert. 12 GM-CSFk/o CAR-T-Zellen ermöglichen die Hemmung von GM-CSF während des Herstellungsprozesses, wodurch die Produktion von GM-CSF effektiv reduziert wird und gleichzeitig die Antitumoraktivität und das Überleben von CAR-T-Zellen in vivo im Vergleich zu Wildtyp-CAR-T-Zellen verbessert werden. 12 Hier bieten wir daher eine Methodik zur Generierung von CRISPR/Cas9-bearbeiteten CAR-T-Zellen.

<table><tbody><tr><td>CD3 Monoklonaler Antikörper (OKT3), PE, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0037-42</td><td></td></tr><tr><td>CD3 Monoklonaler Antikörper (UCHT1), APC, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>17-0038-42</td><td></td></tr><tr><td>Choice Taq Blue Mastermix</td><td>Denville Scientific</td><td>C775Y51</td><td></td></tr><tr><td>CTS (Zelltherapiesysteme) Dynabeads CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX System B4-R2-V2</td><td>Beckman Coulter</td><td>C10343</td><td>Durchflusszytometer</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Millipore</td><td>Sigma D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Gibco</td><td>14190-144&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MPC-S (Magnetpulverkonzentrator)</td><td>Applied Biosystems</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep Magnet</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Humanes T-Zell-Isolationskit&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>17951</td><td>magnetische Beads mit negativer Selektion; 17951RF enthält Spitzen und Puffer</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Millipore Sigma</td><td>F8067</td><td></td></tr><tr><td>FITC Maus Anti-Human CD107a&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>555800</td><td></td></tr><tr><td>Fixierungsmedium (Medium A)</td><td>Invitrogen</td><td>GAS001S100</td><td></td></tr><tr><td>GenCRISPR gRNA Konstrukt: Name: CSF2 CRISPR guide RNA 1; Spezies: Mensch, Vektor: pLentiCRISPR v2; Resistenz: Ampicillin; Kopiennummer: Hoch; Plasmidvorbereitung: Standardauslage: 4 μmu; g (Kostenlos gegen Gebühr)</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td>Sonderanfertigung</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) Kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21235</td><td></td></tr><tr><td>https://tide.nki.nl.</td><td>Desktop Genetics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human AB Serum; männliche Spender; Typ AB; US</td><td>Corning</td><td>35-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>IFN gamma Monoklonaler Antikörper (4S. B3), APC-eFluor 780, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>47-7319-42</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfektionsreagenz</td><td>Invitrogen</td><td>L3000075</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixierbares Aqua Dead Cell Stain Kit, für 405 nm</td><td>Anregung Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07851</td><td></td></tr><tr><td>Monensin-Lösung, 1000X</td><td>BioLegend</td><td>420701</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Mensch CD28 Klon CD28.2</td><td>BD Pharmingen</td><td>559770</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Mensch CD49d Klon 9F10</td><td>BD Pharmingen</td><td>561892</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Mensch MIP-1&beta; PE-Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>560687</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty Gefrierbehälter</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>NALM6, Klon G5&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-3273</td><td>Zelllinie für akute lymphatische Leukämie</td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Promega</td><td>P119C</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Vakuumfiltersysteme, 500 mL, PES-Membran, 0,22 μM, steril</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Sterile Einwegfiltereinheiten mit Schnellfluss, CN-Membran 0,45 μM</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>450-0045</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduziertes Serum Medium (1X), Liquid</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 Maus Anti-Human IL-2</td><td>BD Horizon</td><td>562384</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Glutamin (100X), Liquid</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Permeabilization Medium (Medium B)</td><td>Invitrogen</td><td>GAS002S100</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K182001</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin-Dihydrochlorid</td><td>MP Biomedicals, Inc.</td><td></td><td></td>0210055210</tr><tr><td>QIAquick Gel-Extraktionskit</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-Human GM-CSF BV421</td><td>BD Horizon</td><td>562930</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep-S</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>21000</td><td>Vollautomatischer Zellseparator</td></tr><tr><td>SepMate-50 (IVD)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85450</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid, 5% (w/v)</td><td>Ricca Chemical</td><td>7144.8-16</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Serumfreies hämatopoetisches Zellmedium</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr></tbody></table>

verwenden von crispr/cas9 zum knock out von gm-csf in car-t-zellen

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Chimäre Antigenrezeptor T (CAR-T) Zelltherapie ist eine innovative und potenziell revolutionäre neue Behandlungsoption für Krebs. Allerdings gibt es erhebliche Einschränkungen für seine weit verbreitete Verwendung bei der Behandlung von Krebs. Zu diesen Einschränkungen gehören die Entwicklung einzigartiger Toxizitäten wie Zytokin-Release-Syndrom (CRS) und Neurotoxizität (NT) und begrenzte Expansion, Effektorfunktionen und Anti-Tumor-Aktivität bei soliden Tumoren. Eine Strategie zur Verbesserung der CAR-T-Wirksamkeit und/oder zur Kontrolle der Toxizität von CAR-T-Zellen besteht darin, das Genom der CAR-T-Zellen während der Herstellung von CAR-T-Zellen selbst zu bearbeiten. Hier beschreiben wir die Verwendung von CRISPR/Cas9 Gen-Editing in CAR-T-Zellen mittels Transduktion mit einem lentiviralen Konstrukt, das eine Führungs-RNA zum Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) und Cas9 enthält. Als Beispiel nennen wir CRISPR/Cas9 vermittelten Knockout von GM-CSF. Wir haben gezeigt, dass diese GM-CSFk/o CAR-T-Zellen effektiv weniger GM-CSF produzieren, während sie die kritische T-Zellfunktion beibehalten und zu einer verbesserten Anti-Tumor-Aktivität in vivo im Vergleich zu wilden CAR-T-Zellen führen.

Abbildung 1 zeigt die Reduktion von GM-CSF in GM-CSFk/o CART19-Zellen. Um zu überprüfen, ob das Genom der T-Zellen in Knockout GM-CSF verändert wurde, wurde tide Sequenzierung in den GM-CSFk/o CART19-Zellen verwendet (Abbildung 1A). Car-T-Zelloberflächenfärbung bestätigt, dass die T-Zellen den CAR-Oberflächenrezeptor erfolgreich in vitro exprimieren, indem sie auf lebende CD3+-Zellen gezerstäuben (<strong cl...

Hier stellen wir ein Protokoll zur genetischen Bearbeitung von CAR-T-Zellen über ein CRISPR/Cas9-System vor.

Verwenden von CRISPR/Cas9 zum Knock Out von GM-CSF in CAR-T-Zellen

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Unser Protokoll beschreibt die genetische Veränderung von CAR-T-Zellen während ihrer Herstellung über die CRISPR-Technologie, um effektivere und weniger toxische Produkte zu erzeugen. Ein Vorteil dieser Technik ist, dass CAR-T Zellproduktion und genetische Manipulation in einer Zelle mit guter Effizienz auftreten können. Die MdB-Doktorandin, Michelle Cox, Technologin und Doktorandin, und Reona Sakemura, postdoktorandische Mitarbeiterin aus meinem Labor, demonstrieren das Verfahren.Nach der Isolierung von T-Zellen aus geernteten peripheren mononukleären Blutzellen beginnen Sie, sie zu kultivieren, indem Sie zuerst T-Zell-Medium vorbereiten und es dann sterilisieren, indem Sie es durch einen 0,45 Mikrometer sterilen Vakuumfilter und dann mit einem 0,22 Mikrometer sterilen Vakuumfilter filtern. Am Tag der T-Zell-Stimulation oder Tag Null, vor der Stimulation, waschen CD3/CD28 Perlen, indem Sie das erforderliche Volumen der Perlen in einem sterilen 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr und Resuspending in einem Milliliter TCM. Setzen Sie das Rohr eine Minute lang mit einem Magneten in Kontakt.Dann die TCM ansaugen und in einem Milliliter frischer TCM wieder aufsetzen, um die Perlen wieder zu waschen und insgesamt drei Wäschen zu wiederholen. Und schließlich, resuspend die Perlen in einem Milliliter TCM. Nach dem Zählen der T-Zellen, übertragen Sie die Perlen zu den T-Zellen im Verhältnis von drei zu eins Perlen zu Zellen.Dann verdünnen Sie die Zellen auf eine endige Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter und inkubieren bei 37 Grad Celsius, 5% CO2 für 24 Stunden. Nach dem Erwerb eines CART19-Konstrukts in einem lentiviralen Vektor führen Sie die lentivirale Produktion durch, indem Sie zunächst lentivirales Plasmid, Verpackungsvektor, Hüllkurvenvektor, vorkomplexereagenz, Transfektionsreagenz und Transfektionsmedium bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubieren. Durchführung von lentiviralen Arbeiten mit BSL2+-Vorkehrungen, einschließlich Zellkulturhauben, persönlicher Schutzausrüstung und Desinfektion von gebrauchten Materialien mit Bleichmittel vor der Entsorgung.Nach der Inkubation fügen Sie diese Transfektionsreagenzien zu den 293 T-Zellen hinzu, die 70 bis 90 % Konfluenz erreicht haben, und die transfizierten Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 kulturieren. Nach 24 und 48 Stunden nach der Transfektion, Ernte, Zentrifuge, Filter und Konzentrat virushaltiger Überstand durch Ultrazentrifugation und Einfrieren bei minus 80 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung. Am ersten Tag, sanft resuspendT-Zellen, die mit einer Million Zellen pro Milliliter am Tag Null stimuliert wurden, um die Rosetten der Zellen aufzubrechen.Fügen Sie den simulierten T-Zellen unter geeigneten BSL2+-Vorkehrungen frische oder gefrorene geerntete Viren bei einer Vielzahl von Infektionen von 3,0 hinzu. Die transduzierten T-Zellen bei 37 Grad Celsius, 5% CO2, weiterhin inkubieren. An den Tagen drei und fünf zählen SIE CAR-T-Zellen und fügen Sie der Kultur frische vorgewärmte TCM hinzu, um eine CAR-T-Zellkonzentration von einer Million Zellen pro Milliliter aufrechtzuerhalten.Sechs Tage nach der Simulation entfernen Sie Perlen aus den transduzierten T-Zellen, indem Sie zuerst die Zellen ernten und wieder aussetzen. Übertragen Sie die Zellen in 50 Milliliter konische Röhren und legen Sie die Rohre in einem Magneten für eine Minute. Nach dem Sammeln des CAR-T-zellhaltigen Überstandes und dem Wegwerfen der Perlen, legen Sie die Zellen mit einer Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter in einen Kulturkolben zurück in die Kultur.Verwenden Sie eine Stichprobe von Zellen für die Durchflusszytometrie, um die Oberflächenexpression der CARs zu bewerten. Den Rest inkubieren, um die Expansion wieder aufzunehmen und dann die Zellen an Tag acht zu ernten und zu kryo-konservieren, wie im Manuskript beschrieben. Um den granulozyten Makrophagenkolonie stimulierenden Faktor zu stören, verwenden Sie eine Guide-RNA, wie im Manuskript beschrieben.Transfektionsreagenzien bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubieren. Nach der Inkubation, fügen Sie sie zu den 293 T-Zellen, die 70 bis 90% Konfluenz erreicht haben und Kultur der transfizierten Zellen bei 37 Grad Celsius, 5% CO2, um ein Lentivirus zu produzieren. Nach 24 und 48 Stunden virushaltigen Überstand durch Ultrazentrifugation in 50 Milliliter Ultrazentrifugenröhren ernten und konzentrieren und bei minus 80 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung einfrieren.Dann am ersten Tag, sanft die T-Zellen wieder aussetzen, um Rosetten aufzubrechen. In einem BSL2+zugelassenen Labor, um CAR-T-Zellen zu erzeugen, fügen Sie CAR19 lentivirus und GMCSF-targeting CRISPR lentivirus zu den simulierten T-Zellen hinzu. Am dritten Tag und Tag fünf für erfolgreich transduzierte lentiCRISPR-bearbeitete T-Zellen mit Puromycinresistenz, behandeln Zellen mit Puromycindihydrochlorid in einer Konzentration von einem Mikrogramm Puromycin pro Milliliter.Die Gezeitensequenzierung wurde verwendet, um eine GM-CSF-Reduktion in GM-CSF-Knockout CART19-Zellen mit einer Störeffizienz von ca. 71% Flow-Plots von CAR-T-Zelloberflächenfärbungen zu bestätigen, die auf lebenden CD3-positiven Zellen eingezäutt sind, zeigen, dass sowohl wild-type CART19 als auch GM-CSF knockout CART19 erfolgreich und in ähnlicher Weise den CAR-Oberflächenrezeptor in vitro ausdrücken. Auf der anderen Seite zeigt die intrazelluläre Färbung von GM-CSF durch Durchflusszytometrie, die auch auf lebenden CD3-positiven Zellen eingezäutt ist, eine verminderte Expression von GM-CSF in den Knockout-Zellen im Vergleich zu wildtypisierten CART19-Zellen, die den funktionellen Erfolg des Knockouts bestätigen. Besondere Vorsicht ist bei den Transduktionsschritten dieses Verfahrens geboten, da sie für die Entwicklung genetisch veränderter CAR-T-Zellen am wichtigsten sind.Die beschriebene Methode kann möglicherweise auf eine Vielzahl von Genen angewendet werden, um CAR-T-Zellen über CRISPR/CAS9 zu modifizieren, um ein weniger toxisches und effektiveres Produkt zu erzeugen. Die CRISPR/CAS9-Technologie bietet Strategien, um direkt auf das Genom von CAR-T-Zellen zu zielen, um Lösungen für aktuelle klinische Mängel zu entwickeln.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Das Video beschreibt einen Prozess zur Herstellung genetisch veränderter CAR-T-Zellen durch das CRISPR-Cas9-System. Die Infektion von T-Zellen mit CRISPR- und CAR-Lentiviren führt zu Veränderungen des Zielgens und zur Synthese eines chimären Antigenrezeptors (CAR), was schließlich zur Bildung genetisch veränderter CAR-T-Zellen führt.

Genetisch veränderte CAR-T-Zellen mit einem CRISPR-Cas9-System

Dieses Video zeigt einen Assay zur Durchführung von Gen-Editierung in menschlichen T-Zellen mit der CRISPR-Cas9-Technologie. Eine Mischung aus primären CD4+- und CD8+-T-Zellen wird mit einem CRISPR-Cas9-Ribonukleoprotein-Komplex kombiniert, der auf spezifische Gene für den Knockout abzielt. Bei der Elektroporation leitet die sgRNA Cas9 zur Ziel-DNA-Sequenz und erzeugt so präzise Schnitte. Diese Schnitte werden dann durch den nicht-homologen Endverbindungsmechanismus der Zelle repariert, was zu...

Eine CRISPR-Cas9-Technik zur Gen-Editierung in T-Zellen

Gezielte gen bearbeiten CRISPR/Cas9 hat das Verständnis der biologischen Funktionen der Gene erheblich erleichtert. Hier nutzen wir die CRISPR/Cas9-Methodik zu Modell Calreticulin Mutationen in hämatopoetischen Zellen Zytokin-abhängige um ihre onkogenen Aktivität zu studieren.

Mit CRISPR/Cas9 gen untersuchen die Onkogene Aktivität des mutierten Calreticulin in Cytokine abhängigen hämatopoetischen Zellen bearbeiten

Ein Protokoll für schnelle CRISPR/Cas9-vermittelte gen Störung bei Maus und humane primäre hämatopoetische Zellen wird in diesem Artikel beschrieben. Cas9-SgRNA Ribonucleoproteins sind über Elektroporation mit SgRNAs erzeugt durch in-vitro- Transkription und kommerzielle Cas9 eingeführt. Hohe Wirkungsgrade Bearbeitung werden mit wenig Zeit und finanziellem Aufwand erreicht.

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Konventionelle Verlustfunktion-Studien von Genen mit Knockout-Tiere wurden oft kostspielig und zeitaufwendig. Elektroporation-basierte CRISPR-vermittelte somatische Mutagenese ist ein leistungsfähiges Werkzeug, gen in VivoFunktionen zu verstehen. Hier berichten wir über eine Methode, um Ko-Phänotypen in proliferierenden Zellen des Kleinhirns zu analysieren.

CRISPR-vermittelten Verlust der Funktionsanalyse in zerebelläre Untermodul Zellen mit In Utero Elektroporation-basierte Gentransfer

Hier stellen wir ein Protokoll für die Genbearbeitung in primären menschlichen T-Zellen vor, das die CRISPR Cas-Technologie verwendet, um CAR-T-Zellen zu modifizieren.

Herstellung von humanen CRISPR-engineered CAR-T Zellen

Der Artikel beschreibt ein Protokoll für die Anwendung eines in vitro Modells zur Erschöpfung zur Vervollständigung eines genomweiten CRISPR-Knockout-Screenings in gesunden chimären Antigenrezeptor-T-Zellen von Spendern.

Durchführung eines genomweiten In-vitro-CRISPR-Knockout-Screenings in chimären Antigenrezeptor-T-Zellen

Die THP-1-Zelllinie wird häufig als Modell verwendet, um die Funktionen menschlicher Monozyten/Makrophagen in verschiedenen biologiebezogenen Forschungsbereichen zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für effizientes CRISPR-Cas9-basiertes Engineering und Einzelzell-Klonisolierung, das die Produktion robuster und reproduzierbarer phänotypischer Daten ermöglicht.

Elektroporationsbasierter CRISPR-Cas9-vermittelter Gen-Knockout in THP-1-Zellen und Einzelzell-Klonisolierung

Wir entwickelten ein optimiertes CRISPR-Cas9-Knockout-Screening-Protokoll für primäre CAR-T-Zellen. Durch die Reduzierung der gDNA-Übertragung durch enzymatische Verdauung und sgRNA-Kassettenpulldown minimiert dieser Ansatz PCR-Artefakte und gewährleistet eine genaue SGRNA-Detektion sowie eine robuste Identifikation funktioneller Genziele.

Verbesserung von CRISPR-Cas9-Bildschirmen in CAR-T-Zellen: Eine verfeinerte Methode zur Bibliotheksvorbereitung

Dies ist eine Zeit und Kosten wirtschaftlicheren in-vitro- Protokoll untersucht die Mechanismen der erworbenen Resistenz gegen gezielte therapeutische Wirkstoffe, die eine höchst medizinischer Bedarf im Krebs-Management.

Auf der Suche nach Treiber Wege erworbene Resistenz auf die gezielte Therapie: resistente Subclone Generation und Sensibilität wiederherzustellen, indem Sie Gene Knock-down-

Lernen Sie die CRISPR/Cas9-gestützte Genmodifikation von CAR-T-Zellen während der Herstellung zur Verbesserung der Wirksamkeit und Reduktion der Toxizität. Diese Methode ermöglicht effiziente genetische Manipulation in einem Schritt.

Verwenden von CRISPR/Cas9 zum Knock Out von GM-CSF in CAR-T-Zellen

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