Name: Die Entwicklung automatisierter, durchsatzer, kontinuierlicher Zellwachstumsexperimente mit eVOLVER (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Erfahren Sie die Einrichtung automatisierter kontinuierlicher Zellwachstumsexperimente mit dem eVOLVER-System für mikrobielle Kulturen. Diese Methode ermöglicht Echtzeitüberwachung und dynamische Steuerung experimenteller Parameter.

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Wir danken B. Stafford für seine Unterstützung bei der Gestaltung des Systems, und H. Khalil, A. Soltanianzadeh, A. Sun, S. Pipe und A. Cavale für die Hilfe beim Bau des Systems. Wir zeichnen die Electronics Design Facility (EDF), das Engineering Product Innovation Center (EPIC) und das Software & Application Innovation Lab (SAIL) am Hariri Institute for Computing der Boston University für ihre Dienstleistungen ein. Diese Arbeit wurde durch einen NSF CAREER Award (MCB-1350949 bis A.S.K.) unterstützt, und DARPA gewährt HR0011-15-C-0091 und HR0011-18-2-0014 (an A.S.K.). A.S.K. wird auch mit dem NIH-Direktorenpreis (1DP2AI131083-01), dem DARPA Young Faculty Award (D16AP00142) und dem NSF Expeditions in Computing (CCF-1522074) ausgezeichnet.

1. Vorbereitung von Medien, Vials und Inoculum
NOTE: Dieses Protokoll geht davon aus, dass die Anwender das eVOLVER-System bereits kalibriert haben und die Smart Sleeve Konfiguration verwenden, die in der vorherigen Arbeit 16 beschrieben wurde. Smart Sleeves sind leicht umgestaltet oder modifiziert, aber die Einrichtungsdetails von Lautstärke und Steuerungsparametern können bei alternativen Konfigurationen unterschiedlich sein.
<ol><li>Am Tag vor dem Experiment, bereiten 2 mL über Nacht flüssige Kulturen von S. cerevisiae BY4741 Referenz-und Variantenstämme in YPD-Medien (Yeast Peptone Dextrose) bei 30 ° C in einem schüttelnden Inkubator auf mindestens 300 U/min.</li>
	<li>Übertragen Sie sterile YPD-Medien in saubere, autoklavierte Flaschen, die mit Schlauch ausgestattet sind. Alternativ können Medien direkt in Flaschen mit Schläuchen überfüllt werden. NOTE: Flaschen passen zu Schläuchen, indem sie ein Loch in die Kappe bohren und Schläuche mit Steckverbindern durchziehen, um sie an Ort und Stelle zu sichern. Siehe Materialtabelle.</li>
	<li>Fügen Sie jede Ampelschere mit Rühren und Schrauben an einem Vialdeckel, der mit Zuflüssen und Abwasserstrohen ausgestattet ist. Achten Sie darauf, dass alle Komponenten durch visuelle Inspektion sauber sind.</li>
	<li>Platzieren Sie Vials in einem autoklavierbaren Regal, decken Sie mit Folie und Autoklav auf einen Gravitations-oder Vakuumkreislauf mit einem 20-minütigen Sterilisationsschritt.</li>
</ol>2. Ein Experiment aufsetzen
<ol><li>In drei großen Bechern, bereiten 500 mL von 10% Bleichmittel, 200 mL von 10% Bleichmittel, und 300 mL von 70% Ethanol.</li>
	<li>Mit den Schaltern des eVOLVER-Gerätes die 5-V-Stromversorgung am eVOLVER einschalten, auf 5 s warten und dann die 12-V-Stromversorgung einschalten.</li>
	<li>Wenn Sie mehrere Ampullen aus der gleichen Medienflasche ausführen, verbinden Sie mehrere Medieneingänge mit Schlauchsplittern. Mit Luer-Komponenten lassen sich kundenspezifische Schlauchsplitter konstruieren.</li>
	<li>Die medialen Eingangslinien in den ersten Bleichbecher und die medialen Abflüsse in den zweiten Bleichbecher eintauchen. Legen Sie das nachgeschaltete Ende der Medien-Eingangslinien in den zweiten Becher mit den Abflüssen. Legen Sie Abfallleitungen in Abfallcarboy.</li>
	<li>Fügen Sie 1-2 L Bleichmittel in große leere Abfälle Carboy, die Sterilisationen während des Experiments erzeugt sterilisieren wird. Konsultieren Sie mit einem Sicherheitskoordinator, um eine ordnungsgemäße Entsorgung von Abfällen zu gewährleisten.</li>
	<li>Mit dem Touchscreen auf dem eVOLVER navigieren Sie in den Einrichtungsbereich und führen alle Pumpen für 20 s aus, um Flüssigkeitslinien mit 10% Bleichmittel zu füllen. Achten Sie während des Betriebs durch visuelle Inspektion darauf, dass alle Leitungen gefüllt sind und dass Pumpen normal arbeiten. Bleichen in den Linien für mindestens 30 Minuten zu sterilisieren sitzen.</li>
	<li>Führen Sie Pumpen wieder mit der Touchscreen-App aus, bis die Leitungen nicht mehr untergetaucht sind, was die Luft durch die Leitungen drückt, um so viel von der Bleichung wie möglich herauszuholen.</li>
	<li>Legen Sie die Medieneingabelinien in den Ethanolbecher und wiederholen Sie sie wie oben, füllen Sie die Linien mit Ethanol und spülen Sie mit Luft. NOTE: Da Ethanol schnell abtötet, muss man nicht 30 Minuten auf die Sterilisation warten.</li>
	<li>Mit den Luer-Anschlüssen die Eingangslinien an die Medienflaschen anbringen und die Pumpen so lange laufen, bis die Medien vollständig durch die Leitungen laufen und dabei jedes Restethanol ausspülen.</li>
	<li>Teilweise sterilisierte Vials in die eVOLVER Smart Sleeves einlegen und die Linien entsprechend der Farbkodierung auf den Linien an die richtigen Positionen anschließen. Beginnen Sie damit, die Eingangslinien an das kurze Zustroh anzubringen und dann die Abfallleitungen an das lange Abwasser zu befestigen. CAUTION: Es ist wichtig, auf lose Verbindungen oder falsch verlaufene Leitungen zu überprüfen. Gelingt dies nicht, werden Überläufe verursacht und die Smart Sleeve möglicherweise beschädigt.</li>
	<li>Führen Sie alle Pumpen in 10-s-Schritten, um die Vials mit Medien zu füllen. Durch die visuelle Inspektion Abwasserpumpen werden die Medien durch die AbwasserStrohhalme effizient entfernt, um Überläufe zu vermeiden. Wenn die Abwassersträhne nicht effizient zu funktionieren scheinen, überprüfen Sie die fluidischen Leitungsanschlüsse und die Peristaltikpumpe. Teile korrigieren oder ersetzen.</li>
	<li>Push-Vials nach unten, bis sie vollständig vom Smart Sleeve umschlossen sind.</li>
	<li>Stellen Sie die Ausgangsbedingungen für experimentelle Parameter mit dem eVOLVER-Touchscreen auf der interaktiven Setup-Seite ein. Setzen Sie für alle Ampullen die Temperatur auf 30 ° C und die Rühren auf 10. Dies kann für alle Vials auf einmal getan werden, indem man einen Finger über den Touchscreen zieht, um alle Vials auszuwählen.</li>
</ol>3. Konfiguration von eVOLVER-Software und Programmierung Algorithmische Kultur-Routinen
<ol><li>Im eVOLVER-Armaturenbrett auf einem Computer navigieren Sie zur Experiment-Manager-Seite. Wählen Sie das Basisexperiment im Experimentier-Navigator-Panel oder ein bestehendes Experiment als Ausgangspunkt und klicken Sie auf den Klon neu. NOTE: Es ist möglich, Experimente von anderen Gruppen zu verwenden, indem man den GitHub-Link an das Repo klebt, bei dem die experimentelle Definition in den Experimentmanager gespeichert wird.</li>
	<li>Geben Sie den Experimentiernamen und das eVOLVER-Gerät an, auf dem das Experiment ausgeführt wird. Stellen Sie sicher, dass die gewünschten Kalibrierungseinstellungen ausgewählt wurden, indem Sie diese Felder auf der Seite ändern.</li>
	<li>Verwenden Sie die Vial-Selektor-und Parameterdefinitionsscheiben, um experimentelle Bedingungen zu setzen. Zum Beispiel, um die Temperatur für Vials 0-4 bis 30 ° C einzustellen, wählen Sie die Ampullen in der Ampelauswahl, setzen Sie die Parameterdefinition auf 30 , und klicken Sie auf Set. Wiederholen Sie dies für OD, um eine obere und untere Schwelle für jede Ampulle festzulegen.</li>
	<li>Nachdem die experimentellen Parameterdefinitionen abgeschlossen sind, speichern Sie das Experiment, indem Sie auf Speichern klicken und auf Start klicken .</li>
</ol>4. Experimente und Überwachung in Echtzeit initiieren
<ol><li>Sobald das Experiment im Gange ist, navigieren Sie zum Echtzeit-Datenpanel im interaktiven Armaturenbrett. Überprüfen Sie für jedes Ampultier, dass die OD-Werte bei null liegen und dass die Temperaturen auf dem programmierten Niveau liegen oder sich auf ein programmiertes Niveau bewegen, indem Sie durch die Graphen blättern.</li>
	<li>Um das Inoculum vorzubereiten, messen Sie die OD der Übernachtungskulturen, berechnen Sie die gewünschte Faltenentwässerung unter der Annahme eines Ampelvolumens von 25 ml, und Pipette berechnete Volumen von inoculum in Vials durch den Probenport. Um zum Beispiel aus den Übernachtungskulturen, die sich bei OD 2.0 befinden, einen gewünschten Start OD von etwa 0,05 in der Kultur-Ampulle zu erreichen, sollten 625 μL Zellen zu jeder Ampulle hinzugefügt werden.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Grafiken auf dem Armaturenbrett, um zu sehen, dass die OD-Graphen entsprechend aktualisiert wurden. Eine Erhöhung auf die gewünschte AnfangsoD ist in den Graphen zu sehen.</li>
	<li>Verfolgen Sie verschiedene Datentypen (wie OD, Temperatur, Wachstumsrate, Generationen und Medienkonsum) während des gesamten Experiments, indem Sie die entsprechenden Grafiken im Armaturenbrett durchblättern. Diese Werte können experimentelle Entscheidungen des Nutzers (z.B. Zeitpunkte) informieren oder sogar in Funktionen zur automatischen Rückkopplung verwendet werden.</li>
	<li>Um Medienflaschen mittelfristig zu ersetzen, wird das Experiment im Experiment-Manager-Panel unterbrochen, um Pumpenereignisse zu verhindern. Die Medienlinie schnell aus der leeren Flasche abschrauben und mit der neuen Flasche verbinden. Vermeiden Sie es, die Enden des Schlauchens zu berühren, um eine Kontamination zu verhindern. Das Experiment im Experimentiermanager wiedergeben.</li>
</ol>5. Proben von Yost-Zellen von eVOLVER Vials
<ol><li>Bereiten Sie eine Cycloheximid-Lösung vor, um die Proteinsynthese zu hemmen und Hefezellen für die Fließzytometrie-Analyse zu fixieren. In einem 15 mL konischen Rohr 12 mL PBS und 12 μL von 20 mg/mL Cycloheximide und Wirbel für 5 s hinzufügen.</li>
	<li>Mit Hilfe einer Multichannel-Pipette, aliquot 100 μL in jeden Brunnen einer 96-well-runden Bodenplatte.</li>
	<li>Die Platte in Aluminiumfolie wickeln, um das Licht zu blockieren und bis zum Bedarf bei 4 ° C zu halten.</li>
	<li>Zum Probieren wird durch den Probenahmeport auf dem Vialdeckel mit verlängerter Länge 200 μL-Tipps gepipette.</li>
	<li>Pipette 100 μL von einer Ampulle in einen Brunnen in der Befestigungsplatte, die 2-3x durch Auf-und Abstecken vermischen, dann in Folie erholen und die Platte auf 4 ° C zurückgeben.</li>
</ol>6. Experiment Break Down and Clean Up
<ol><li>Bereiten Sie 1 L von 10% Bleichmittel und zwei 500 ml DI-Wasserlösungen in großen Bechern.</li>
	<li>Stoppen Sie das Experiment, indem Sie den Stop-Befehl in das Experiment-Manager-Panel senden. Die Daten werden weiterhin in der Cloud-fähigen Datenbank gespeichert und können später noch im Echtzeit-Datenpanel des Armaturenbretts eingesehen oder zur Offline-Analyse heruntergeladen werden.</li>
	<li>Entfernen Sie Vials aus Smart Sleeves und legen Sie sie in ein Autoklavenregal, um Überläufe in den folgenden Schritten zu vermeiden.</li>
	<li>Die Einspeiseleitungen aus den Medienflaschen abschrauben und in den Becher von 10% Bleichmittel geben. Führen Sie Pumpen von der eVOLVER-Benutzeroberfläche wie im Setup aus, um Leitungen und Vials zu sterilisieren.</li>
	<li>Trennen Sie Leitungen von Vials und Tauchleitungen in DI-Wasser. Führen Sie Pumpen aus, um alle Bleichmittel aus dem System zuerst mit DI-Wasser, dann mit Luft zu spülen.</li>
	<li>Schalten Sie eVOLVER aus, indem Sie zuerst die 12-V-Stromversorgung ausschalten, auf 5 s warten und dann die 5-V-Stromversorgung ausschalten.</li>
	<li>In 10% Bleichmittel einrühren, dann mit DI-Wasser abspülen. Achten Sie darauf, die Zustromm-und AbwasserStrohhalme jeder Kappe zu spülen, indem Sie DI-Wasser durch sie führen. Krümmungs-Vials mit Reagenzgläser, wenn sich die Folie an Wänden gebildet hat.</li>
	<li>Abfallentsorgung angemessen und Spülen von Abfallbehältern gründlich. CAUTION: Abfallbehälter werden eine Mischung aus 10% Bleichmittel, sterilisierten Zellkulturabfällen und Spurenmengen von Ethanol enthalten. Konsultieren Sie einen Sicherheitskoordinator für die richtige Handhabung und Entsorgung.</li>
</ol>7. Quantifizierung der Fitness mit der Verwendung von Flow-Cytometrie-Analyse der Fraktionellen Populationen
<ol><li>Analysieren Sie die gesammelten Proben aus Abschnitt 5 mit einem Strömungszytometer, das mit dem entsprechenden Fluoreszenzkanal und Detektoren16ausgestattet ist.</li>
	<li>Erwerben Sie mindestens 10.000 Ereignisse pro Probe und lassen Sie sich mit Hilfe der Vorwärts-und Seitenstreuungsdaten auf intakte Zellen einwirken.</li>
	<li>Gate basierend auf dem entsprechenden Fluoreszenzkanal (z.B. GFP), um die Bruchteile der einzelnen Populationen zu bestimmen.</li>
	<li>Speichern Sie auf einem Computer die Daten von der Experiment-Manager-Seite aus an den gewünschten Ort, indem Sie auf den Button "Export" klicken.</li>
	<li>Aus den eVOLVER-Dateien ermitteln Sie die Anzahl der Generationen, die durch jeden Zeitrahmen für jede Ampulliste abgeschlossen werden. Im eVOLVER-Code werden Generationen berechnet, indem die OD-Daten zuerst zwischen jedem Verdünnungsfall segmentieren, dann ist jedes Segment mit einer grundlegenden Exponenz der Form <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq1.jpg"> zu jedem Segment geeignet, was r, die Wachstumsrate 16 ergibt. Die Anzahl der Generationen über einen Zeitraum wird dann nach folgender Formel berechnet: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq2v2.jpg">
</li>
	<li>Das Lochverhältnis der beschrifteten und nicht beschrifteten Populationen aus den Strömungszytometrie-Daten vs. Erzeugungszahl aus den obigen Berechnungen wird bei der Entnahme der Proben ausgearbeitet. Identifizieren Sie den linearen Bereich und passen Sie den Hang entsprechend der folgenden Gleichung an. Dieser Hang wird gemeinhin als die konkurrenzfähige Fitness18,19definiert. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq3v2.jpg">
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren, Brandon G. Wong und Ahmad S. Khalil, sind Mitbegründer der Fynch Bioscience Inc., die die eVOLVER-Plattform entwickelt, die in diesem Artikel verwendet wird.

Die Wachstumsauswahl ist ein unverzichtbares Werkzeug in der Biologie, das im Großen und Ganzen verwendet wird, um phänotypische Unterschiede zwischen zellulären Populationen zu erzeugen und zu charakterisieren. Während die Stapelkulturen eine gewachsnahe Auswahl der Wachstumsgewinnung ermöglichen, erweitern kontinuierliche Kulturtechniken den Grad der Kontrolle und Berechenbarkeit dieser Experimente dramatisch, indem sie eine präzise Regulierung der Form und Dynamik der Selektion durchführen, um zu erzeugen. Wiederholbare, quantitative Ergebnisse22. Kontinuierliche Kultur wurde eingesetzt, um die Auswahl für hochgradig vermögende Bibliotheken20,23, 24,25strengzu kontrollieren und anspruchsvolle adaptive Regime in experimentellen und experimentellen und Regie:Evolution11,12, 26, 27. Die Kontinuierliche Kultur ermöglicht auch eine präzise Charakterisierung von Zellen über eine Reihe von quantitativ kontrollierten Bedingungen, um komplexe genetische Systeme besser zu verstehen und die technischenBioproduktionsstämme 9,14 zu optimieren. , 28. November
Allerdings gibt es kein universelles Protokoll für die kontinuierliche Kultur, da subtile Änderungen der selektiven Bedingungen zu dramatischen Veränderungen der biologischen Ergebnisse 4,29,30führenkönnen. Experimente müssen in der Lage sein, zwischen Selektionsregimen zu wählen und experimentelle Protokolle und Geräte entsprechend anzupassen. Neben der Auswahl zwischen den Steuerungsparametern wären solche Systeme idealerweise so anspruchsvoll, dass sie mehrere Parameter in hochparallelen Experimenten, die zur Entschlüsselung von interagierenden Eingängen in komplexen Biologische Systeme (z.B. Epistasis). eVOLVER stellt sich dieser Herausforderung, indem es den Nutzern ermöglicht, die Rückkopplungskontrolle zwischen Kulturbedingungen und fluidischen Funktionen beliebig zu programmieren, um hochspezialisierte Umweltnischen zu spezifizieren.
Um Einschränkungen im aktuellen Setup zu überwinden und die Steuerungsparameter zu erweitern oder zu ändern, könnte der Smart Sleeve leicht umgestaltet werden, um neue Sensoren oder Aktoren hinzuzufügen. Darüber hinaus würde die Verringerung des Vial-Volumens die Medienausgaben verringern, was in der kontinuierlichen Kultur erheblich sein kann. Während das aktuelle Design die Messung und Steuerung von Temperatur, Kulturagitation, Lichtinduktion, Trübung und Fluidik ermöglicht, müssen andere Parameter extern durch Probenahme aus den Vials gemessen werden. Zur aktuellen Arbeit gehört die Möglichkeit, die enzymatische Aktivität über die Luciferase zu überwachen und gelösten Sauerstoff und pH-Wert direkt in eVVER-Kulturen zu regulieren. Darüber hinaus kann eVOLVER, auch wenn es in dieser Arbeit nicht demonstriert wird, mit neuartigen millifluidischen Multiplexing-Geräten 16 interagieren, die sich auf die Prinzipien der großflächigen Integration stützen (die aus der Elektronik stammen und von Mikrofluidik übernommen werden), um Die Möglichkeit, das Fluidic-Handling kostengünstiger zu gestalten (z.B. Multiplex-Fluidic-Eingänge, vial-vial-vial-Transfers). Diese Feuchtmodule können komplett im Labor entworfen und hergestellt werden, so dass der Anwender Flüssigkeiten durch die programmatische Betätigung verschiedener Ventilkombinationen in automatisierten fluidischen Routinen umleiten kann. So können Anwender die starren fluidischen Designs überwinden, die traditionell in der kontinuierlichen Kultur verwendet werden, aber auch die fluidischen Fähigkeiten mit einer geringeren Anzahl von teuren Bedienelementen (z.B. Peristaltikpumpen) auf Hochdurchsicht skalieren. Schließlich hoffen wir, eine Autosampling-Plattform zu integrieren, die diese Millifluidik und DIY-Komponenten nutzt und die Begrenzung der manuellen Interaktion bei längeren und größeren Experimenten, bei denen die Samplingkulturen schwerfällig wären, überwindet.
Zusätzlich zu den physikalischen Änderungen an der Plattform eröffnet die webbasierte Software neue Freiheitsgrade, indem sie es Nutzern ermöglicht, eigene eVOLVER-Skripte zu schreiben, zu bearbeiten und zu teilen, indem sie vollautomatische, Feedback-fähige Kulturprogramme (z.B. Turbidostat) generieren. Nutzer können in subtilen Variationen des gleichen Auswahlschemas programmatisch über Parameterbereiche fegen oder Steuerungsalgorithmen in neuartigen Kombinationen verbinden, um beliebig viele ausgeklügelte Selektionsschemata zu spezifizieren. Darüber hinaus verändert die Fähigkeit, Kulturen in Echtzeit leicht zu überwachen, die Art und Weise, wie Experimente durchgeführt werden. Bei Echtzeitüberwachung können Anwender 1) die Konsistenz zwischen den Läufen überprüfen, ein kritisches Feature für Bioproduktionsanwendungen und Experimente mit hohem Durchsatz, und 2) bei Experimenten eingreifen, um herausfordernde Stämme zu beheben, die zeigen. Schlechtes Wachstum oder Biofilmbildung oder Diagnose von Benutzerfehlern (z.B. Kontamination). Schließlich generiert eVOLVER mit mehreren Datenströmen, die für jede einzelne Kultur in Echtzeit gesammelt und interpretiert werden, eine hohe Datendichte, die maschinelle Lernansätze für neuartige nachgelagerte Analysen erleichtern kann.
Neben den nachgewiesenen Anwendungen für Fitnesscharakterisierung, Bibliotheksauswahl und Laborentwicklung betrachten wir eine Reihe verwandter Bereiche als reif für die Umsetzung in eVOLVER mit integrierter Fluidik. EVOLVER Experimente mit Mikrobiomproben könnten die Stabilität der Gemeinschaft in kontrollierten Umgebungen31, 32 untersuchen,dieMikrobiota-Komposition mit Hilfe von Kulturomiken33erforschen oder Arten dynamisch vermischen, um Befragung der ökologischen Dynamik der Kolonisation oder Invasion 34,35. Zahlreiche Methoden zur kontinuierlichen, gezielten Entwicklung von Biomolekülen konnten auch26,36,37problemlos auf dem Gerät eingesetzt werden, was die Zugänglichkeit und den Durchsatz dieser Systeme deutlich erhöht. Die Fähigkeit, wachsende Bedingungen wie Medienzusammensetzung, Temperatur und Belastungen in dynamischer, durchsatzer Natur zu optimieren,kann bei Optimierungsbemühungen für industrielle Biomanufacturing-Anwendungen 9 helfen. Wir stellen uns weiterhin die vertikale Integration von eVOLVER in andere Analysetechniken wie Mikroskopie und Strömungszytometrie in geschlossener Kreislauf-Manier vor und bieten ein vollautomatisiertes System für das Wachstum und die Analyse von Zellkulturen sowohl in der Einzelzelle als auch in der Bevölkerung. Ebenen. Darüber hinaus könnte eVOLVER mit einigen Hardware-Modifikationen an der Smart Sleeve, wie zum Beispiel der Abdichtung des Schiffes und der Kontrolle des Gasgehalts, möglicherweise angepasst werden, um das Wachstum einer breiteren Palette von Zelltypen zu unterstützen, wie zum Beispiel Suspension-Säugetiere. Es ist auch möglich, den gesamten Rahmen in eine anaerobe Kammer für anaerobe Zellkultur zu stellen. Mit Blick auf die Zukunft wollen wir unser Software-Framework zu einer zentralen Cloud-Infrastruktur zusammenbauen und glauben, dass dies es den Nutzern ermöglichen würde, ihre Daten einfach aus der Ferne zu konfigurieren, zu analysieren und zu teilen, ohne physisch im Labor präsent sein zu müssen. Die Cloud-Infrastruktur, die als Datenkuratorin fungiert, würde sich auch über Experimente hinweg für großangelegte Metaanalysen eignen. Wir gehen davon aus, dass eVOLVER und diese zukünftigen Fortschritte den Umfang möglicher Wachstumsselektionen erheblich erweitern werden, indem sie Automatisierung und Innovation in der kontinuierlichen Kultur ermöglichen.

Kontinuierliche Zellkulturtechniken, die vorfast 70 Jahren erstmalsentwickeltwurden, werden vor1,2Jahrenwieder belebt. Das liegt an einem Zusammenspiel von Faktoren. Erstens hat die Entwicklung von Hochdurchsatz-omics-Techniken, die es möglich gemacht haben, eine große Anzahl von Genotypen5,6 zulesen und zu generieren, eine begleitende Nachfrage nach experimentellen Techniken geschaffen, die Gut gesteuertes Zellwachstum und Phenotypisierung. Zu diesem Zweck stellt die kontinuierliche Kultur einen starken experimentellen Ansatz dar, um aus den entstehenden genomischen Fortschritten Kapital zu schlagen. Durch die Erleichterung von Wachstumsselektions-und-experimenten an Zellpopulationen in exakt kontrollierten (und dynamischen) Umweltbedingungen bietet die kontinuierliche Kultur ein Mittel, Genotypen zu Phenotypenvon 7,8, Quantiativ charakterisieren technische Stämme und Organismen9, und verfolgen adaptive genetische Veränderungen in den Laborentwicklungsstudien 10,11, 12.
Zweitens hat die jüngste Entwicklung von zugänglichen Prototyping-Techniken, wie die additive Fertigung und Open-Source-Hard-und Software-Elemente, eine breitere Palette von Anwendern in die Lage versetzt, ihre eigenen kostengünstigen Formen kontinuierlicher Kultursysteme zu entwerfen und zu bauen. Direkt im Labor. All dies hat zu einer spannenden Reihe von Do-it-yourself-Geräten geführt, die kontinuierliche Kulturfunktionalitäten wie den chemostat 13, Turbidostat14oder Morbidostat15ausführen. Leider ist es diesen Ad-hoc-Lösungen zwar gelungen, spezifische (Nischen-) Probleme zu lösen, für die sie entwickelt wurden, aber es fehlt ihnen in der Regel an der Fähigkeit, den Durchsatz and/oder die experimentelle Designkomplexität zu skalieren.
Das eVOLVER-System wurde mit dem Ziel entwickelt, eine einzige Plattform zu schaffen, die den wachsenden experimentellen Bedürfnissen der kontinuierlichen Kultur gerecht wird und der Geschwindigkeit und dem Maßstab der aufkommenden genomischen Techniken 16 (Abbildung 1A) entspricht. Das Design von eVOLVER setzt gängige Grundsätze ein, die hochskalierbaren Technologien ausanderen Disziplinen 17 zugrunde liegen, darunter standardisierte Fußabdrücke, modulare Komponenten und Open-Source-Designprinzipien. So können Lösungen für neue Nischenanwendungen ohne größere Änderungen am System konzipiert werden. EVOLVER ist das erste automatisierte, durchgängige Kultursystem, das kostengünstig und einfach umkonfiguriert werden kann, um nahezu jede Art von Hochdurchsatz-Wachstumsexperiment. Durch modulare und programmierbare Smart Sleeves, in denen alle Sensoren und Aktoren zur Steuerung einzelner Kulturen eingesetzt werden, ermöglicht eVOLVER einzigartig die Skalierung von Durchsatz und individueller Kontrolle der Kulturbedingungen. Darüber hinaus tauscht eVOLVER als webbasierte Plattform Daten und Informationen mit entfernten Computern in Echtzeit aus, was eine gleichzeitige Überwachung von Hunderten von Einzelkulturen und automatisierte Kulturstörungen durch willkürlich definierte Steuerung ermöglicht. Algorithmen.
In früheren Arbeiten16wurde die robuste Leistung von eVOLVER in Langzeitexperimenten über hunderte Stunden des Betriebs und seiner Fähigkeit, verschiedene Organismen zu kultivieren, von E. coli und S. cerevisiae bis hin zu undomesticated gezeigt. Mikroben. Es wurden eine Reihe von ausgeprägten Wachstumsselektionsexperimenten durchgeführt, bei denen programmatisch definierte multidimensionale Selektionsverläufe auf eine Reihe von individuellen Kulturbedingungen und die daraus resultierenden zellulären Fitnesslandschaften angewendet wurden. Quantifiziert. Hier ist es das Ziel, eVOLVER-Nutzern eine Beschreibung zu geben, wie das System zum Design und zu solchen Experimenten verwendet werden kann. Als anschauliches Beispiel werden Methoden vorgestellt, die die Fitnesslandschaft von S. cerevisiae Mutanten über einen zweidimensionalen Umweltgradienten aus Temperatur und osmotischem Stress quantifizieren. Das Protokoll führt die Anwender durch die Konfiguration des eVOLVER-Rahmens für dieses Experiment sowohl programmatisch, bei der Verwendung der Software zur Einstellung von kundenspezifischen Trübungs-und Temperaturregelroutinen für jede der 16 parallelen, kontinuierlichen Kulturen, und physikalisch, Durch die Flusseranlage werden Medien unterschiedlicher Salzkonzentrationen entsprechend gestreten. Dieses Protokoll sollte als allgemeine Rubrik für die Konfiguration von eVOLVER dienen, um eine Vielzahl automatisierter kontinuierlicher Kulturexperimente für verschiedene Studien und Disziplinen durchzuführen.

<table><tbody><tr><td>5-Gallonen-Kunststoff-Hedpack mit Kappe</td><td>Midwest Brewing and Winemaking Supplies</td><td>45-56Y8-E2FR</td><td>Für die Abfallsammlung</td></tr><tr><td>a-D(+)-Glukose</td><td>Chem-Impex</td><td>00805</td><td>Für YPD Medium</td></tr><tr><td>Attune NxT Autosampler</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Ermöglicht dem Durchflusszytometer die Entnahme von Proben von 96-Well-Platten</td></tr><tr><td>Attune NxT Durchflusszytometer</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Wird verwendet, um Populationsfraktionen über Einzelzellfluoreszenz</td></tr><tr><td>zu bestimmen Bacto Pepton</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-07-0</td><td>Für YPD Medium</td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2648250</td><td>Für YPD Medium</td></tr><tr><td>Chemikalienbeständige Rohrverschraubung mit Widerhaken, T-Stück für 1/8" Rohr ID, 250 & Grad; F Maximale Temperatur</td><td>McMaster-Carr</td><td>5121K731</td><td>Für die Verzweigung des Medieneingangs</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td>Für YPD Medium</td></tr><tr><td>CLOROX GERMICIDAL Bleach 8.25</td><td>Fisher Scientific</td><td>50371500</td><td>Für die Sterilisation von fluidischen Leitungen</td></tr><tr><td>Kundenspezifischer eVOLVER-Fläschchendeckel</td><td>Der FynchBio-Deckel</td><td></td><td>verfügt über Anschlüsse für die Probenahme und den fluidischen Ein-/Ausgang</td></tr><tr><td>Cycloheximid</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10018301</td><td>Für Probenahmeplatten für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Ethanol, wasserfrei (histologisch)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A405P-4</td><td>Für die Sterilisation von Fluidikleitungen</td></tr><tr><td>eVOLVER Einheit</td><td>FynchBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Spitzen mit verlängerter Länge (Lift Off Rack; 1 bis 200 ul)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-420</td><td>Für die Probenahme</td></tr> <tr><td>von FläschchenFisherbrand Octagon Spinbar Magnetrührstäbchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-57</td><td>Durchmesser: 4,5 mm, Länge, 12 mm</td></tr><tr><td>Fisherbrand Wiederverwendbare Medienflaschen aus Glas mit Verschluss</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB8002000</td><td>Muss mit einem Schlauch ausgestattet werden</td></tr><tr><td>Hochtemperatur-Silikonkautschukschlauch halbklar weiß, Durometer 70A, 1/8" ID, 1/4" OD</td><td>McMaster- Carr</td><td>51135K73</td><td>Für Medienflaschen</td></tr><tr><td>Mac Mini-Apfel</td><td></td><td></td><td>Zum Durchführen des Experiments/Sammeln von Daten</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Fisher</td><td>Scientific BP243820</td><td>Für Durchflusszytometrie-Probenahmeplatten</td></tr><tr><td>Pipetten</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kunststoff-Schnelldreh-Rohrkupplung, Stecker, für 1/16" Stachelrohr ID, Polypropylen</td><td>McMaster- Carr</td><td>51525K141</td><td>Für Medienflaschen</td></tr><tr><td>Kunststoff-Quick-Turn-Rohrkupplung, Stecker, für 5/32" Stachelrohr ID, Polypropylen</td><td>McMaster- Carr</td><td>51525K144</td><td>Für Medienflaschen</td></tr><tr><td>Kunststoff Quick-Turn Rohrkupplung, Steckdosen, für 1/16" Stachelrohr ID, Polypropylen</td><td>McMaster- Carr</td><td>51525K291</td><td>Für Medienflaschen</td></tr><tr><td>Kunststoff Quick-Turn Rohrkupplung, Steckdosen, für 5/32" Stachelrohr ID, Polypropylen</td><td>McMaster- Carr</td><td>51525K294</td><td>Für Medien Flaschen</td></tr><tr><td>SCHRAUBVERSCHLÜSSE, OBEN OFFEN, MIT PTFE-BESCHICHTETEN SILIKONSEPTEN, LAB-PAC, SEPTUM. Schraubgewindegröße: 24-400, GRÜN</td><td>Chemglass</td><td>CG-4910-04</td><td>Kulturfläschchen</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Fsher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Für YPD Medium</td></tr><tr><td>SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate</td><td>Reader Molekulare Geräte</td><td></td><td>Zur Messung von OD600 von Zellkulturen über Nacht</td></tr><tr><td>Nur Fläschchen, Probe, 40 ml, Klar, 28 mm x95 mm, GPI 24-400</td><td>Chemglass</td><td>CG-4902-08</td><td>Kulturfläschchen</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-500</td><td>für YPD-Medium</td></tr></tbody></table>

die entwicklung automatisierter, durchsatzer, kontinuierlicher zellwachstumsexperimente mit evolver

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

Kontinuierliche Kulturmethoden ermöglichen den Anbau von Zellen unter quantitativ kontrollierten Umgebungsbedingungen und sind damit im Großen und Ganzen nützlich, um Fitness-Phenotypen zu messen und unser Verständnis dafür zu verbessern, wie Genotypen durch Selektion gestaltet werden. Die umfangreichen Bemühungen, Nischengeräte für eine kontinuierliche Kultur zu entwickeln und anzuwenden, haben die Vorteile der Durchführung neuer Formen der Zellkulturkontrolle aufgezeigt. Dazu gehören die Definition von kundenspezifischen Selektionsdrücken und der Erhöhung des Durchsatzes für Studien, die von der langfristigen experimentellen Evolution über genomweite Bibliotheksauswahlen bis hin zur Charakterisierung synthetischer Genkreisschreitungen reichen. Um dieser wachsenden Nachfrage gerecht zu werden, wurde kürzlich die eVOLVER-Plattform entwickelt: Eine kontinuierliche Kulturplattform mit einem hohen Maß an Skalierbarkeit, Flexibilität und Automatisierung. eVOLVER bietet eine einzige standardisierende Plattform, die mit minimalem Aufwand konfiguriert und skaliert werden kann, um viele verschiedene Arten von Experimenten mit hohem Durchsatz oder mehrdimensionalen Wachstumsauswahlversuchen durchzuführen. Hier wird ein Protokoll vorgestellt, das den Nutzern des eVOLVER-Rahmens eine Beschreibung zur Konfiguration des Systems zur Durchführung eines maßgeschneiderten, kontinuierlichen Wachstumsversuchs zur Verfügung stellt. Konkret führt das Protokoll die Nutzer dazu, wie das System auf mehrere Selektionsdrücke — Temperatur und Osmolarität programmiert werden kann — über viele eVVER-Vials hinweg, um Fitnesslandschaften von Saccharomyces cerevisiae Mutants bei einer feinen entschluß. Wir zeigen, wie das Gerät sowohl programmatisch konfiguriert werden kann, durch seine Open-Source-Web-basierte Software, als auch physisch, indem wir fluidische und Hardware-Layouts arrangieren. Der Prozess der physikalischen Einrichtung des Geräts, die Programmierung der Kulturroutine, die Überwachung und Interaktion mit dem Experiment in Echtzeit über das Internet, die Probenahme von Vials für die anschließende Offline-Analyse und die Analyse nach dem Experiment werden detailliert beschrieben. Dies soll als Ausgangspunkt für Forscher verschiedener Disziplinen dienen, um eVOLVER bei der Entwicklung eigener komplexer und hochdurchsatzer Zellwachstumsexperimente zur Untersuchung und Manipulation biologischer Systeme einzusetzen.

Das hier beschriebene Protokoll wurde verwendet, um Fitness-Karten für genetische Varianten von S. cerevisiae über einen zweidimensionalen Stressverlauf von Temperatur und Salzgehalt zu erstellen. Konkret haben wir eVOLVER für jede Variantenbelastung verwendet, um paarweise Wettkampffilden gegen einen fluoreszierbaren Referenzstrahl (S. cerevisiae strapazieren BY4741 mit integriertem mNeonGreen-Reporter) in 16 verschiedenen Kombinationen dieser Spannungen (Bild 1). Für Varianten wurden zwei Knockout-Stämme ausgewählt, die jeweils für eine der Stresszustandsachsen empfindlich sein werden: Der "PRX1", der bei hohen Temperaturenmit 20 und -PBS2 bei hohen Fitnessfehlern eine Fitnessdefekte aufweisen soll. Salzkonzentration21. Als Kontrollvariante wurde eine nicht gekennzeichnete Wild-Stamm vom Typ BY4741 verwendet, die ähnlich wie die Referenzspannung auftreten sollte. Insgesamt wurden diese drei 72-Stunden-Wettbewerbsexperimente gleichzeitig in 48 Vials auf drei eVOLVER (16-vial) Geräten durchgeführt, die alle von einem einzigen Computer aus laufen.
Das interaktive Armaturenbrett eVOLVER wird verwendet, um die große Datenmenge zu navigieren, die bei jedem Experiment erzeugt wird (Abbildung 2A). In Abbildung 2Bwerden repräsentative OD-Spuren über alle 16 Ampullen eines einzelnen eVOLVER-Gerätes dargestellt. Jede Spur zeigt ein charakteristisches Sägezahnmuster des Turbidostat-Steuerungsalgorithmus, der das Feedback auf OD nutzt, um Verdünnungen auszulösen und Kulturen in einem engen Dichteumfang zu erhalten (in diesem Fall 0,2-0,3). OD-und Temperaturdaten werden kontinuierlich gemessen, in die Cloud-fähige Datenbank gestreamt und in Echtzeit im interaktiven Armaturenbrett eVOLVER aktualisiert. Aus kontinuierlich gestreuten Daten können übergeordnete Kennzahlen (z.B. Wachstumsrate, kumulierte Generationen) im Armaturenbrett (Abbildung 2C) berechnet und gezeichnet und sogar als Rückkopplungsparameter in verschiedenen Selektionsschemata (z.B. Morbidostat) verwendet werden.
Um Fitness-Karten zu erstellen, messen wir die Geschwindigkeit, mit der der Referenzstrahl die Variantenbelastung übertrifft, indem wir sowohl Strömungszytometrie-Messungen als auch eVOLVER-Wachstumsdaten einbinden. Konkret werden Bevölkerungsfraktionen als das Logikverhältnis von Variantenstraptionen über Referenzstraptionen mittels Strömungszytometriedaten aus jeder Zeit-Punkt-Probe berechnet. Für jede Kultur und jeden Zeitpunkt wird die abgelaufene Anzahl von Generationen aus eVOLVER-Wachstumsraten in jeder Verdünnungszeit interpoliert. Wenn man die Log-Verhältnisse gegen Generationen anzeigt, entstehen qualitative Unterschiede zwischen den Bedingungen (Abbildung 3A). Um die Fitness zu berechnen, passt eine Steigung durch den linearen TeiljedesDiagramms 18, 19,was einen quantitativen Fitnesswert ergibt (sowohl mit Zeichen als auch mit Rate), der beschreibt, wie die Variantenbelastung mit der Referenzbelastung konkurriert ( Abbildung 3B). In diesem Experiment deuten negative Fitnesswerte darauf hin, dass die Variantenbelastung durch den Referenzstrahl übertroffen wird. Die Erstellung von Heizkarten aus allen Fitnessberechnungen ermöglicht die Visualisierung der zweidimensionalen Fitness-Landschaft und offenbart subtile quantitative Leistungsunterschiede zwischen Stämmen und Bedingungen (Abbildung 3C).
Aus den Fitness-Heatmaps geht hervor, dass jede Variante Fitnessfehler aufweist, die sich auf unterschiedliche Weise manifestieren. Die Salzspannung wirkt sich in erster Linie auf hohe Temperaturen aus, aber Salzspannung scheint eine additive Wirkung zu haben, was den Fitnessfehler erhöht. Umgekehrt zeigt die "PBS2" vor allem Fitnessfehler auf, die auf hohe Salzkonzentrationen reagieren, mit minimalen Unterschieden entlang der Temperaturachse. Diese Ergebnisse unterstreichen den Nutzen von hochauflösenden Selektionsexperimenten, insbesondere zur Entschlüsselung von Interaktionen von mehreren Umweltbelastungen, die additive, synergistische oder epistatische Effekte haben könnten.
Schließlich ist zu beachten, dass in einigen Fällen, insbesondere bei schweren Stressbedingungen, Fitnessberechnungen zu übertriebenen oder verzerrten Ergebnissen führen können. Zum Beispiel scheint die PBS2 im 39 ° C/1 M NaCl-Zustand im Verhältnis zum Referenzstrahl einen steilen positiven Hang zu zeigen (Abbildung 3A). Dies wird auf das schlechte Wachstum beider Stämme zurückgeführt, was sich in den wilden Typendaten widerspiegelt und den Nutzen dieser speziellen Metrik in diesem Zustand begrenzt. Eine unzureichende Anzahl von Generationen führt zu 1) einer schlechten Trennung der Zeitpunkte, die die Hanganpassung stört, und 2) Empfindlichkeit gegenüber stochastischen Effekten, die aus der Verzögerung stammen. Während wir uns in dieser Studie nicht dafür entschieden haben, hätten die Echtzeitwachstumsdaten, die eVOLVER während des Experiments gesammelt hat, verwendet werden können, um die Entscheidung zu informieren, das Experiment zu verlängern und mit geringem Aufwand zusätzliche Zeitpunkte für diesen Zustand zu sammeln. In Folgeversuchen konnten auch die Startverhältnisse moduliert werden, um die Länge des linearen Bereiters zu verlängern, bevor die Sättigung eintritt.
 <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig1v3.jpg"> Abbildung 1: Überblick über das eVOLVER-Framework und die experimentelle Gestaltung. (A) eVOLVER ist eine automatisierte, durchgängige Kulturplattform, die eine multiparameterische Kontrolle der Kulturbedingungen ermöglicht. Die Plattform besteht aus Smart Sleeves, in denen die Sensoren und Aktoren zur Steuerung der Kulturverhältnisse untergebracht sind, einem peristaltischen Pumpenfeld für fließende Medien und Abfälle in und aus den Kulturen, einem Touchscreen für die manuelle Interaktion mit dem Gerät und einem Computer. Zur Interaktion mit der Cloud-Infrastruktur, in der Daten von der Plattform gestreamt werden. (B) eVOLVER kann auf verschiedene Weise konfiguriert werden: Körperlich, durch Zell-und Medieneingänge und programmatisch durch die Anpassung der Algorithmen zur Steuerung von Smart Sleeve Culture Vial-Modulen. Dies kann genutzt werden, um multidimensionale Selektion/Umweltverläufe mit hoher Auflösung zu programmieren, wobei die Ausgänge aus physisch gesammelten Zellen zu definierten Zeitpunkten und Echtzeit-Streaming von Kulturdaten bestehen. C) die Konfiguration von eVOLVER, ein Wachstumsfitness-Experiment über einen zweidimensionalen Auswahlverlauf zu führen, der aus Temperatur und osmotischem Stress besteht. eVOLVER Kultur-Vials wurden mit gleichen Proportionen einer Referenz-und Variantenhefe-Sorte gesät. Eine Turbidostat-Routine wurde so programmiert, dass alle Kulturen in exponentieller Phase in einem definierten OD-Fenster gehalten werden (OD 0.2-0,3). Die Temperatur-und Medienbedingungen wurden über das Smart Sleeve Array variiert, um zwei unabhängige Stressverläufe zu bilden. Basismedien bestanden aus YPD (2% Glukose) + 100 μg/mL Carbenicillin + 25 μg/mL Chloramphenicol als Vorsichtsmaßnahme gegen bakterielle Kontamination. Die Medienkompositionen wurden durch die Zugabe von zusätzlichen NaCl auf 0 M, 0,6 M, 0,8 M oder 1,0 M variiert. Vial wurden auf einen von vier Werten programmiert: 30 ° C, 35 ° C, 37 ° C oder 39 ° C. D) Beispiele für die Rohproduktion für Kultur OD und Bevölkerungsfraktionen aus drei getesteten Bedingungen. Das Wettbewerbsexperiment wurde für 72 Stunden, Probenahme von 24 Stunden und anschließend alle 12 Stunden bis zum Abschluss des Experiments beibehalten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig1v3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig2.jpg"> Abbildung 2: eVOLVER Echtzeit-Datenanalyse Armaturenbrett. (A) eVOLVER-Daten werden über Cloud-basierte Software in Echtzeit auf ein interaktives Armaturenbrett übertragen. Durch das Armaturenbrett können Nutzer ihre eigenen Kulturroutinen auf einem vernetzten eVOLVER definieren und initiieren, derzeit Experimente über alle eVOLVER-Geräte überwachen und bei Bedarf experimentelle Bedingungen manuell auf einer individuellen Vial oder einer Reihe von Vials variieren. (B) OD-Spuren für jede Ampulle über die Matrix der Bedingungen, die für die gesamte Experimentildauer getestet wurden. Spuren können in Echtzeit betrachtet werden, um sicherzustellen, dass das Experiment wie gewünscht läuft und nach dem Experiment für die weitere Analyse verwendet wird. C) Wachstumsraten und Zellgenerationen lassen sich aus OD-Spuren im Handumdrehen berechnen, um den experimentellen Fortschritt zu verfolgen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig3.jpg"> Bild 3: Aufbau von Fitnessflächen. (A) Zellpopulation bricht Naturprotokolle (Variante strain/Referenzstamm), die gegen Zellgenerationen gezeichnet sind. Farbe zeigt die Temperatur der Selektion an, während Dashes Salzkonzentrationen unterscheiden. B) Um die relative Fitness der Variante zur Referenzbelastung zu quantifizieren, leitet sich eine Fitnessmetrik aus der Geschwindigkeit ab, mit der sich die Zellpopulationsfraktion über Generationen ändert. Diese Metrik wird aus dem linearen Bereich der Zellfraktion mit mindestens drei Punkten berechnet. (C) Die relativen Fitness-Metriken werden in einer Hitzekarte angezeigt, um eine Fitnessfläche über den ökologischen Stressgradienten zu konstruieren. Die obere rechte Eckbedingung (39 ° C/1.0 M NaCl) für den wilden Typ und die PBS2 sind in dieser Analyse nicht enthalten, da die Kulturen durch unzureichende Generationen gegangen sind (siehe Repräsentative Ergebnisse). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Das eVOLVER-Framework ermöglicht eine durchgängige mikrobielle Kultur mit hoher Auflösung und dynamischer Kontrolle über experimentelle Parameter. Dieses Protokoll zeigt, wie man das System für ein komplexes Fitness-Experiment einsetzt, das die Anwender bei der Programmierung automatisierter Kontrolle über viele einzelne Kulturen, das Messen, Sammeln und Interagieren mit experimentellen Daten in Echtzeit führt.

Die Entwicklung automatisierter, durchsatzer, kontinuierlicher Zellwachstumsexperimente mit eVOLVER

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...

eVOLVER gibt Forschern experimentelle Freiheit, ihre eigenen Kulturwachstumsexperimente mit automatisiertem Feedback zu mehreren Parametern zu definieren und auf jede Größe zu skalieren, die sie benötigen. eVOLVER ist flexibler als andere Geräte. Benutzer können Software in Python sowie die Hardware ganz einfach anpassen, indem sie die intelligenten Hüllen ändern, die Sensoren für jede Kultur enthalten.Das System kann auf den ersten Blick mit mehreren Komponenten und Verbindungen kompliziert erscheinen. Ein visueller Leitfaden gibt Benutzern beim ersten Mal mehr Vertrauen in die Durchführung von Experimenten auf eigene Faust. Die richtige Einrichtung ist von entscheidender Bedeutung.Achten Sie darauf, zu verstehen, was jede Komponente tut. So können Sie bestätigen, dass sie funktionieren. Stellen Sie sicher, dass alles korrekt geroutet und eng verbunden ist.EVOLVER wurde für die aerobe Kultivierung von Bakterien und Hefe unter unterschiedlichen Bedingungen entwickelt, könnte eVOLVER auch für die anaerobe Fermentation oder zur Erhaltung von Säugetierzellen in Suspension modifiziert werden. In diesem Video wird gezeigt, wie Sie ein kontinuierliches Kulturexperiment mit hohem Durchsatz mithilfe der eVOLVER-Plattform einrichten, initialisieren und ausführen. Am Tag vor dem Experiment, bereiten Medien, Fläschchen und Inokulum nach dem Manuskript.In drei großen Bechern, bereiten Sie zwei Becher von 10%Bleichmittel und ein Becher mit 70%Ethanol. Schalten Sie mit den Schaltern am eVOLVER-Gerät das Fünf-Volt-Netzteil am eVOLVER ein, warten Sie fünf Sekunden, und schalten Sie dann das 12-Volt-Netzteil ein. Wenn Sie mehrere Durchstechflaschen aus derselben Medienflasche ausführen, verbinden Sie mehrere Medieneingangszeilen mit Rohrsplittern.Kundenspezifische Schlauchsplitter können mit niedrigeren Komponenten konstruiert werden. Untertauchen Sie die Medieneingangszeilen in den ersten Bleichbecher und die Medien-Efluxlinien im zweiten Bleichbecher. Schließen Sie das nachgeschaltete Ende der Medieneingangsleitungen mit dem zweiten Becher mit den Efluxleitungen an.Legen Sie Abfallleitungen in einen Abfallcarboy. Fügen Sie ein bis zwei Liter Bleichmittel in den Abfall Carboy, um Abfälle während des Experiments entstehen zu sterilisieren. Navigieren Sie über den Touchscreen des eVOLVER zum Setup-Bereich und führen Sie alle Pumpen 20 Sekunden lang aus, um die Flüssigkeitsleitungen mit 10% Bleichmittel zu füllen.Bleichmittel mindestens 30 Minuten in den Leitungen sitzen lassen, um zu sterilisieren. Führen Sie die Pumpen erneut über den Touchscreen aus, bis die Leitungen nicht mehr unterGetaucht sind, und drücken Sie Luft durch die Leitungen, um so viel wie möglich von der Bleiche herauszubekommen. Medieneingangsleitungen in den Ethanolbecher legen, die Leitungen mit Ethanol füllen, mit Luft spülen.Befestigen Sie dann Medieneingangsleitungen mit den unteren Anschlüssen an die Medienflaschen und führen Sie die Pumpen aus, bis die Medien vollständig durch die Leitungen laufen und restliches Ethanol ausspülen. Teilweise sterilisierte Fläschchen in die eVOLVER smart Hülsen einlegen und die Eingangsleitungen an das kurze Zuflussstroh und die Abfallleitungen an den langen Eflux Strohq entsprechend der Farbcodierung anschließen. Passen Sie auf dem eVOLVER-Touchscreen an, um alle Pumpen in 10 Sekunden-Schritten auszuführen, um die Durchstechflaschen mit Medien zu füllen.Stellen Sie sicher, dass efluxpumpen durch visuelle Inspektion effizient Medien durch die Efluxstrohhalme entfernen, um Überläufe zu verhindern. Dann drücken Sie Fläschchen nach unten, bis sie vollständig von der intelligenten Hülse umhüllt sind. Ziehen Sie auf der interaktiven Setup-Seite des eVOLVER-Touchscreens einen Finger über den Touchscreen, oder drücken Sie die Taste Alle auswählen, um alle Durchstechflaschen auszuwählen und die Ausgangstemperaturen auf 30 Grad Celsius und die Rührung auf 10 einzustellen.Geben Sie auf einem Computer das eVOLVER-Gerät an, auf dem das Experiment ausgeführt werden soll. Stellen Sie sicher, dass die gewünschten Kalibrierungseinstellungen ausgewählt wurden. Öffnen Sie das eVOLVER-Dashboard, und navigieren Sie zur Seite Experiment-Manager.Wählen Sie das Basisexperiment im Experiment Navigator-Bedienfeld oder ein vorhandenes Experiment als Startpunkt aus, und klicken Sie auf Klonen. Navigieren Sie zur Seite Experiment editor. Verwenden Sie die Bedienfelder Vial Selector und Parameter Definition, um die Temperatur auf 30 Grad Celsius einzustellen und einen oberen und unteren Schwellenwert von OD für jede Durchstechflasche entsprechend dem experimentellen Design festzulegen.Speichern Sie das Experiment, indem Sie auf Speichern klicken. Klicken Sie dann auf den Pfeil, um zur Experiment-Manager-Seite zurückzukehren, und klicken Sie auf die Schaltfläche Wiedergabe, um sie auszuführen. Sobald das Experiment abgeschlossen ist, navigieren Sie zum Bedienfeld "Echtzeitdaten" im interaktiven Dashboard.Überprüfen Sie für jede Durchstechflasche, ob die OD-Werte bei Null gehalten werden. Durchsuchen Sie die Temperaturdiagramme, um zu überprüfen, ob die Temperaturen bei oder in Richtung 30 Grad Celsius sind. Um das Inokulum vorzubereiten, messen Sie zunächst die OD der Nachtkulturen und berechnen die gewünschte volle Verdünnung für Nachtkulturen unter Annahme eines Fläschchenvolumens von 25 Millilitern und eines gewünschten Start-OD von etwa 0,05.Durch den Probenahmeanschluss das berechnete Inokulumvolumen oder das Gemisch von Inokula. Überprüfen Sie die Diagramme auf dem Dashboard, um festzustellen, ob die OD auf 0,05 ansteigt. Zellwachstum und Durchstechflasche Bedingungen können in Echtzeit überwacht werden, wie das Experiment läuft, so dass der Forscher eingreifen kann, wenn irgendwelche Probleme auftreten.eVOLVER ist eine automatisierte kontinuierliche Kulturplattform, die multiparametergesteuerte Kulturbedingungen ermöglicht. Qualitative Unterschiede wurden zwischen den Wildtyp-, temperaturempfindlichen und salzempfindlichen Gruppen gezeigt, wenn die Log-Verhältnisse gegen Generationen dargestellt wurden, die aus eVOLVER-Wachstumsratendaten interpoliert wurden. Farbe gibt die Temperatur der Selektion an, während Bindestriche Salzkonzentrationen unterscheiden.Eine Neigung, die mit mindestens drei Punkten durch den linearen Teil jedes Diagramms passt, ergibt einen quantitativen Fitnesswert, der beschreibt, wie die Variantendehnung mit der Referenzdehnung konkurriert. Negative Fitnesswerte deuten darauf hin, dass die Variantenbelastung durch die Referenzdehnung übertroffen wird. Überprüfen Sie immer, ob alle Pumpen effizient laufen und dass Flüssigkeitsleitungen frei von Clogs sind.Ein Überlauf kann ein Experiment ruinieren und möglicherweise die intelligenten Ärmel beschädigen. Aus eVOLVER entnommene Proben können anschließend sequenziert werden, um infolge des Experiments auf genomische Veränderungen zu überprüfen. Diese Informationen können verwendet werden, um neue Stämme oder Systeme zu entwickeln.Für Forscher, die Laborentwicklung oder Bibliotheksauswahl verwenden, ist es einfach, in jedem eVOLVER-Experiment eindeutige Selektionsdrucke anzuwenden. Feedback-Steuerung und dynamische Umgebungen sind jetzt auch sehr zugänglich. Der Abfallcarboy wird nach einem Experiment kleine Mengen Bleichmittel und Ethanol enthalten.Wenden Sie sich an Ihren Laborsicherheitskoordinator für die ordnungsgemäße Entsorgung von Abfällen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Wir entwickelten und validierten ein small-footprint Reihe von Miniatur Chemostate aus leicht verfügbaren Teile für niedrigen Kosten gebaut. Physiologische und experimenteller Evolution Ergebnisse waren ähnlich größeres Volumen Chemostate. Die ministat Array bietet eine kompakte, kostengünstige und leicht zugängliche Plattform für traditionelle Chemostatexperimenten, funktionaler Genomik und chemische Screening-Anwendungen.

Design und die Verwendung Multiplexed Chemostat Arrays

Wir haben eine automatisierte Zellkultur und Verhör Plattform für Mikro-Skala-Zell-Stimulation Experimente entwickelt. Die Plattform bietet eine einfache, vielseitige und präzise Kontrolle in den Anbau und die Förderung kleiner Populationen von Zellen und Gewinnen Lysate für molekulare Analysen. Die Plattform wird auch auf Studien, die kostbaren Zellen und / oder Reagenzien geeignet.

Eine vielseitige automatisierte Plattform für Mikro-Skala Handy Stimulation Experimente

Wir beschreiben ein kostengünstiges, konfigurierbares Morbidostat, das die Charakterisierung von Antibiotikaresistenzen durch dynamische Anpassung der Wirkstoffkonzentration ermöglicht. Das Gerät kann mit einer gemultiplexten mikrofluidischen Plattform integriert werden. Der Ansatz kann für Laborstudien zur Antibiotikaresistenz skaliert werden.

Design und die Verwendung eines Low Cost, Automatisierte Morbidostat für Adaptive Evolution der Bakterien unter Antibiotikums Selection

Wir haben eine kontinuierliche Kultivierungsvorrichtung zur Verwendung mit optogenetische Systeme Kulturen von Mikroben zu beleuchten und regelmäßig Bildzellen in dem Abwasser mit einem umgekehrten Mikroskop. Die Kultivierung, Probenahme, Bildgebung und Bildanalyse sind voll automatisiert, so dass dynamische Reaktionen auf Beleuchtung kann über mehrere Tage gemessen werden.

Design und Implementierung eines automatisierten Illuminating, Anzucht und Probenahmesystem für Mikrobielle optogenetische Anwendungen

Ein detailliertes Protokoll für den gleichzeitigen Betrieb von 48 parallel Zellkulturen unter unterschiedlichen Bedingungen in einem Microbioreactor-System wird vorgestellt. Zellprozess Kultur, Ernte und anschließende Antikörper-Titer Analyse werden beschrieben.

Einsatz von Hochdurchsatz-automatisierte Microbioreactor-System für die Produktion des Modells IgG1 in CHO-Zellen

Hier stellen wir ein detailliertes Verfahren zur Ausführung eines Experimentsentwurfs in einem automatisierten Mikrobioreaktor vor, gefolgt von der Zellernte und der Proteinquantifizierung mit einer Protein-A-Säule.

Prozessoptimierung mit automatisierten Mikro-Bioreaktoren mit hohem Durchsatz in der chinesischen Hamster-Ovarialzell-Kultivierung

Dieses Protokoll beschreibt, wie das mikrobielle Mikrotröpfchenkultursystem (MMC) verwendet wird, um eine automatisierte mikrobielle Kultivierung und adaptive Evolution durchzuführen. MMC kann Mikroorganismen automatisch und kontinuierlich kultivieren und subkultivieren und ihr Wachstum online mit relativ hohem Durchsatz und guter Parallelisierung überwachen, wodurch der Arbeits- und Reagenzienverbrauch reduziert wird.

Automatisierte mikrobielle Kultivierung und adaptive Evolution mit mikrobiellem Mikrotröpfchenkultursystem (MMC)

Dieses Protokoll beschreibt, wie das Escherichia coli Long-Term Evolution Experiment (LTEE) durch die Durchführung seiner täglichen Transfers und regelmäßigen Einfrierungen aufrechterhalten werden kann und wie Wettbewerbstests durchgeführt werden, um Fitnessverbesserungen bei evolutionären Bakterien zu messen. Diese Verfahren können als Vorlage für Forscher dienen, die ihre eigenen Experimente zur mikrobiellen Evolution starten.

Tägliche Transfers, Archivierung von Populationen und Fitnessmessung im Langzeit-Evolutionsexperiment mit Escherichia coli

Phagen- und Robotik-unterstützte nahezu kontinuierliche Evolution (PRANCE) ist eine Technik für die schnelle, robuste Proteinevolution. Robotik ermöglicht die Parallelisierung von Experimenten, Echtzeitüberwachung und Feedback-Steuerung.

Ein praktischer Leitfaden für die Phagen- und Robotik-gestützte nahezu kontinuierliche Evolution

Hier stellen wir ein experimentelles Evolutionsprotokoll zur Anpassung bei Thermophilen vor, bei dem kostengünstige, energieeffiziente Tisch-Thermomischer als Inkubatoren verwendet werden. Die Technik wird durch die Charakterisierung der Temperaturanpassung bei Sulfolobus acidocaldarius, einem Archaeon mit einer optimalen Wachstumstemperatur von 75 °C, demonstriert.

Anpassung an den Extremen des Lebens: Experimentelle Evolution mit dem extremophilen Archaeon Sulfolobus acidocaldarius

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur systematischen globalen Optimierung von genetisch kodierten Biosensoren durch automatisierungsgestützte Generierung und Bewertung genetischer Bibliotheken zur Verfügung. Dies wird mit Design-of-Experiment-Methoden gekoppelt, um Experimente zu rationalisieren und die Auswahl genetischer Komponenten zu ermöglichen, um Biosensoren auf bestimmte Designergebnisse abzustimmen.

Effiziente Probenahme von genetisch kodierten Biosensoren Design Space mit einem Design of Experiment- und Automatisierungs-Workflow

Erfahren Sie die Einrichtung automatisierter kontinuierlicher Zellwachstumsexperimente mit dem eVOLVER-System für mikrobielle Kulturen. Diese Methode ermöglicht Echtzeitüberwachung und dynamische Steuerung experimenteller Parameter.

Die Entwicklung automatisierter, durchsatzer, kontinuierlicher Zellwachstumsexperimente mit eVOLVER

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