Die Entwicklung automatisierter, durchsatzer, kontinuierlicher Zellwachstumsexperimente mit eVOLVER

eVOLVER gibt Forschern experimentelle Freiheit, ihre eigenen Kulturwachstumsexperimente mit automatisiertem Feedback zu mehreren Parametern zu definieren und auf jede Größe zu skalieren, die sie benötigen. eVOLVER ist flexibler als andere Geräte. Benutzer können Software in Python sowie die Hardware ganz einfach anpassen, indem sie die intelligenten Hüllen ändern, die Sensoren für jede Kultur enthalten.

Das System kann auf den ersten Blick mit mehreren Komponenten und Verbindungen kompliziert erscheinen. Ein visueller Leitfaden gibt Benutzern beim ersten Mal mehr Vertrauen in die Durchführung von Experimenten auf eigene Faust. Die richtige Einrichtung ist von entscheidender Bedeutung.

Achten Sie darauf, zu verstehen, was jede Komponente tut. So können Sie bestätigen, dass sie funktionieren. Stellen Sie sicher, dass alles korrekt geroutet und eng verbunden ist.

EVOLVER wurde für die aerobe Kultivierung von Bakterien und Hefe unter unterschiedlichen Bedingungen entwickelt, könnte eVOLVER auch für die anaerobe Fermentation oder zur Erhaltung von Säugetierzellen in Suspension modifiziert werden. In diesem Video wird gezeigt, wie Sie ein kontinuierliches Kulturexperiment mit hohem Durchsatz mithilfe der eVOLVER-Plattform einrichten, initialisieren und ausführen. Am Tag vor dem Experiment, bereiten Medien, Fläschchen und Inokulum nach dem Manuskript.

In drei großen Bechern, bereiten Sie zwei Becher von 10%Bleichmittel und ein Becher mit 70%Ethanol. Schalten Sie mit den Schaltern am eVOLVER-Gerät das Fünf-Volt-Netzteil am eVOLVER ein, warten Sie fünf Sekunden, und schalten Sie dann das 12-Volt-Netzteil ein. Wenn Sie mehrere Durchstechflaschen aus derselben Medienflasche ausführen, verbinden Sie mehrere Medieneingangszeilen mit Rohrsplittern.

Kundenspezifische Schlauchsplitter können mit niedrigeren Komponenten konstruiert werden. Untertauchen Sie die Medieneingangszeilen in den ersten Bleichbecher und die Medien-Efluxlinien im zweiten Bleichbecher. Schließen Sie das nachgeschaltete Ende der Medieneingangsleitungen mit dem zweiten Becher mit den Efluxleitungen an.

Legen Sie Abfallleitungen in einen Abfallcarboy. Fügen Sie ein bis zwei Liter Bleichmittel in den Abfall Carboy, um Abfälle während des Experiments entstehen zu sterilisieren. Navigieren Sie über den Touchscreen des eVOLVER zum Setup-Bereich und führen Sie alle Pumpen 20 Sekunden lang aus, um die Flüssigkeitsleitungen mit 10% Bleichmittel zu füllen.

Bleichmittel mindestens 30 Minuten in den Leitungen sitzen lassen, um zu sterilisieren. Führen Sie die Pumpen erneut über den Touchscreen aus, bis die Leitungen nicht mehr unterGetaucht sind, und drücken Sie Luft durch die Leitungen, um so viel wie möglich von der Bleiche herauszubekommen. Medieneingangsleitungen in den Ethanolbecher legen, die Leitungen mit Ethanol füllen, mit Luft spülen.

Befestigen Sie dann Medieneingangsleitungen mit den unteren Anschlüssen an die Medienflaschen und führen Sie die Pumpen aus, bis die Medien vollständig durch die Leitungen laufen und restliches Ethanol ausspülen. Teilweise sterilisierte Fläschchen in die eVOLVER smart Hülsen einlegen und die Eingangsleitungen an das kurze Zuflussstroh und die Abfallleitungen an den langen Eflux Strohq entsprechend der Farbcodierung anschließen. Passen Sie auf dem eVOLVER-Touchscreen an, um alle Pumpen in 10 Sekunden-Schritten auszuführen, um die Durchstechflaschen mit Medien zu füllen.

Stellen Sie sicher, dass efluxpumpen durch visuelle Inspektion effizient Medien durch die Efluxstrohhalme entfernen, um Überläufe zu verhindern. Dann drücken Sie Fläschchen nach unten, bis sie vollständig von der intelligenten Hülse umhüllt sind. Ziehen Sie auf der interaktiven Setup-Seite des eVOLVER-Touchscreens einen Finger über den Touchscreen, oder drücken Sie die Taste Alle auswählen, um alle Durchstechflaschen auszuwählen und die Ausgangstemperaturen auf 30 Grad Celsius und die Rührung auf 10 einzustellen.

Geben Sie auf einem Computer das eVOLVER-Gerät an, auf dem das Experiment ausgeführt werden soll. Stellen Sie sicher, dass die gewünschten Kalibrierungseinstellungen ausgewählt wurden. Öffnen Sie das eVOLVER-Dashboard, und navigieren Sie zur Seite Experiment-Manager.

Wählen Sie das Basisexperiment im Experiment Navigator-Bedienfeld oder ein vorhandenes Experiment als Startpunkt aus, und klicken Sie auf Klonen. Navigieren Sie zur Seite Experiment editor. Verwenden Sie die Bedienfelder Vial Selector und Parameter Definition, um die Temperatur auf 30 Grad Celsius einzustellen und einen oberen und unteren Schwellenwert von OD für jede Durchstechflasche entsprechend dem experimentellen Design festzulegen.

Speichern Sie das Experiment, indem Sie auf Speichern klicken. Klicken Sie dann auf den Pfeil, um zur Experiment-Manager-Seite zurückzukehren, und klicken Sie auf die Schaltfläche Wiedergabe, um sie auszuführen. Sobald das Experiment abgeschlossen ist, navigieren Sie zum Bedienfeld "Echtzeitdaten" im interaktiven Dashboard.

Überprüfen Sie für jede Durchstechflasche, ob die OD-Werte bei Null gehalten werden. Durchsuchen Sie die Temperaturdiagramme, um zu überprüfen, ob die Temperaturen bei oder in Richtung 30 Grad Celsius sind. Um das Inokulum vorzubereiten, messen Sie zunächst die OD der Nachtkulturen und berechnen die gewünschte volle Verdünnung für Nachtkulturen unter Annahme eines Fläschchenvolumens von 25 Millilitern und eines gewünschten Start-OD von etwa 0,05.

Durch den Probenahmeanschluss das berechnete Inokulumvolumen oder das Gemisch von Inokula. Überprüfen Sie die Diagramme auf dem Dashboard, um festzustellen, ob die OD auf 0,05 ansteigt. Zellwachstum und Durchstechflasche Bedingungen können in Echtzeit überwacht werden, wie das Experiment läuft, so dass der Forscher eingreifen kann, wenn irgendwelche Probleme auftreten.

eVOLVER ist eine automatisierte kontinuierliche Kulturplattform, die multiparametergesteuerte Kulturbedingungen ermöglicht. Qualitative Unterschiede wurden zwischen den Wildtyp-, temperaturempfindlichen und salzempfindlichen Gruppen gezeigt, wenn die Log-Verhältnisse gegen Generationen dargestellt wurden, die aus eVOLVER-Wachstumsratendaten interpoliert wurden. Farbe gibt die Temperatur der Selektion an, während Bindestriche Salzkonzentrationen unterscheiden.

Eine Neigung, die mit mindestens drei Punkten durch den linearen Teil jedes Diagramms passt, ergibt einen quantitativen Fitnesswert, der beschreibt, wie die Variantendehnung mit der Referenzdehnung konkurriert. Negative Fitnesswerte deuten darauf hin, dass die Variantenbelastung durch die Referenzdehnung übertroffen wird. Überprüfen Sie immer, ob alle Pumpen effizient laufen und dass Flüssigkeitsleitungen frei von Clogs sind.

Ein Überlauf kann ein Experiment ruinieren und möglicherweise die intelligenten Ärmel beschädigen. Aus eVOLVER entnommene Proben können anschließend sequenziert werden, um infolge des Experiments auf genomische Veränderungen zu überprüfen. Diese Informationen können verwendet werden, um neue Stämme oder Systeme zu entwickeln.

Für Forscher, die Laborentwicklung oder Bibliotheksauswahl verwenden, ist es einfach, in jedem eVOLVER-Experiment eindeutige Selektionsdrucke anzuwenden. Feedback-Steuerung und dynamische Umgebungen sind jetzt auch sehr zugänglich. Der Abfallcarboy wird nach einem Experiment kleine Mengen Bleichmittel und Ethanol enthalten.

Wenden Sie sich an Ihren Laborsicherheitskoordinator für die ordnungsgemäße Entsorgung von Abfällen.