Name: Eine mikrofluidische Plattform zur Stimulierung von Chondrozyten mit dynamischer Kompression (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie eine pneumatisch aktivierte mikrofluidische Kompressionsplattform für Mechanobiologie-Studien an Wachstumsfugen-Chondrozyten in 3D-Hydrogelkulturen nutzen. Diese kosteneffiziente Methode ermöglicht simultane Kompression mit variierenden Magnituden.

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Wir danken Drs. Christopher Moraes und Stephen A. Morin für ihre Unterstützung bei gerätedesign und -herstellung. Diese Studie wurde durch das Bioengineering for Human Health Stipendium der University of Nebraska-Lincoln (UNL) und des University of Nebraska Medical Center (UNMC) und das Stipendium AR070242 vom NIH/NIAMS unterstützt. Wir danken Janice A. Taylor und James R. Talaska von der Advanced Microscopy Core Facility am University of Nebraska Medical Center für die Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie.

HINWEIS: Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung (PSA) wie Handschuhe und Labormantel für jeden Schritt in diesem Protokoll.
1. Meister formherstellung
HINWEIS: Führen Sie Schritt 1.1 - 1.3 in einer Dunstabzugshaube aus.
<ol><li>Glasbehandlung HINWEIS: Tragen Sie einen Gesichtsschutz, Handschuhe und einen Labormantel für Schritt 1.1.<ol>
<li>Machen Sie Piranha-Lösung (60 ml) durch Mischen von Schwefelsäure(H2SO4) und Wasserstoffperoxid (H2O2) mit einem Volumenverhältnis von 3:1. VORSICHT: Verwenden Sie piranha-Lösung und Aceton aufgrund der Explosionsgefahr nicht in derselben Dunstabzugshaube.</li>
		<li>Legen Sie eine Glasplatte (50,8 mm x 76,2 mm x 1,2 mm) in Piranha-Lösung für 30 min bei 40 °C.</li>
		<li>Spülen Sie die Glasplatte mit entionisiertem Wasser (diH2O).</li>
		<li>Legen Sie die Glasplatte in Aceton bei Raumtemperatur für 10 min.</li>
		<li>Spülen Sie die Glasplatte mit Isopropanol und trocknen Sie sie mit Stickstoff (N2) Gas.</li>
		<li>Backen Sie die Glasplatte bei 200 °C für 20 min auf einer Kochplatte. Alle nachfolgenden Backschritte verwenden eine Kochplatte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>SU-8 Samenschichtbildung auf der Glasplatte<ol>
<li>SU-8 5 mit einer Einwegpipette auf die Glasplatte verteilen, um etwa 2/3 der Plattenoberfläche abzudecken.</li>
		<li>Drehen Sie die Glasplatte mit SU-8 5 Photoresists bei 500 U/min für 35 s (Anfangsspinnzyklus) und dann 2.500 U/min für 40 s (letzter Spinnzyklus) mit einem Spincoater. Alle nachfolgenden Spinbeschichtungsschritte umfassen den gleichen anfänglichen Spinnzyklus.</li>
		<li>Die SU-8 5-beschichtete Glasplatte bei 65 °C für 2 min und dann bei 95 °C 5 min backen.</li>
		<li>Setzen Sie die SU-8 5 beschichtete Glasplatte UV-Licht (60 mW/cm2, Abstand zwischen UV-Lampe und Fotomaske beträgt 20 cm, Gesamtmenge an UV-Lichtenergie = 60 mJ/cm2) für 1 s aus. HINWEIS: Die UV-Belichtungszeit sollte entsprechend der Leistung eines verwendeten UV-Lichts eingestellt werden.</li>
		<li>Backen Sie die SU-8 5 beschichtete Glasplatte bei 65 °C für 2 min und bei 95 °C für 5 min.</li>
		<li>Legen Sie die gebackene Glasplatte für 2 min in den SU-8 Entwickler.</li>
		<li>Das SU-8 5 beschichtete Glas bei 180 °C 20 min backen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>SU-8 KanalmusterFertigung mit Photolithographie (Abbildung 2a Schritt 1-3)<ol>
<li>Gießen Sie SU-8 100 auf die SU-8 5 gesäte Glasplatte, um etwa 2/3 der Oberfläche der Platte zu bedecken.</li>
		<li>Drehen Sie die Glasplatte mit SU-8 100 bei 3.000 U/min für 38 s (ca. 90 x m dick).</li>
		<li>Die SU-8 100 beschichtete Glasplatte bei 65 °C 10 min und dann bei 95 °C 30 min backen. Wenn SU-8 100 nach diesem Eingriff noch klebrig ist, backen Sie die Glasplatte länger bei 95 °C, bis SU-8 100 nicht klebrig wird.</li>
		<li>Legen Sie eine hochauflösende Mikrokanal-Fotomaske (25.400 dpi, siehe Zusatzabbildung 1) auf die SU-8 100 beschichtete Glasplatte und setzen Sie die fotomaskenbedeckte Glasplatte für 4 s UV-Licht (Gesamtmenge uv-Lichtenergie = 240 mJ/cm2) UV-Licht ein. HINWEIS: Die UV-Belichtungszeit sollte entsprechend der Leistung eines verwendeten UV-Lichts eingestellt werden.</li>
		<li>Die Fotomaske von der Glasplatte nehmen und die Glasplatte bei 65 °C für 2 min und dann 95 °C für 20 min backen.</li>
		<li>Bewahren Sie die gebackene Glasplatte in einem Behälter auf, der mit Aluminiumfolie umwickelt ist, um jedes Licht zu blockieren, für die aushärtende Nacht.</li>
		<li>Entwickeln Sie SU-8 100 Kanalmuster auf der Glasplatte im SU-8 Entwickler für 15 min.</li>
		<li>Waschen Sie die SU-8 gemusterte Glasplatte (Masterform) mit Isopropylalkohol und trocknen Sie sie mitN2-Gas. Wenn während dieses Vorgangs weiße Partikel verbleiben, wiederholen Sie Schritt 7 für 5 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Pneumatische Betätigungseinheit
<ol><li>Mikrokanalschicht (Layer 1) HINWEIS: Führen Sie Schritt 2.1.1 - 2.1.2 in einer Dunstabzugshaube aus.<ol>
<li>200 l (Tridecafluor-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorsilan auf einen Deckelschlupf legen und in eine Vakuumkammer mit der Masterform legen.</li>
		<li>Vakuum für 2 min in der Kammer auftragen und 6 h (oder über Nacht) auf die Silanisierung der Form warten.</li>
		<li>Mischen Sie PDMS mit einem Gewichtsverhältnis von 10:1 (Prepolymer:Härtungsmittel) für 5 min. HINWEIS: Alle nachfolgenden PDMS-Gießschritte enthalten das gleiche Gewichtverhältnis von Prepolymer und Härtungsmittel (10:1).</li>
		<li>PDMS auf die Masterform gießen und PDMS 30 min in einer Vakuumkammer entgasen.</li>
		<li>Sandwich PDMS mit einem Stück Transparenzfolie.</li>
		<li>Klemmen Sie die obige Sandwich-Baugruppe mit einer Glasplatte, Schaumstoffpolstern und Plexiglasplatten (Abbildung 2a Schritt 4).</li>
		<li>PDMS im Ofen bei 80 °C 6 h aushärten.</li>
		<li>Isolieren Sie die PDMS-Schicht (Schicht 1) mit dem Transparenzfilm von der Sandwichstruktur (Abbildung 2a Schritt 5).</li>
		<li>Aktivieren Sie Oberflächen der Schicht 1 und einer sauberen Glasplatte (Glasplatte 1; 50,8 mm x 76,2 mm x 1,2 mm) mit einem Plasmareiniger für 1 min. HINWEIS: Die Plasmareinigungszeit kann je nach Leistung eines verwendeten Plasmareinigers variieren.</li>
		<li>Schicht 1 auf Glasplatte 1 kleben und 30 min bei 80 °C in den Ofen stellen.</li>
		<li>Entfernen Sie den Transparenzfilm aus Layer 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dünne PDMS-Membran (Schicht 2)<ol>
<li>Spin Mantel ungehärtetes PDMS auf einer Transparenzfolie bei 1.000 U/min für 1 min, um eine 60 m dicke PDMS-Schicht zu erhalten.</li>
		<li>Teilweise spinbeschichtetes PDMS (Schicht 2) im Ofen bei 80 °C für 20-30 min aushärten.</li>
		<li>Aktivieren Sie Schicht 1 auf Glasplatte 1 und Schicht 2 mit dem Plasmareiniger für 1 min. HINWEIS: Die Plasmareinigungszeit kann je nach Leistung eines verwendeten Plasmareinigers variieren.</li>
		<li>Die Schicht 2 auf Schicht 1 kleben und über Nacht bei 80 °C in den Ofen stellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schlauchblock<ol>
<li>Metallrohre vertikal auf eine Petrischale legen.</li>
		<li>Gießen Sie PDMS vorsichtig in die Schale, um etwa 3/4 der Metallrohre zu untertauchen.</li>
		<li>PDMS im Ofen bei 60 °C 6 h (oder über Nacht) aushärten.</li>
		<li>Schneiden Sie ein Stück PDMS-Block mit einem Metallrohr.</li>
		<li>Schlagen Sie ein Loch auf Layer 2 für den Einlass.</li>
		<li>Aktivieren Sie den PDMS-Block und Layer 2 mit dem Plasmareiniger für 1 min.</li>
		<li>Befestigen Sie den PDMS-Block am Einlassteil von Layer 2 und legen Sie die gesamte Betätigungseinheit über Nacht bei 80 °C in den Ofen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Alginat-Chondrozyten (oder Perle) konstruiert
<ol><li>Aminosilanisierte Glasplatte<ol>
<li>Schneiden Sie eine Glasplatte (50,8 mm x 76,2 mm x 1,2 mm) mit einem Diamantschreiber in zwei halbgroße Glasplatten (50,8 mm x 38,1 mm x 1,2 mm).</li>
		<li>Die Glasplatten in 0,2 M Chlorwasserstoff (HCl) geben und über Nacht sanft (z.B. 55 Umdrehungen pro Minute) schütteln.</li>
		<li>Spülen Sie die Glasplatten mit diH2O.</li>
		<li>Die Glasplatten in 0,1 M Natriumhydroxid (NaOH) 1 h bei 55 Umdrehungen pro Minute schütteln und mit diH2O abspülen.</li>
		<li>Die Glasplatten in 1% (v/v) 3-Aminopropyltrimethoxysilan (APTES) 1 h bei 55 Rpm schütteln und mit diH2O abspülen.</li>
		<li>Trocknen Sie die amino-silanisierten Glasplatten über Nacht in einer Dunstabzugshaube.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Agarose-Gelform für Alginat-Gel-Konstrukte<ol>
<li>5% (w/v) Agarose und 200 mM Calciumchlorid (CaCl2) in diH2O mischen.</li>
		<li>Kochen Sie die Agarose-Gel-Lösung mit einem Mikrowellenherd (oder einer Kochplatte). Die Siedezeit variiert je nach volumender Agarose-Gel-Lösung und der Leistung des Mikrowellenherds (oder der Temperatur der Kochplatte).</li>
		<li>Gießen Sie die gekochte Agarose-Gel-Lösung auf eine Aluminiumform (siehe Zusatzfigur S2), und verschütten Sie sie mit einer Glasplatte.</li>
		<li>Warten Sie 5 min und entbleben Sie das erstarrte Agarose-Gel aus der Aluminiumform.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wachstumsplatte Chondrozyten Ernte<ol>
<li>Isolieren Sie Wachstumsplatten von den Hinterbeinen von neonatalen Mäusen.</li>
		<li>Legen Sie die Wachstumsplatten in 1 ml 0,25% Kollagennase für 3 h in einem Inkubator bei 37 °C und 8% Kohlendioxid(CO2), um die extrazelluläre Matrix (ECM) zu entfernen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die verdaute Probe für 5 min bei 125 x g, um ein Chondrozytenpellet zu machen und Überstand aus der Probe zu entfernen. Hier ist 1 x g die Beschleunigung der Schwerkraft.</li>
		<li>Setzen Sie das Chondrozytenpellet in 1 ml des modifizierten Eagle-Mediums (DMEM) von Dulbecco aus.</li>
		<li>Zählen Sie die Anzahl der Chondrozyten in DMEM mithilfe eines Zellenzählers.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Chondrozyten in DMEM für 5 min bei 125 x g, um ein Chondrozytenpellet wieder herzustellen und Überstand aus der Probe zu entfernen.</li>
		<li>Optional können Sie das Chondrozytenpellet in den Chondrozytenkulturmedien (CCM)34, das 2 M Calcein AM enthält, wieder anhalten und die Probe 30 min bei 37 °C inkubieren. Schritt 3.3.6 wiederholen und auf Schritt 3.3.8 verschieben.</li>
		<li>Setzen Sie das Chondrozytenpellet in einem gewünschten CCM-Volumen aus und halten Sie es vor Gebrauch im Inkubator bei 37 °C und 8%CO2 auf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alginat-Chondrozytenkonstrukte (oder Perlen) (Abbildung 2c)<ol>
<li>Mischen Sie 1,5% (w/v) Alginat in phosphatgepufferter Salzsäure (PBS) mit 5 mg/ml Sulfo-NHS, 10 mg/ml 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-Carbodiimidhydrochlorid (EDC).</li>
		<li>Fügen Sie 8 x 106 Chondrozyten in die 1 ml Alginat-Gel-Lösung [oder fügen Sie 3 l von 1 'm-Durchmesser fluoreszierende Perlen (542/612 nm) in 1 ml Alginat-Gel-Lösung (0,3% (v/v))].</li>
		<li>Legen Sie 150 l der Alginat-Chondrozyten-Lösung (oder Perle) auf die in Schritt 3.1 hergestellte aminosilanisierte Glasplatte.</li>
		<li>Bedecken Sie die Alginat-Gel-Lösung mit der Agarose-Gelform für 3 min.</li>
		<li>Entfernen Sie übermäßige Alginat-Gel-Lösung überfließend aus der Agarose-Gel-Form mit einer Rasierklinge und entfernen Sie die Agarose-Gel-Form. Dann werden zylindrische Alginat-Chondrozyten-Konstrukte (oder Perlen) auf der aminosilanisierten Glasplatte erhalten.</li>
		<li>Die Alginat-Chondrozyten-Konstrukte in Vernetzungslösung (50 mM CaCl2 / 140 mM NaCl in diH2O) für 1 min für weitere Polymerisation platzieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Gerätebaugruppe (Abbildung 2d)
HINWEIS: PDMS-Abstandshalter und 3D-gedruckte Klemmen müssen separat vorbereitet werden.
<ol><li>Suchen Sie vier 1 mm dicke PDMS-Abstandshalter an den vier Ecken der Schicht 2 der Betätigungseinheit.</li>
	<li>Platzieren Sie 700 L CCM, um die Luftkammern von Layer 2 abzudecken.</li>
	<li>Platzieren Sie die Alginat-Chondrozyten-Konstrukte (oder Perlen) auf Layer 2, während Sie die Konstrukte sorgfältig mit den Luftkammern ausrichten.</li>
	<li>Klemmen Sie das Gerät mit 3D-gedruckten Klemmen (Abbildung 1c).</li>
</ol>5. Betätigung des Geräts
<ol><li>Schließen Sie den Auslass einer Luftpumpe (siehe Materialtabelle)mit dem Einlass eines Magnetventils mit einem Siliziumschlauch an.</li>
	<li>Verbinden Sie den Auslass des Magnetventils mit dem Einlass des montierten Geräts mit einem Siliziumschlauch.</li>
	<li>Schließen Sie das Magnetventil mit einem Funktionsgenerator an.</li>
	<li>Manipulieren Sie das Magnetventil mit einer vom Funktionsgenerator erzeugten Rechteckwelle (z.B. 1 Hz).</li>
	<li>Schalten Sie die Luftpumpe ein, um das Gerät pneumatisch zu betätigen.</li>
</ol>6. Bildgebung von Chondrozyten im Gerät
HINWEIS: Um eine gute Bildqualität zu erhalten, können Bildchondrozyten (oder fluoreszierende Perlen) in Alginat-Gel durch Glasplatte 2, weil erweiterte PDMS-Ballons und Luftkammern optische Bilder verzerren können. Wenn ein invertiertes Mikroskop für die Bildgebung verwendet wird, muss das Gerät so eingerichtet werden, dass Glasplatte 2 nach unten zeigt.
<ol><li>Bereiten Sie das Gerät mit Chondrozyten (oder fluoreszierenden Perlen) vor, wie in den vorherigen Abschnitten gezeigt.</li>
	<li>Nehmen Sie z-stackBilder von Chondrozyten (oder fluoreszierenden Perlen) mit einem konfokalen Mikroskop vor bzw. unter Kompression. Wählen Sie eine z-Schrittgröße basierend auf der Schärfentiefe eines verwendeten konfokalen Bildgebungssystems.</li>
	<li>Die Höhe von Chondrozyten (oder einem Alginat-Perlenkonstrukt) kann mit automatischer Bildverarbeitungsmethode gemessen werden, die in früheren Literaturen26,35gezeigt wird.</li>
</ol>

<ol><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+shear+devices+for+quantitative+analysis+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion.</a> Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Um die Auswirkungen der Druckspannung auf Wachstumsplattenchondrozyten zu testen, haben wir das mikrofluidische Chondrozytenkompressionsgerät (Abbildung 1) entwickelt, um verschiedene Druckgrade auf die Chondrozyten im Alginat-Hydrogelgerüst für 3D anzuwenden. Kultur auf hochdurchsatzweise. Um andere Forscher bei der Einführung unseres Geräts oder der Entwicklung ähnlicher Geräte zu unterstützen, haben wir in diesem Protokollartikel Details zu den Schritte zur Geräteherstellung bereitgestell...

Mikroentwickelte Plattformen sind wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung der molekularen, zellulären und Gewebebiologie, da sie eine dynamische Steuerung sowohl der physikalischen als auch der chemischen Mikroumgebungen ermöglichen1,2,3 ,4,5,6,7,8. So können mehrere Hypothesen gleichzeitig streng kontrolliert getestet werden. Im Falle des Wachstumsplattenknorpels gibt es zunehmend Hinweise auf eine wichtige Rolle der Druckspannung bei der Modulation des Knochenwachstums durch Wirkung auf die Wachstumsplatte Knorpel9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. Der Wirkmechanismus der Druckspannung – insbesondere, wie Stress die Bildung von Chondrozytensäulen in der Wachstumsplatte leitet – wird jedoch schlecht verstanden.
Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine pneumatisch betätigende mikrofluidische Chondrozytenkompressionsvorrichtung26 zu schaffen, um Mechanismen der Mechanobiologie in Wachstumsplattenchondrozyten aufzuklären (Abbildung 1a-c). Das Gerät besteht aus zwei Teilen: der pneumatischen Betätigungseinheit und dem Alginat-Gel-Konstrukt. Die mikrofluidische pneumatische Betätigungseinheit wird aus Polydimethylsiloxan (PDMS) auf Basis der Photo- und Softlithographie hergestellt. Diese Einheit enthält ein 5 x 5 Array von dünnen PDMS-Membranballons, die je nach Durchmesser unterschiedlich aufgeblasen werden können. Das Alginat-Gel-Konstrukt besteht aus den Chondrozyten, die in ein 5 x 5-Array von Alginat-Gel-Zylindern eingebettet sind, und die gesamten Alginat-Chondrozyten-Konstrukte werden mit der Betätigungseinheit zusammengesetzt. Die Alginat-Gel-Konstrukte werden durch die pneumatisch aufgeblasenen PDMS-Ballons komprimiert (Abbildung 1b). Das mikrofluidische Gerät kann auf der Grundlage von Unterschieden im PDMS-Ballondurchmesser fünf verschiedene Druckstufen gleichzeitig in einer einzigen Plattform erzeugen. Somit ist ein Hochdurchsatztest der Chondrozytenmechanobiologie unter mehrfachen Kompressionsbedingungen möglich.
Das in diesem Protokoll beschriebene mikrofluidische Gerät hat gegenüber dem herkömmlichen Kompressionsgerät viele Vorteile, wie z. B. externe Fixatoren14,21,23 und makroskopische Kompressionsgeräte16, 19 , 27 , 28 für das Studium der Chondrozyten-Mechanobiologie: 1) Das mikrofluidische Gerät ist kostengünstig, da es ein geringeres Volumen an Proben verbraucht als das makroskopische Kompressionsgerät, 2) Das mikrofluidische Gerät ist zeiteffektiv, da es mehrere Kompressionsbedingungen gleichzeitig, 3) Das mikrofluidische Gerät kann mechanische und chemische Reize kombinieren, indem es einen Konzentrationsgradienten von Chemikalien bildet, der auf der begrenzten Vermischung in Mikrokanälen basiert, und 4) Verschiedene Mikroskopietechniken (Zeitraffer Mikroskopie und Fluoreszenzkonfokalmikroskopie) kann mit dem mikrofluidischen Gerät aus transparentem PDMS aufgetragen werden.
Wir übernahmen und modifizierten die Methode von Moraes et al.7,29, um verschiedene Druckspannungsniveaus in einem einzigen Gerät zu schaffen, um hochdurchsatz-mechanobiologische Studien der Chondrozytenkompression zu ermöglichen. Unser Ansatz eignet sich für Zellen (z.B. Chondrozyten), die eine dreidimensionale (3D) Kulturumgebung benötigen, und für biologische Tests nach dem Komprimieren von Zellen. Obwohl einige mikrofluidische Zellkompressionsgeräte Zellen komprimieren können, die auf zweidimensionalen (2D) Substraten kultiviert sind30,31,32, können sie nicht für Chondrozyten verwendet werden, da 2D-kultivierte Chondrozyten dedifferenziert. Es gibt mikrofluidische Plattformen zum Komprimieren von 3D-kultivierten Zellen in photopolymerisierten Hydrogelen7,33, aber sie sind in der Isolierung von Zellen nach Kompressionsexperimenten begrenzt, da die Isolierung von Zellen von photopolymerisierten Hydrogel ist nicht einfach. Darüber hinaus müssen die Auswirkungen der UV-Exposition (UV) und der Photovernetzung von Initiatoren auf Zellen möglicherweise bewertet werden. Im Gegensatz dazu ermöglicht unsere Methode eine schnelle Isolierung von Zellen nach Kompressionsexperimenten für postbiologische Assays, da Alginathydrogele schnell durch Kalziumchelatoren depolymerisiert werden können. Die detaillierten Methoden zur Geräteherstellung und -charakterisierung werden in diesem Protokoll beschrieben. Abbildung 2zeigt ein kurzes Verfahren zur Herstellung des mikrofluidischen Chondrozyten-Kompressionsgeräts .

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropyl)triethoxysilan (ATPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>741442-100ML</td><td></td></tr><tr><td>(Tridecafluor-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorsilan</td><td>United Chemical Technologies</td><td>T2492-KG</td><td></td></tr><tr><td>Acrylplatte</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K354</td><td></td></tr><tr><td>Luftpumpe</td><td>Schwarzer Precision</td><td>SP 500 EC-LC4.5V DC</td><td>Wir haben das Modell verwendet, das 2015 gekauft wurde. Anfang 2016 wurden das interne Design und die Leistung der Luftpumpe (SP 500 EC-LC) geändert. Auch die Leistung der Luftpumpe hat sich im Laufe der Zeit verändert. Daher sollte der von einer SP 500 EC-LC Luftpumpe erzeugte Luftdruck vor dem Einsatz kalibriert werden.</td></tr><tr><td>Alginatpulver</td><td>FMC Corporation</td><td>Pronova UP MVG</td><td></td></tr><tr><td>Barb Straight Connectors (Metallrohr)</td><td>Pneumadyne</td><td>EB40-250</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Invitrogen</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Gefärbte rote wässrige fluoreszierende Partikel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0100</td><td></td></tr><tr><td>EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>Schaumstoffpolster</td><td>GRAINGER</td><td>Artikel # 5GCE8</td><td></td></tr><tr><td>Funktion / Arbiträrsignalgenerator</td><td>Keysight Technologies</td><td>33210A</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Fisher Chemical</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>Fisher BioReagenzien</td><td>BP2633500</td><td></td></tr><tr><td>Isopropylalkohol</td><td>BDH1174-4LP</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-267-013</td><td></td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxan (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5KG</td><td></td></tr><tr><td>Netzteil</td><td>Keysight Technologies</td><td>E3630A</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Fisher Chemical</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Magnetverteiler</td><td>Pneumadyne</td><td>MSV10-1</td><td></td></tr><tr><td>Magnetventil</td><td>Pneumadyne</td><td>S10MM-30-12-3</td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>Laurell Technologies</td><td>WS-650Mz-23NPPB</td><td></td></tr><tr><td>SU8 Entwickler</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y020100 4000L1PE</td><td></td></tr><tr><td>SU8-100</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y131273 0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>SU8-5</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y131252 0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS (N-Hydroxysulfosuccinimid)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Schwefelsäure</td><td>EMD Millipore</td><td>MSX12445</td><td></td></tr></tbody></table>

eine mikrofluidische plattform zur stimulierung von chondrozyten mit dynamischer kompression

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanische Reize sind dafür bekannt, biologische Funktionen von Zellen und Geweben zu modulieren. Jüngste Studien haben gezeigt, dass Druckstress die Knorpelarchitektur der Wachstumsplatte verändert und zu einer Wachstumsmodulation langer Knochen von Kindern führt. Um die Rolle der Druckspannung beim Knochenwachstum zu bestimmen, haben wir ein mikrofluidisches Gerät entwickelt, das durch pneumatischen Druck betätigt wird, um Wachstumsplattenchondrozyten, die in Alginat-Hydrogel-Zylinder eingebettet sind, dynamisch (oder statisch) zu komprimieren. In diesem Artikel beschreiben wir detaillierte Methoden zum Herstellung und Charakterisieren dieses Geräts. Die Vorteile unseres Protokolls sind: 1) Fünf verschiedene Größen von Druckspannung können auf fünf technischen Replikationen in einer einzigen Plattform erzeugt werden, 2) Es ist einfach, Zellmorphologie über ein herkömmliches Lichtmikroskop zu visualisieren, 3) Zellen können schnell isoliert werden vom Gerät nach der Kompression, um nachgeschaltete Assays zu erleichtern, und 4) Die Plattform kann angewendet werden, um Mechanobiologie jeder Zellart zu studieren, die in Hydrogelen wachsen kann.

Dieser Artikel zeigt detaillierte Schritte der mikrofluidischen Chondrozyten-Kompressionsgerätefertigung (Abbildung 2). Das Gerät enthält 5 x 5 Arrays von zylindrischen Alginat-Chondrozytenkonstrukten, und diese Konstrukte können mit fünf verschiedenen Komprimierungsgrößen komprimiert werden(Abbildung 1, Abbildung 3 und Abbildung 4). Die Höhe des pneumatischen Mikrokanals beträgt ca. 90 m, und die PDMS-...

Dieser Artikel enthält detaillierte Methoden zur Herstellung und Charakterisierung einer pneumatisch betätigten mikrofluidischen Vorrichtung für die Chondrozytenkompression.

Eine mikrofluidische Plattform zur Stimulierung von Chondrozyten mit dynamischer Kompression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Dieses pneumatisch aktivierte mikrofluidische Kompressionsgerät kann verwendet werden, um mechanobiologie in 3D-Hydrogelkulturen von Wachstumsplattenchondrozyten zu studieren. Das mikrofluidische Gerät ist kosten- und zeiteffektiv, da es gleichzeitig mehrere Größen einer Kompression auf kleinen Probenvolumina erzeugen kann und verschiedene mikroskopische Bildgebungen mit dem Gerät angewendet werden können. Unsere Methode kann auch auf das Studium der Mechanobiologie anderer Zelltypen angewendet werden.Um die Mikrokanalschicht einzurichten, mischen Sie zunächst PDMS mit einem Gewichtsverhältnis von 10 Prepolymeren zu einem Härtungsmittel für fünf Minuten. Als nächstes legen Sie die Form auf ein Schaumstoffpad und gießen Sie die Mischung in die Master-Form. Das PDMS 30 Minuten in einer Vakuumkammer entgasen und das entgaste PDMS mit einem Stück Transparenzfolie verdrehen.Klemmen Sie die Sandwich-Baugruppe mit der Glasplatte, Schaumstoffpolstern und Plexiglasplatten. Das PDMS sechs Stunden lang bei 80 Grad Celsius aushärten und die PDMS-Schicht und den Transparenzfilm von der Sandwichstruktur isolieren. Aktivieren Sie die Oberflächen des PDMS und eine saubere Glasplatte mit dem Plasmareiniger für eine Minute, bevor Sie das PDMS 30 Minuten lang auf die Glasplatte im 80-Grad-Celsius-Ofen kleben.Entfernen Sie dann den Transparenzfilm. Zur Herstellung der dünnen PDMS-Membran eine 60 Mikrometer dicke PDMS-Schicht auf einer Transparenzfolie mit 1.000 Umdrehungen pro Minute zu drehen. Das spinbeschichtete PDMS bei 80 Grad Celsius 20 bis 30 Minuten lang teilweise aushärten, bevor der Plasmareiniger die Mikrokanal-PDMS-Schicht auf der Glasplatte und die dünne PDMS-Schicht für eine Minute aktiviert.Dann die dünne PDMS-Membranschicht auf die Mikrokanal-PDMS-Schicht kleben und die Schichten über Nacht in den 80-Grad-Celsius-Ofen legen. Zur Rohrblockzubereitung Metallrohre vertikal auf eine Petrischale legen und ungehärtetes PDMS vorsichtig in die Schale gießen, bis etwa 3/4 der Rohre untergetaucht sind. Nach der Entgasung des PDMS in einer Vakuumkammer für 30 Minuten, härten Sie das PDMS im Ofen bei 60 Grad Celsius für mehr als sechs Stunden aus.Schneiden Sie am Ende des Aushärtungsprozesses ein Stück PDMS-Block mit einem Rohr und stanzen Sie ein Loch in die dünne PDMS-Schicht für den Einlass. Aktivieren Sie den PDMS-Block und die dünne PDMS-Schicht mit dem Plasmareiniger. Nach einer Minute den PDMS-Block am Einlassloch der dünnen PDMS-Schicht befestigen und die gesamte Betätigungseinheit über Nacht bei 80 Grad Celsius in den Ofen stellen.Zur Herstellung von Agarose-Gel-Formen 5%Agarose und 200 Millimolar Calciumchlorid in entionisiertem Wasser mischen und die Agarose-Gel-Lösung bis zum Kochen erhitzen. Gießen Sie die gekochte Agarose-Gel-Lösung in eine Aluminiumform und verschließen Sie die Form mit der Glasplatte. Nach fünf Minuten das erstarrte Agarosegel aus der Aluminiumform entfernen.Platte 150 Mikroliter Alginat-Chondrozyten-Lösung auf die aminosilanisierte Glasplatte und bedecken Sie die Lösung drei Minuten lang mit Agarose-Gelform. Verwenden Sie am Ende der Inkubation eine Rasierklinge, um die übermäßige Alginat-Gel-Lösung zu entfernen und die Agarose-Gelform von der Platte zu entfernen. Dann legen Sie die Alginat-Chondrozyten-Konstrukte in eine Vernetzungslösung mit 50 Millimolar Calciumchlorid und 140 Millimolar-Natriumchlorid in deionisiertem Wasser für eine Minute.Um das Gerät zu montieren, lokalisieren Sie vier ein Millimeter dicke PDMS-Abstandshalter auf die vier Ecken der dünnen PDMS-Schicht der Betätigungseinheit. Bedecken Sie die Luftkammern der dünnen PDMS-Schicht mit 700 MikroliterChdrozytenkulturmedium. Platzieren Sie das Alginat-Chondrozyten-Konstrukt mit einem Stereo-Mikrosope auf der dünnen PDMS-Schicht, wobei Sie darauf achten, die Konstrukte an den Luftkammern auszurichten, und das Gerät mit 3D-gedruckten Klemmen einklemmen.Zur Betätigung des Geräts verwenden Sie ein Stück Siliziumschläuche, um den Auslass einer Luftpumpe mit dem Einlass eines Magnetventils zu verbinden. Verwenden Sie ein zusätzliches Rohrstück, um den Auslass des Magnetventils mit dem Einlass des montierten Geräts zu verbinden. Verbinden Sie das Magnetventil mit einem Funktionsgenerator und verwenden Sie eine vom Funktionsgenerator erzeugte Einhertz-Quadratwelle, um das Magnetventil zu manipulieren.Schalten Sie dann die Luftpumpe ein, um das Gerät pneumatisch zu betätigen. Das mikrofluidische Chondrozyten-Kompressionsgerät enthält fünf mal fünf Arrays zylindrischer Alginat-Chondrozytenkonstrukte, die mit fünf verschiedenen Komprimierungsgrößen komprimiert werden können. In diesem Beispiel wurde die Gelsäule durch die größte PDMS-Ballonumstiegumzahl um 33,8 % in der Höhe komprimiert, und die resultierende Druckdehnung der Gelkonstrukte wurde um etwa 5 % pro 0,2-Millimeter-Schritt und dem PDMS-Ballondurchmesser erhöht.Die komprimive Verformung der Chondrozyten wurde durch DieAbbildung der Zellen in einem 613 mal 613 durch 40 bis 55 Mikrometer Volumen in der Nähe des Gelkonstruktzentrums bestimmt. Hier wird ein Bild einer Chondrozyte gezeigt, die durch den größten PDMS-Ballon um 16% komprimiert wurde. In diesem Diagramm kann die Verteilung der gemessenen Zellkompressionsdehnungswerte beobachtet werden.In dieser Analyse wurden die Zellen durch größere PDMS-Ballons insgesamt stärker komprimiert. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die Mengen an Alginat-Gel und Chondrozytenkompression durch den Durchmesser der PDMS-Ballons unter einem konstanten Druck von 14 Kilopascal gesteuert werden. Um die Wiederholbarkeit der Geräteleistung zu gewährleisten, ist die Erstellung einer dünnen PDMS-Membran mit konstanter Dicke und Elastizität von entscheidender Bedeutung.Nach diesem Verfahren können verschiedene biologische Assays wie Immunfluoreszenz und In-situ-Hybridisierung durchgeführt werden. Mit dieser Technik können viele Fragen zur Mechanotransduktion in Wachstumsplatten oder Gelenkchdrozyten beantwortet werden.

a-microfluidic-platform-for-stimulating-chondrocytes-with-dynamic

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

In diesem Protokoll, zeigen wir die Herstellung eines Mikroaktor Reihe von vertikal versetzt zum Thema, die die Technologie basiert, und wie diese Basistechnologie können modifiziert werden, um High-Throughput-mechanisch dynamischen Zellkultur in beiden zweidimensionalen und dreidimensionalen Kultur durchzuführen Paradigmen.

Mikrofabrizierten Plattformen für Mechanisch Dynamische Cell Culture

Ein 3D-System zur Kultivierung menschlichen Chondrozyten in ein hohes Maß an Gelenkflüssigkeit beschrieben. Synovialflüssigkeit spiegelt den natürlichen Mikroumgebung für Gelenkknorpel, und kann leicht erreicht werden und gespeichert werden. Dieses System kann daher für die Untersuchung Knorpelregeneration und zum Screening von Therapeutika zur Behandlung von Arthritis verwendet werden.

Ein 3D-System für Züchtung menschlichen Chondrozyten in der Synovialflüssigkeit

Die Biosynthese von knorpeligen extrazellulären Matrix durch Chondrocyten können durch Einwirkung mechanischer Reize beeinflußt werden. Diese Methode beschreibt die Technik der Anwendung dynamisch Druckspannungen zu Chondrozyten in 3D-Konstrukte und die Auswertung der induzierten Veränderungen in Chondrozytenmetabolismus verkapselt.

Mechanische Stimulation der Chondrozyten-Agarose Hydrogele

Wir haben eine neuartige mechanische Belastung Bioreaktor uniaxialen oder biaxialen mechanischen Belastung zu einer Knorpel Biokomposit können vor der Transplantation in eine Anwendung Gelenkknorpeldefekt.

Entwurf eines Biaxiale Mechanische Belastung Bioreaktor für Tissue Engineering

Die Knorpelreparatur stellt eine ungelöste medizinische Herausforderung dar und zellbasierte Ansätze zur Entwicklung von menschlichem Gelenkknorpel sind eine vielversprechende Lösung. Hier beschreiben wir dreidimensionale (3D) biomimetische Hydrogele als ideales Werkzeug für die Expansion und Reifung menschlicher Gelenkchondrozyten.

3D-Hydrogel Scaffolds für Articular Chondrozyten-Kultur und Knorpel-Generation

Chondrogenese aus Stammzellen erfordert Feinabstimmung der Kulturbedingungen. Hier präsentieren wir einen magnetischen Ansatz für Zellen Kondensation, ein wesentlicher Schritt Chondrogenese zu initiieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass dynamische Reifung in einem Bioreaktor mechanische Stimulation auf die Zellkonstrukte und verbessert knorpelige extrazelluläre Matrixproduktion gilt.

3D Magnetic Stem Cell Aggregation und Bioreactor Ausreifung für Knorpelregeneration

Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Bestimmung der räumlichen Ausdehnung der Zelle Verletzung/Tod auf die Gelenkfläche des intakten murinen Gelenke nach Anwendung der kontrollierten mechanischen Belastungen oder Auswirkungen. Diese Methode kann verwendet werden, um zu untersuchen, wie Arthrose, genetische Faktoren und/oder verschiedenen laden-Therapien die Verwundbarkeit der in Situ Chondrozyten auswirken.

Echtzeit-Visualisierung und Analyse der Knorpelzelltransplantation Verletzungen aufgrund der mechanischen Belastung in völlig intakt murinen Knorpel Explantaten

Hier stellen wir Protokolle zur Analyse der Knochenumgestaltung innerhalb einer Lab-on-a-Chip-Plattform vor. Eine 3D-gedruckte mechanische Ladevorrichtung kann mit der Plattform gekoppelt werden, um osteozyte Mechanostransduktion durch Verformung der zellulären Matrix zu induzieren. Die Plattform kann auch verwendet werden, um Knochen-Remodeling funktionelle Ergebnisse von Osteoklasten und Osteoblasten (Resorption/Bildung) zu quantifizieren.

Eine Lab-On-A-Chip-Plattform zur Stimulierung der Osteozyten-Mechanotransduktion und zur Analyse der funktionellen Ergebnisse des Knochenumbaus

Wir stellen detaillierte Methoden zur Generierung von vier Gewebetypen aus humanen mesenchymalen Stammzellen vor, die zur Rekapitulation von Knorpel, Knochen, Fettpolster und Synovia im menschlichen Kniegelenk verwendet werden. Diese vier Gewebe werden in einen maßgeschneiderten Bioreaktor integriert und durch Mikrofluidik miteinander verbunden, so dass ein Kniegelenk-on-a-Chip entsteht.

Erstellung eines Kniegelenk-on-a-Chips zur Modellierung von Gelenkerkrankungen und zur Erprobung von Medikamenten

Diese Studie beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von chondrozytären Sphäroiden, indem Zellen unter Verwendung der Schwerkraft unter Bedingungen mit geringer Adhäsion zu Sphäroiden aggregiert werden, gefolgt von der Kultivierung der resultierenden Sphäroide in Mini-Bioreaktoren.

Erzeugung von Sphäroiden aus verschiedenen Chondrozyten unter Verwendung von niedrigadhäsiven Bedingungen unter Schwerkraft und selbstgemachten Mini-Bioreaktoren

Erfahren Sie, wie Sie eine pneumatisch aktivierte mikrofluidische Kompressionsplattform für Mechanobiologie-Studien an Wachstumsfugen-Chondrozyten in 3D-Hydrogelkulturen nutzen. Diese kosteneffiziente Methode ermöglicht simultane Kompression mit variierenden Magnituden.

Eine mikrofluidische Plattform zur Stimulierung von Chondrozyten mit dynamischer Kompression

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