Name: Isolierung und Quantifizierung des Zika-Virus aus mehreren Organen in einer Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Erfahren Sie Isolierung und Quantifizierung von Zika-Virus aus mehreren Mausorganen. Diese Methode ermöglicht mechanistische Einblicke in virale Pathogenese und Immunantwort für Impfstoffentwicklung.

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Dr. Pinto wird durch ein Saatgutstipendium der Saint Louis University School of Medicine und Start-up-Fonds von der Saint Louis University School of Medicine finanziert. Dr. Brien wird durch einen K22AI104794 Early Investigator Award des NIH NIAID sowie ein Saatgutstipendium der Saint Louis University School finanziert. Für alle geförderten Personen spielten die Geldgeber keine Rolle bei der Studiengestaltung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.

<ol><li>Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus%3A+New+Clinical+Syndromes+and+Its+Emergence+in+the+Western+Hemisphere%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).</li>
<li>Simpson, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Infection+in+Man%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Infection in Man.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).</li>
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<li>McCrae, A. W., Kirya, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yellow+fever+and+Zika+virus+epizootics+and+enzootics+in+Uganda%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).</li>
<li>Rodhain, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arbovirus+infections+and+viral+haemorrhagic+fevers+in+Uganda%3A+a+serological+survey+in+Karamoja+district%2C+1984%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).</li>
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<li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor-1+%28IRF-1%29+shapes+both+innate+and+CD8%28%2B%29+T+cell+immune+responses+against+West+Nile+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230(2011).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+temporal+role+of+type+I+interferon+signaling+in+CD8%2B+T+cell+maturation+during+acute+West+Nile+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407(2011).</li>
<li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation%2C+quantification%2C+detection%2C+and+storage+of+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).</li>
<li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+by+immunoglobulin+dual-affinity+retargeting+antibodies+against+dengue+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus.</a> Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).</li>
<li>Messaoudi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chikungunya+virus+infection+results+in+higher+and+persistent+viral+replication+in+aged+rhesus+macaques+due+to+defects+in+anti-viral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343(2013).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hydrogen+peroxide-inactivated+virus+vaccine+elicits+humoral+and+cellular+immunity+and+protects+against+lethal+West+Nile+virus+infection+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice.</a> Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).</li>
<li>Sukupolvi-Petty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+antibodies+against+dengue+virus+type+4+reveals+strain-dependent+epitope+exposure+that+impacts+neutralization+and+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection.</a> Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086(2014).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+New+Therapeutics+Using+a+More+Immunocompetent+Mouse+Model+of+Antibody-Enhanced+Dengue+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection.</a> MBio. 6 (5), (2015).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+Murine+IFIT1+Proteins+Do+Not+Restrict+Infection+of+Negative-Sense+RNA+Viruses+of+the+Orthomyxoviridae%2C+Bunyaviridae%2C+and+Filoviridae+Families%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).</li>
<li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BT+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathog. 14 (9), e1007237(2018).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathog. 10 (4), e1004086(2014).</li>
<li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation%2C+quantification%2C+detection%2C+and+storage+of+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).</li>
<li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BT+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237(2018).</li>
<li>Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lectin+pathway+of+complement+activation+contributes+to+protection+from+West+Nile+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection.</a> Virology. 412 (1), 101-109 (2011).</li>
<li>Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+interferon+controls+West+Nile+virus+infection+and+pathogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten

ZikV-Infektion kann eine neurologische Erkrankung verursachen, daher müssen die aktuellen Tiermodelle, um Pathogenese, Immunantworten und schützende Wirksamkeit von Impfstoffen und antiviralen Medikamenten zu untersuchen, sich auf die Viruskontrolle innerhalb des ZNS konzentrieren. Eine der Herausforderungen bei der Konzentration auf ZNS-Krankheit ist, dass es oft auf Kosten der Untersuchung peripherer Infektionen kommt. Die hier vorgeschlagenen Methoden der Organisolierung konzentrieren sich auf die Notwendigkeit, die Z...

Das Zika-Virus (ZIKV) ist ein Arbovirus, das zur Familie der Flaviviridae gehört und wichtige neuroinvasive menschliche Krankheitserreger wie das Powassan-Virus (POWV), das japanische Enzephalitis-Virus (JEV) und das West-Nil-Virus (WNV)1umfasst. Nach seiner Isolierung und Identifizierung gab es regelmäßig Berichte über humane ZIKV-Infektionen in Afrika und Asien2,3,4,5und Epidemien in Mittel- und Südamerika (überprüft in Referenz6). Jedoch, Es war nicht bis vor kurzem, dass ZIKV gedacht wurde, um schwere Krankheit verursachen7. Jetzt gibt es Tausende von Fällen von neurologischen Erkrankungen und Geburtsfehlern im Zusammenhang mit ZIKV-Infektionen. Das schnelle Aufkommen von ZIKV hat viele Fragen im Zusammenhang mit: Warum gibt es eine Zunahme der Krankheit schwere, was ist die immunologische Reaktion auf ZIKV-Infektion und gibt es virale und / oder Immun vermittelten Pathologien mit der Zunahme der neurologischen Manifestationen und Geburtsfehler. Es gibt jetzt eine Eile, um die mit ZIKV verbundene Erkrankung des zentralbedingten Nervensystems (ZNS) zu verstehen sowie die Notwendigkeit, die Wirksamkeit der antiviralen Medikamente und Impfstoffe gegen ZIKV schnell zu testen. Vor diesem Hintergrund haben wir Methoden zur schnellen Analyse von ZIKV-Tistern sowohl in der Peripherie als auch in der ZNS mit hilfe eines ZIKV-spezifischen Fokusbildungs-Assays (FFA) entwickelt.
Kleintiermodelle sind wichtig für das Verständnis des Krankheitsverlaufs und für die frühzeitige Bewertung von Impfstoffen, Therapeutika und Antiviralen. Wir haben Kleintiermodelle für die Untersuchung von Arbovirus-Erkrankungen etabliert, indem wir verschiedene Mausstämme verwenden, um menschliche Infektionen und Schutz vor viralen Krankheitserregernzumodellieren 8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Mit Diesen früheren Erfahrungen begannen wir, Techniken zur Bewertung des WNV- und Dengue-Virus, eines verwandten Flavivirus zur Beurteilung von ZIKV-Titer in beiden peripheren Organen sowie des CNS21,23, zu modifizieren. 24. Die Vorteile dieser Methoden gegenüber anderen Assays sind: 1) dass sie die Fähigkeit kombinieren, sowohl periphere als auch ZNS-Organe für die Analyse zu ernten; 2) die Methoden sind anpassungsfähig für die Durchflusszytometrie, für Messungen angeborener und adaptiver Immunantworten, zusammen mit viralen Tittern an demselben Tier im selben Organ; 3) die Erntetechnik ist für die histologische Analyse anpassungsfähig; 4) die ZIKV FFA ist eine schnelle Hochdurchsatzmethode für die virale Titeranalyse; und 5) diese Methoden können auf die Beurteilung von Virustorten in den Organen von Tieren angewendet werden, die mit den meisten Krankheitserregern infiziert sind25.

<table><tbody><tr><td>1-Brom-3-chlorpropan (BCP)</td><td>MRC-Gen</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>10 cc Spritze</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BD 309642</td><td></td></tr><tr><td>18 G Nadel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-557-145</td><td></td></tr><tr><td>1 cc TB Spritze</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-823-16H</td><td></td></tr><tr><td>20 cc Spritze</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-561-66</td><td></td></tr><tr><td>24 Rohrkugelmühle</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15 340 163</td><td></td></tr><tr><td>3,2 mm Edelstahlperlen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9084634</td><td></td></tr><tr><td>37 > C Gewebekultur-Inkubator</td><td>Nuair</td><td>5800</td><td></td></tr><tr><td>4G2 Antikörper</td><td>im Haus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 Well flache Bodenplatten</td><td>Midsci</td><td>TP92696</td><td></td></tr><tr><td>96 Well runde Bodenplatten</td><td>Midsci</td><td>TP92697</td><td></td></tr><tr><td>Basix 1,5 mL Eppendorf Röhrchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-682-002</td><td></td></tr><tr><td>Konzentrierte keimtötende</td><td>Bleichklammern</td><td>30966CT</td><td></td></tr><tr><td>CTL S6 Analysator</td><td>CTL</td><td>CTL S6 Universal-Analysator</td><td></td></tr><tr><td>Gebogene Schneideschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium - hohe Glukose Mit 4.500 mg/L Glukose</td><td>MilliporeSigma</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (molekularbiologische Qualität)</td><td>MilliporeSigma</td><td>e7023</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>MilliporeSigma</td><td>F0926-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11036-20</td><td></td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>MilliporeSigma</td><td>537020</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus-HRP-markierter Antikörper</td><td>MilliporeSigma</td><td>8924</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>MilliporeSigma</td><td>H3537-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol (molekularbiologische Qualität)</td><td>MilliporeSigma</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin/Xylazin-Cocktail</td><td>Vergleichende Medizin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>MilliporeSigma</td><td>g7513</td><td></td></tr><tr><td>Magmax RNA Aufreinigungskit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1830</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>MilliporeSigma</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Ependorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>MiniCollect 0,5 mL EDTA-Röhrchen</td><td>Bio-one</td><td>450480</td><td></td></tr><tr><td>O-Ring-Röhrchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21-403-195</td><td></td></tr><tr><td>One step q RT-PCR Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4392938</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific EMS- 15713-S</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>MilliporeSigma</td><td>d8537-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Proline Mehrkanalpipetten</td><td>Sartorius</td><td>72230/72240</td><td></td></tr><tr><td>Proline Einkanalpipetten</td><td>Sartorius</td><td>728230</td><td></td></tr><tr><td>RNAse freies Wasser</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10-977-023</td><td></td></tr><tr><td>RNAzol BD</td><td>MRC Gen</td><td>RB192</td><td></td></tr><tr><td>Schaukelplattform</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-676-333</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Fisher</td><td>MT10040CV</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>MilliporeSigma</td><td>s7900</td><td></td></tr><tr><td>Löffel/Spachtel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10090-17</td><td></td></tr><tr><td>Gerade Schneideschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>MilliporeSigma</td><td>t8787</td><td></td></tr><tr><td>True Blue Substrat</td><td>VWR</td><td>95059-168</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>MilliporeSigma</td><td>T3924-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und quantifizierung des zika-virus aus mehreren organen in einer maus

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

Die vorgestellten Methoden zeigen Laborverfahren zur Isolierung von Organen von mit dem Zika-Virus infizierten Tieren und zur Quantifizierung der Viruslast. Der Zweck des Verfahrens ist es, virale Titter in peripheren und ZNS-Bereichen der Maus zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion oder unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu quantifizieren, um virologische und immunologische Faktoren zu identifizieren, die die Zika-Virusinfektion regulieren. Die gezeigten Organisolationsverfahren ermöglichen sowohl die Fokusbildung der Assay-Quantifizierung als auch die quantitative PCR-Bewertung von viralen Titern. Die schnellen Organisolationstechniken sind für die Erhaltung von Virustiter konzipiert. Die virale Titerquantifizierung durch Fokusbildenden Assay ermöglicht eine schnelle Durchsatzbewertung des Zika-Virus. Der Vorteil des Fokus bildenden Assays ist die Bewertung von infektiösen Viren, die Einschränkung dieses Assays ist das Potenzial für Organtoxizität, die die Nachweisgrenze reduziert. Virale Titer-Bewertung wird mit quantitativer PCR kombiniert, und mit einer rekombinanten RNA-Kopierkontrolle wird die virale Genomkopie-Kopiennummer innerhalb des Organs mit geringer Nachweisgrenze bewertet. Insgesamt bieten diese Techniken eine genaue schnelle Hochdurchsatzmethode für die Analyse von Zika-Virustittern in der Peripherie und ZNS von Zika-Virus infizierten Tieren und können auf die Beurteilung von viralen Tittern in den Organen von Tieren angewendet werden, die mit den meisten Infizierten infiziert sind. Krankheitserreger, einschließlich Dengue-Virus.

Zur Bewertung von ZIKV-Titern mit dem oben beschriebenen Ifnar1-/- wurden Mäuse mit ZIKV (PRVABC59) mittels subkutaner (SC) Injektion in das Fußpad infiziert. Hier ist die Verabreichung von 1 x 105 FFU von ZIKV an 8-12 Wochen alte Ifnar1-/- Mäuse SC nicht tödlich, aber das Virus kann sich sowohl in der Peripherie als auch in der ZNS replizieren. Diese Dosis und Route werden verwendet, um Wirtsreger Immunantworten und Pathogenität zu stud...

Das Ziel des Protokolls ist es, die Techniken zu demonstrieren, die verwendet werden, um Viruserkrankungen zu untersuchen, indem das Zika-Virus von mehreren Organen in einer Maus nach einer Infektion isoliert und quantifiziert wird.

Isolierung und Quantifizierung des Zika-Virus aus mehreren Organen in einer Maus

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

In diesem Video beschreiben wir eine Reihe von Verfahren, die entwickelt wurden, um die Auswirkungen einer Virusinfektion und die daraus resultierende immunologische Reaktion mit einem Murine-Modell der Zika-Infektion zu befragen. Dieses Protokoll ist von Bedeutung, weil es es uns ermöglicht, ein mechanistisches Verständnis von Infektion und Immunität zu entwickeln, indem es das Ausmaß identifiziert, in dem sich ein Virus im ganzen Körper ausgebreitet hat, physische Barrieren überträgt und auf Gewebe zugreift. Diese Techniken ermöglichen ein detailliertes Verständnis der viralen Pathogenese und bieten die Möglichkeit, den Schutzmechanismus durch Impfstoffe oder Therapeutika zu sezieren.Hier zeigen wir diese Methode mit Zika-Virus-Infektion von Mäusen, aber diese Methode kann auf eine Reihe von Virusinfektionen einschließlich anderer Flaviviren wie Dengue-Virus und Alphaviren wie Chikungunya-Virus angewendet werden. Die Ernte der Organe des zentralen Nervensystems kann eine Herausforderung sein, daher ist es wichtig für eine Person, ein kleines Experiment zu planen und bereit zu sein, die Techniken vorher zu üben. Dieses Protokoll ermöglicht die schnelle Zerlegung der viralen Verbreitung in Kleintiermodellen mit der Fähigkeit, experimentelle Daten zu visualisieren, zu erfassen und zu speichern.Es ist wichtig, diese Methode visuell zu demonstrieren, damit der Experimentator verstehen kann, wie man die Organe des zentralen Nervensystems erntet. Es ist auch wichtig, den Grad der Zellkonfluenz und die Intensität der viralen Brennpunkte zu sehen. Verwenden Sie zunächst Zangen, um das Fell der infizierten Maus zu entfernen.Enthaupten Sie den Kopf der Maus mit der Schere, gefolgt von der Entfernung der Arme und Beine. Um das Gehirn zu ernten, verwenden Sie gezackte La Grange Schere, um den Schädel durch das Foramen magnum zu schneiden. Schälen Sie den Schädel mit Zangen ab und schaufeln Sie das Gehirn mit einem Spachtel aus.Mit einer stark abgestumpften Schere entfernen Sie den Knochen, der die Wirbelsäule umgibt, und schneiden Sie dann über den Beckenknochen, um das Wirbelforamen auf Lendenebene freizulegen. Entfernen Sie dann so viel Muskel wie möglich um die Wirbelsäule. Legen Sie vorsichtig die abgeschrägte Spitze der Nadel in das Wirbel-Foramen, um übermäßigen Druck zu vermeiden, um zu verhindern, dass die Nadel den Wirbelkörper übergeht.Halten Sie stark, um Druck auf den Wirbelkörper und die Nadel auszuüben, und drücken Sie den Spritzenkolben, um die Schnur in die Petrischale zu vertreiben. Das Rückenmark sofort in das markierte Rohr geben und zur weiteren Homogenisierung in das Trockeneisbad legen. Zur Homogenisierung einen Milliliter DMEM hinzufügen und die Probe in einem BeadBeater homogenisieren.Nach der Sicherstellung, dass organe homogenisiert werden, Zentrifugen- und Aliquot-Proben auf Eis und lagern Sie in den minus 80 Grad Celsius, bis sie benötigt werden. Am Tag des Testes die homogenisierten Proben aus dem Minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank entfernen und auftauen lassen. Mit den Proben auf Eis, verdünnen Zika-Virus zehnfach in den ersten Brunnen der Verdünnungsplatte und verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um zehnfache serielle Verdünnungen auf der Platte zu tun, jedes Mal die Spitzen zu wechseln.Durch Zugabe von 20 Mikrolitern Probe in 180 Mikroliter Wachstumsmedien, ändern Sie die Pipettenspitzen zwischen jeder Verdünnung. Bereiten Sie die Fokusformplatte vor, indem Sie die Medien aus der vorbereiteten flachen 96-Well-Platte entfernen, die Virozellen abdeckt. Um zu verhindern, dass die Monoschicht austrocknet, fügen Sie sofort 100 Mikroliter der Virusverdünnung zu jedem Brunnen in der Viroplate hinzu.Verwenden Sie den gleichen Satz von Tipps, um von der niedrigsten bis zur höchsten Konzentration hinzuzufügen. Steinplatte Seite an Seite zwei bis vier Mal und inkubieren bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für ein bis zwei Stunden. 2%Methylcellulose auf Raumtemperatur aufwärmen.Anschließend die 2%Methylcellulose-Lösung in Wachstumsmedien im Verhältnis von etwa zwei zu eins verdünnen. Nach der Inkubation 125 Mikroliter der Methylcellulose-Wachstumsmedien in jeden Brunnen der 96-Well-Platten geben. Wieder bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für 32 bis 40 Stunden inkubieren.Um die Virozellen zu fixieren, fügen Sie in einem Biosicherheitsschrank 50 Mikroliter 5%Paraformaldehyd über die Oberseite der Methylcelluloseschicht in jedem Brunnen der 96-Well-Platten hinzu. 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Alternativ können Sie die Platten mit Parafilm bedecken und über Nacht bei vier Grad Celsius platzieren.Danach verwenden Sie eine Pipette, um Überlagerungen und Medien aus Zellen in einen Einwegbehälter im Biosicherheitsschrank zu entfernen. Mit 150 Mikroliter PBS pro Brunnen vorsichtig waschen. Entfernen Sie PBS von den Platten und entfernen Sie die Platte aus dem Biosicherheitsschrank.Wiederholen Sie die PBS-Wäsche zweimal, fügen Sie dann 150 Mikroliter pro Brunnen ein Mal FFA-Waschpuffer und lassen Bei Raumtemperatur für fünf bis 10 Minuten, um die festen Zellen zu permeabilisieren. Als Nächstes verwenden Sie primären Zika-Antikörper, um Infektionen zu erkennen. Bereiten Sie den primären Antikörper 4G2 mit einer Konzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter im FFA-Färbepuffer vor.Flick FFA Waschpuffer von den Platten, und fügen Sie 50 Mikroliter des primären Antikörpers in FFA Färbung Puffer zu jedem Brunnen. Dann versiegeln Sie die Platten mit Parafilm oder Kunststofffolie und bebrüten über Nacht bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie den sekundären Go Anti-Maus-HRP-beschrifteten Antikörper mit einer Konzentration von ein bis fünf 000 im FFA-Färbepuffer vor.Nach dem Entfernen der Antikörperlösung, waschen Zellen dreimal mit 150 Mikroliter FFA Waschpuffer pro Brunnen. Entfernen Sie den Waschpuffer, indem Sie jedes Mal in die Spüle streichen. Färben Sie die Zellen mit dem sekundären Antikörper im FFA-Färbepuffer bei 50 Mikrolitern pro Brunnen und bebrüten Sie ein bis zwei Stunden bei Raumtemperatur.Danach waschen Zellen dreimal mit FFA-Waschpuffer, wieder, entfernen Sie den Waschpuffer durch jedes Mal in die Spüle. Fügen Sie 50 Mikroliter des TrueBlue Substrats in jeden Brunnen ein. Warten Sie zwei bis 15 Minuten, bis die Spots mit minimalem Hintergrund vollständig definiert sind.Nachdem die Flecken sichtbar sind, waschen Sie vorsichtig mit Wasser mit einer Hand, um die Monoschicht vor der Kraft des wasserfließenden zu schützen. Tippen Sie trocken auf Papiertücher. Verwenden Sie kurz darauf einen Sezierenbereich, um die Spots in jedem Brunnen manuell zu zählen, oder verwenden Sie einen automatisierten Spotzähler.Wählen Sie in der ImmunoCapture-Software eine Verdünnung mit leicht zu unterscheidenden Brennpunkten zwischen 20 und 200 pro Bohrung für jede Probe aus und berechnen Titer in fokusbildenden Einheiten pro Millimeter anhand des Durchschnitts der doppelten Bohrungen. In diesem Experiment wurde eine Virusbelastung im peripheren und zentralen Nervensystemgewebe gezeigt, nachdem Ifnar-Mäuse subkutan Zika-Virus erhalten hatten. Die Nachweisgrenze lag zwischen 100 und 500 FFU pro Gramm, basierend auf Organ.Bei der Durchführung des fokusbildenden Assays können technische Fehler zu suboptimalen Ergebnissen führen. Organtoxizität, angetrieben durch hohe Konzentration der Leber, veränderte die Empfindlichkeit des Assays. Wenn der virale Titer im Organ niedriger als die Toxizität war, konnte die FFA die viralen Titer nicht genau aufzeichnen.Nierenzellen illustrierten Toxizität mit hoher Organkonzentration, wurden aber durch den viralen Titer bei niedrigen Organkonzentrationen überwunden. Kräftiges Pipettieren oder Waschen kann die Monoschicht entfernen, was zu Datenverlusten führt, die ungenaue Berichterstattung über Titer-Ergebnisse. Fasern oder Haare, die in laborlaboriertem saugfähigem Papier vorhanden sind, können einzelne Brunnen kontaminieren und bei Verwendung eines automatisierten Zählprogramms zu erheblichen Fehlern führen.Die Zelldichte ist ein weiteres Thema, das den Erfolg eines fokusbildenden Assays dramatisch beeinflussen kann. Zellen mit etwa 60 % Konfluenz zu Beginn des Testes zeigten im Vergleich zu Zellen, die mit 90 % Konfluenz plattiert waren, einen dramatischen Unterschied, der sich auf den fokusbildenden Assay auswirkte. Die Planung von Umfang und Umfang des Experiments, damit die Organernte effizient abgeschlossen wird, ist der wichtigste Teil des Verfahrens, gefolgt von dem Start des fokusbildenden Assays mit hochwertigen Zellen.Dieses Verfahren wurde verwendet, um Virus für mehrere virale Familien zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann auch an den Bildschirm für therapeutische Verbindungen angepasst werden und neutralisierende Antikörpertiter quantifizieren. Diese Techniken werden verwendet, um lebende Viren zu quantitieren, und es sollten geeignete Sicherheitsmaßnahmen gemäß den Richtlinien des BMBL getroffen werden.

isolation-quantification-zika-virus-from-multiple-organs

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Das Video zeigt ein Verfahren zur Quantifizierung des Zika-Virus in mehreren Mausorganen mittels eines fokusbildenden Assays. Dabei werden Monoschichten von Säugetierzellen mit virusinfizierten Gewebehomogenaten infiziert, gefolgt von der Verwendung von Methylcellulose, um die Ausbreitung des Virus zu verhindern. Anschließend wird die Immunfärbung eingesetzt, um eine präzise Quantifizierung und Messung der organspezifischen Infektiosität zu ermöglichen.

Ein fokusbildender Assay zur Quantifizierung von Virustitern in den Organen einer infizierten Maus

Das Video zeigt die intrazerebrale Injektion von Zika-Virussuspension in eine erwachsene Maus, um Neurodegeneration zu induzieren. Eine anästhesierte Maus wird in einem stereotaktischen Rahmen gesichert und ein Loch in den freiliegenden Schädel gebohrt, das zur Injektion verwendet wird. Eine Suspension des Zika-Virus wird in das Hirngewebe injiziert. Die Virusinfektion verursacht Entzündungen, die zu Neurodegeneration führen.

Etablierung eines Modells der Zika-Virus-induzierten Neurodegeneration bei einer erwachsenen Maus

Zika-Virus (ZIKV), ein neu auftretender Erreger, wird mit fetalen Entwicklungsstörungen und Mikrozephalie in Verbindung gebracht. Die Etablierung eines effektiven infektiösen Zellkultursystems ist entscheidend für die Erforschung der ZIKV-Replikation sowie für die Entwicklung von Impfstoffen und Medikamenten. In dieser Arbeit werden verschiedene virologische Assays zum ZIKV dargestellt und diskutiert.

Zika Virus Infectious Zellkultursystem und die<em&gt; In Vitro</em&gt; Prophylaktische Wirkung von Interferonen

Dieses Protokoll beschreibt die Wiederherstellung des infektiösen Zika-Virus aus einem zwei-Plasmid-infektiösen cDNA-Klon.

Rettung und Charakterisierung des rekombinanten Virus aus einer neuen Welt Zika Virus Infectious Clone

Hier beschreiben wir eine Methode für den Aufbau eines Modells von Zika virusbedingte Mikrozephalie in Maus. Dieses Protokoll enthält Methoden zum embryonalen, Neugeborenen und Erwachsenen-Bühne intrazerebrale Inokulation von Zika-Virus.

Mausmodelle für Zika-Virus-induzierte neurologische Erkrankungen mit intrazerebrale Injektion Strategien etablieren: embryonale, Neugeborene und Erwachsene

Ein Protokoll, Antigen-spezifische T-Zell-Reaktionen in den Organen der Immunabwehr des Ifnar1- / - Mausmodell für die Zika-Virusinfektion (ZIKV) zu bewerten ist beschrieben. Diese Methode ist von zentraler Bedeutung für die Untersuchung der zellulären Mechanismen des Schutzes und immunpathogenese ZIKV Impfstoffe und ist auch wertvoll für die Beurteilung der Wirksamkeit.

Bewertung der Zika-Virus-spezifischen T-Zell-Reaktionen in Organe der Immunabwehr von infizierten Ifnar1- / - Mäusen

Wir beschreiben eine Methode zur Bewertung der Wirkung der vorbestehenden Immunität gegen Dengue-Virus auf der Zika-Virus-Infektion mit humanem Serum, primären humanen Zellen und Infektion Quantifizierung durch quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion.

Quantifizierung der Antikörper-abhängige Verstärkung der Zika-Virus in primären humanen Zellen

Das vorgestellte Protokoll kann die Vektorkompetenz von Aedes aegypti-Mückenpopulationen für ein bestimmtes Virus, wie Zika, in einer Containment-Umgebung bestimmen.

Vektorkompetenzanalysen an Aedes aegypti Mücken mit Zika-Virus

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Vermehrung des Zika-Virus (ZIKV) in Nierenzellen von Vero-Afrikanischen Grünen Meerkatzen und die Quantifizierung von ZIKV unter Verwendung zellbasierter kolorimetrischer Immundetektionsmethoden in 24-Well- und 96-Well-Formaten (Hochdurchsatz).

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