Name: Verwendung der wirbellosen Galleria mellonella als Infektionsmodell zur Untersuchung des Mycobacterium tuberculosis Complex (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Erfahren Sie die Verwendung von Galleria mellonella als alternatives Infektionsmodell zur Tuberkuloseforschung mit Mycobacterium bovis BCG lux. Diese ethisch vertretbare Methode reduziert Säugetiermodelle und ermöglicht effizientes Drug Screening.

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Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse des Biotechnology and Biological Science Research Council (BBSRC) unterstützt, das PRL und YL (BB/P001262/1) und dem National Center for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs) an PRL, SMN, BDR und YL (NC/R001596/1).

HINWEIS: Alle nachstehend beschriebenen Arbeiten sind in einem CL2-Labor innerhalb eines mikrobiologischen Sicherheitsschranks der Klasse 2 (MSC) gemäß den örtlichen Gesundheits- und Sicherheitsrichtlinien durchzuführen.
1. Vorbereitung von M. bovis BCG lux für Infektionen
<ol><li>Auftauen eines gefrorenen 1,2 ml Glycerins (15%) Bestand von M. bovis BCG lux, dem Montrealer Impfstoffstamm, der mit dem Shuttle-Plasmid pSMT1 transformiert wurde, das die LuxAB-Gene von Vibrio harveyi trägt, die für das Luciferase-Enzym19kodieren.</li>
	<li>Impfung 15 ml Middlebrook 7H9 Brühe mit 0,2% Glycerin, 10% Albumin, Dextrose, Kataalase (ADC) Anreicherung und 50 g/ml Hygromycin mit einem aufgetauten 1,2 ml Aliquot von BCG lux, in einem gekennzeichneten 250 mL Erlenmeyer Kolben.</li>
	<li>Den Kolben in einen versiegelten Biosicherheitsbehälter geben und bei 37 °C in einem Orbital-Shaker-Inkubator bei 220 U/min für 72 h (oder bis die Kultur die Wachstumsphase erreicht) inkubieren.</li>
	<li>Überprüfen Sie das Wachstum der BCG-Lux-Kultur, indem Sie 1:10 Verdünnungen der Kultur in Luminometer-Röhren mit Phosphatgepufferter Saline (PBS, pH 7,4, 0,01 M Phosphatpuffer, 0,0027 M Kaliumchlorid und 0,137 M Natriumchlorid) in duplizierter Verwendung vorbereiten. Vortex, und laden Sie die Luminometer-Röhren in das Luminometer und messen Sie die Biolumineszenz (relative Lichteinheit [RLU]/mL) mit n-Decylaldehyd als Substrat (1% v/v in absolutem Ethanol)20. HINWEIS: Das Verhältnis der RLU/Kolonie bildenden Einheiten (CFU) wurde zuvor auf 3:1 festgelegt, als BCG lux in vitro in Middlebrook 7H9 Brühe20angebaut wurde.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Kultur bei 2.175 x g für 10 min bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pellet und den Überstand in ein geeignetes Desinfektionsmittel mit bekannter mykobakterizidischer Aktivität zu entsorgen. Entsorgen Sie alle Kulturabfälle mit Desinfektionsmitteln, die für Mykobakterien geeignet sind, und folgen Sie den örtlichen Richtlinien.</li>
	<li>Waschen Sie das Zellpellet zweimal in PBS mit 0,05% Polysorbat 80 (PBS-T), um bakterielle Verklumpung zu verhindern.</li>
	<li>Nach der Endwäsche, Dekant-Abfallüberstand, setzen Sie das mykobakterielle Zellpellet in PBS-T wieder auf und verdünnen Sie die mykobakterielle Suspension mit RLU-Messungen auf die gewünschte Zelldichte.</li>
	<li>Mit PBS-T die zehnfache serielle Verdünnung des Inokulums in 24-Well-Platten vorbereiten. Plate out 10 l auf Middlebrook 7H11 Agar-Platten (0,5% Glycerin, 50 g/mL Hygromycin, 10% Ölsäure, Albumin, Dextrose, Kataalase [OADC]) in dupliziert, um Inokulum CFU-Zahlen aufzuzählen.</li>
</ol>2. Zubereitung von G. mellonella Larven
<ol><li>Kaufen Sie die letzten Instar-Larven aus geeigneten Quellen und halten Sie die Larven bei der Ankunft bei 18 °C und verwenden Sie sie innerhalb von 1 Woche nach dem Kauf. Alternativ können Larven nach dem Protokoll von Jojao et al.21selbst gezüchtet werden. Entsorgen Sie bei gekauften Larven alle toten, verfärbten oder verpupten Larven vor der Lagerung. HINWEIS: Verpupatierende Larven sind morphologisch von den letzten Insternlarven unterscheidbar.</li>
	<li>Identifizieren und wählen Sie gesunde Larven für Experimente, basierend auf gleichmäßiger Cremefarbe mit wenig bis gar keiner Verfärbung (Melanisierung), Größe (2 x 3 cm Länge), Gewicht (ca. 250 mg), mit einem hohen Maß an Beweglichkeit und besitzen die Fähigkeit, richtig sich selbst, wenn sie umgedreht werden.</li>
	<li>Zählen Sie die gesunden Larven (mindestens 20 bis 30 pro Gruppe) sorgfältig in eine Petrischale (94/15 mm), die mit einer Schicht Filterpapier (94/15 mm) ausgekleidet ist, indem Sie eine stumpfe Pinzette verwenden, um die Kontamination zu minimieren und bei Raumtemperatur im Dunkeln bis zum Gebrauch aufzubewahren.</li>
</ol>3. Infizieren von G. mellonella mit BCG lux
<ol><li>Minimieren Sie die Unordnung innerhalb des MSC, um das Risiko von Kontaminationen und Nadelstichverletzungen zu reduzieren.</li>
	<li>Bereiten Sie die Injektionsplattform vor, indem Sie ein kreisförmiges Filterpapier (94 mm) auf eine flache erhöhte Oberfläche kleben. Weiche oder harte Oberflächen können verwendet werden und sind vollständig von der Benutzerpräferenz abhängig, z. B. Pipettenkastendeckel oder ein Nylon-Scheuerschwamm.</li>
	<li>Sterilisieren Sie eine 25-L-Mikrospritze (25 g) durch Ansaugung von 3 Volumen von 70% Ethanol und weitere Spülung mit 3 Volumen sterilen PBS-T.</li>
	<li>Aspirieren Sie 10 l BCG Lux Inokulum (in Abschnitt 1) oder PBS-T in die sterilisierte 25-L-Mikrospritze. Verwenden Sie eine separate Spritze für die PBS-T-Negativkontrolle. HINWEIS: Setzen Sie das BCG lux inoculum nach 10 Injektionen aus, um eine gleichmäßige Zellsuspension zu gewährleisten.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Pinzette, um eine Larve aufzunehmen und auf die Injektionsplattform zu legen.</li>
	<li>Auf der Plattform, kippen Sie die Larve auf den Rücken und immobilisieren, indem Sie den Kopf und Schwanz mit der Pinzette zu sichern. Suchen Sie das letzte linke Probe, das vom Kopf der Larve nach unten zählt, und legen Sie die Spitze der Nadel (5 x 6 mm) vorsichtig in einem Winkel von 10 bis 20° auf die horizontale Ebene ein. HINWEIS: Kurze und schmale Pinzetten ermöglichen eine einfache Immobilisierung bei minimalem Larvenstress. Achten Sie darauf, nicht über eindringen, die den Darm punktieren und verursachen Nicht-BCG Lux spezifische Melanisierung oder Tod.</li>
	<li>Zählen Sie die infizierten Larven in eine Petrischale, die mit einer Schicht Filterpapier ausgekleidet ist, eine einzelne 90 mm Petrischale kann bis zu 30 Larven aufnehmen.</li>
	<li>Bewahren Sie die Petrischale mit den Larven in einer belüfteten oder nicht versiegeltendunklen Box in einem Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2 auf.</li>
</ol>4. Überwachung des Überlebens von G. mellonella nach der Infektion
<ol><li>Überwachen Sie im Laufe des Zeitverlaufs alle 24 h das Überleben der Larven. Larven gelten als tot, wenn sie sich nicht als Reaktion auf Berührung bewegen.</li>
</ol>5. Messung der In-Vivo-Belastung von BCG lux in G. mellonella
<ol><li>Wählen Sie zu jedem Zeitpunkt nach dem Zufallsprinzip fünf infizierte Larven aus, die zuvor in Abschnitt 3 hergestellt wurden, und sterilisieren Sie die Larvenoberflächen vorsichtig mit Wattestäbchen, die in 70 % Ethanol getränkt sind. HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, wenn Larvenhomogenat für die mykobakterielle KBE-Enumeration als nicht sterilisierte Larven kontaminiert werden kann.</li>
	<li>Die Larven einzeln in 2 ml Lysing-Matrix-Röhrchen geben, die 800 l steriles PBS enthalten.</li>
	<li>Homogenisieren Sie die Larven mit einem Homogenisator für 60 s bei 6,0 m/s.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Lysing-Rohre bei 3.500 x g für 5 s, um Homogenat aus den Deckeln zu entfernen, und dekannieren Sie das Homogenat sorgfältig einzeln in sterile Luminometerröhren. HINWEIS: Achten Sie bei der CFU-Enumeration (Schritt 5.7) darauf, 100 l Homogenat in einem sterilen 1,5 ml Reaktionsrohr zu reservieren.</li>
	<li>Stellen Sie alle verbleibenden Homogenate wieder her, indem Sie die Lysing-Matrixrohre mit 1 ml PBS-T und Pipette in die entsprechenden Luminometer-Rohre waschen.</li>
	<li>Wirbeln Sie die Luminometerröhren und messen Sie die Biolumineszenz der zuvor in Schritt 1.4 beschriebenen Homogenate.</li>
	<li>Mit PBS-T die zehnfache serielle Verdünnung des Homogenats in 24-Well-Kulturplatten vorbereiten. Verfestigen Sie 10 l der Verdünnung auf Middlebrook 7H11 Agarplatten, die 0,5 % Glycerin, 50 g/ml Hygromycin, 10 % OADC und 20 g/ml Piperacillin enthalten, um das RLU/CFU-Verhältnis von BCG Lux nach in vivo-Infektion zu bestimmen. HINWEIS: Piperacillin eliminiert native G. mellonella Mikrobiota mit minimaler Wachstumshemmung von BCG lux16.</li>
</ol>6. Statistische Analyse
<ol><li>Zeichnen Sie die Kaplan-Meier-Überlebenskurve anhand der gesammelten Daten und führen Sie den Mantel-Cox(Log-Rank)-Test durch, um die Signifikanz des Ergebnisses zu bestimmen, wobei *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 und ****p < 0.0001.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Verwendung von G. mellonella als Infektionsmodell wurde für eine Reihe von bakteriellen und Pilzpathogenen für die Untersuchung von Virulenz, Wirt-Pathogen-Interaktion, und als Bildschirm für neuartige Therapeutika10,22etabliert. Die folgende Diskussion basiert auf dem experimentellen Verfahren zur Verwendung von G. mellonella als Infektionsmodell für die MTBC.
Die Gesundheit der naiven Larven vor dem Exp...

Tuberkulose (TB) stellt eine große Bedrohung für die globale öffentliche Gesundheit dar, mit 9 Millionen neuen Fällen pro Jahr und 1,5 Millionen Todesfällen1. Darüber hinaus wird geschätzt, dass ein Viertel der Weltbevölkerung mit dem Erreger der Krankheit infiziert ist, Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Unter der infizierten Bevölkerung werden 5 bis 10 % im Laufe ihres Lebens eine aktive TB-Krankheit entwickeln. Darüber hinaus stellt das Aufkommen und die Ausbreitung von multiresistentem (MDR) und extensiv-medikamentösem (XDR) resistentem Mtb eine ernste Bedrohung für die Seuchenbekämpfung dar, wobei 123 Länder mindestens einen XDR-Fallmelden 1. Die Behandlung von TB erfordert einen Cocktail von mindestens vier antimykobakteriellen Medikamenten, von denen Isoniazid und Rifampicin für eine Mindestdauer von sechs Monaten verschrieben werden; Behandlung ist oft mit komplexen Nebenwirkungen und Toxizitäten verbunden. Der Schutz vor dem einzigen zugelassenen Impfstoff gegen TB, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), ist variabel2. Ein unvollständiges Verständnis der Pathogenese von TB behindert die Entwicklung neuer Therapie- und Impfstrategien erheblich.
Seit Jahrzehnten sind Tierinfektionsmodelle für die TB-Forschung von entscheidender Bedeutung, um die grundlegende Pathogenese und die Wirtsreaktion auf Infektionen zu verstehen und neuartige antimykobakterielle Wirkstoffe, Immuntherapeutika und neue Impfstoffkandidaten zu bewerten3, 4. Die Forschung mit Tierinfektionsmodellen von TB ist jedoch notorisch schwierig, da die Pathogenese und das Fortschreiten der TB-Infektion komplex sind und es kein einzelnes Tiermodell gibt, das das gesamte Spektrum und wichtige Merkmale der Krankheit imitiert5 ,6. Darüber hinaus sind Tierversuche teuer, zeitaufwändig und erfordern eine vollständige ethische Rechtfertigung. Dennoch wurden Tierinfektionsmodelle von TB bei nichtmenschlichen Primaten (z. B. Makaken), Meerschweinchen, Kaninchen, Rindern, Schweinen, Mäusen und Zebrafischen beschrieben, wobei jeder seine Einschränkungenhat 3,4. Das murine Modell ist das am häufigsten verwendete Modell aufgrund von Kosten, Verfügbarkeit von inzuchtlinien, Reproduzierbarkeit der Infektion und Fülle von immunologischen Reagenzien. Sie bilden jedoch in der Regel keine Granulome, die mit Hypoxiegebieten assoziiert sind, die für eine latente Tuberkuloseinfektion (LTBI) charakteristisch sind (LTBI)6. Meerschweinchen sind sehr anfällig für Mtb-Infektionen, mit Pathologie und frühe Granulombildung ähnlich denen beim Menschen, und sind weit verbreitet in Impfstofftests verwendet; doch der Mangel an immunologischen Reagenzien behindert ihre Verwendung als Infektionsmodell7. Zebrafische eignen sich aufgrund ihrer geringen Größe, schnellen Fortpflanzung und fortgeschrittenen genetischen Werkzeuge für großangelegte Screenings in präklinischen Studien im Frühstadium, sind aber anatomisch und physiologisch verschieden vom Menschen und nur anfällig für Mycobacterium marinum Infektion3. Die Tiermodelle, die der menschlichen Mtb-Infektion am ehesten ähneln, sind nichtmenschliche Primaten (z.B. der Makaken), aber sie sind teuer und haben erhebliche ethische und praktische Überlegungen, die ihre Verwendung erheblich einschränkt8.
Die Insektenlarven der größeren Wachsmotte oder Wabenmotte,Galleria mellonella, sind als Infektionsmodell für eine Vielzahl von bakteriellen und Pilzpathogenen9und als Bildschirm für neuartige antimikrobielle Wirkstoffkandidaten immer beliebter geworden. 10. G. mellonella ist ein erfolgreiches Wirbellosenmodell aufgrund seines ausgeklügelten angeborenen Immunsystems (bestehend aus zellulären und humoralen Abwehrmaßnahmen), das einen hohen Grad an struktureller und funktioneller Ähnlichkeit mit dem von Wirbeltieren teilt11 . Dazu gehören Immunmechanismen wie die Phagozytose von Krankheitserregern durch Hämozyten (funktionell ähnlich wie Säugetiermakrophagen und Neutrophile)12,13, die Produktion und Zirkulation von antimikrobiellen Peptiden (AMPs) und Komplement-ähnliche Proteine innerhalb der Hämolymphe (analog zum Säugetierblut) von G. mellonella11. Weitere Vorteile9,14,15 von G. mellonella Larven als Modell sind 1) ihre große Größe (20 x 30 mm), die eine einfache Manipulation und Infektion ermöglicht, sowie die Sammlung von Gewebe und Hämolymphe für Analysen, 2) einfache Wartung bei 37 °C, kompatibel zur Untersuchung menschlicher Krankheitserreger, 3) präzise Injektion ohne Anästhesie, 4) Wirksamkeit antimikrobieller Wirkstoffe kann mit weniger Wirkstoff zur Bewertung beurteilt werden, 5) Mangel an ethische Zwänge im Vergleich zur Verwendung von Säugetieren, 6) große Gruppengrößen können im Vergleich zu Tiermodellen verwendet werden, die eine größere Reproduzierbarkeit ermöglichen, und 7) kürzere Zeiten für Infektionsexperimente sind erforderlich.
In einer aktuellen Studie haben wir gezeigt, dass G. mellonella als neuartiges Infektionsmodell zur Untersuchung der Pathogenese von Infektionen durch biolumineszierende M. bovis BCG lux, eine genetisch veränderte Version des Impfstoffstamms und des Mtb-Komplexes (MTBC)16. Während G. mellonella bisher als Infektionsmodell für nicht-tuberkulöse Mykobakterien (NTM) verwendet wurde, sind vor allem M. marinum und Mycobacterium abscessus17,18, Studien mit MTBC auf die von Li et al.16. Biolumineszierende nichtpathogene mykobakterielle Stämme, die auf Containment-Ebene (CL) 2 als Ersatz für Mtb eingesetzt werden können, bieten die Vorteile von Sicherheit und Praktikabilität gegenüber pathogenen Mykobakterien. Nach der Infektion mit BCG luxbeginnen Larven, frühe granulomähnliche Strukturen zu entwickeln, die wertvolle Einblicke in die Rolle der angeborenen Immunität bei der Etablierung einer TB-Infektion bieten könnten16. Darüber hinaus hat dieses einfache Modell für wirbellose Infektionen das Potenzial, eine schnelle, kostengünstige und zuverlässige Bewertung der TB-Pathogenese zu ermöglichen, die eine kontrollierte Herausforderung und mehrere Replikationen zur Reproduzierbarkeit umfasst. Darüber hinaus hat das Modell das Potenzial, in der frühen Entwicklung neue Anti-TB-Medikamente und Impfstoffkandidaten zu testen, wodurch die Gesamtzahl der Versuchstiere reduziert wird. Die Fähigkeit, Veränderungen in der Wirts- und Pathogenstruktur, Transkriptom und Proteom zu messen, um Arzneimittelziele zu bestimmen und Wirkmechanismen neuartiger Medikamente und therapeutischer Impfstoffe zu bewerten, ist ebenfalls von Vorteil.
Hier beschreiben wir die experimentellen Protokolle zur Herstellung eines biolumineszierenden M. bovis BCG lux inoculum und G. mellonella larven für mykobakterielle Infektionen, sowie die Bestimmung von Larven und mykobakteriellen Überleben als Reaktion auf eine Infektion.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Reaktionsgefäß (Eppendorf)</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td> 20, <td></td></tr><tr><td>200 und 1.000 &micro; L Pipette und filtrierte Spitzen</td><td>Jeder Lieferant</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Kulturplatte</td><td>Greiner</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Pipetten und Pipettenjunge</td><td>Jeder Lieferant</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>3 Fächer Petrischale (94/15 mm)</td><td>Greiner</td><td>637102</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Jeder Lieferant</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Sicherheitsschrank der Klasse II</td><td>Jeder Lieferant</td><td>n/ ein</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyerkolben mit belüftetem Deckel (250 mL)</td><td>Corning</td><td>CLS40183</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (>99,7%)</td><td>VWR</td><td>208221.321</td><td></td></tr><tr><td>Galleria mellonella (250 pro Stück)</td><td>Livefood Direct UK</td><td>W250</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5150</td><td></td></tr><tr><td>Homogenisator (FastPrep-24 5G)</td><td>MP Biomedicals</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Corning</td><td>30-240CR</td><td></td></tr><tr><td>Luminometer (Autolumat LB 953)</td><td>Berthold</td><td>34622</td><td></td></tr><tr><td>Luminometer Röhren</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Lysing Matrix (S, 2,0 mL)</td><td>MP Biomedicals</td><td>116925500</td><td></td></tr><tr><td>Micro Spritze (25 & Mikro; L, 25 G)</td><td>SGE</td><td>3000</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Alle Lieferanten</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H11 agar</td><td>BD Bioscience</td><td>283810</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 Bouillon</td><td>BD Bioscience</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook ADC Anreicherung</td><td>BD Bioscience</td><td>212352</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook OADC Anreicherung</td><td>BD Bioscience</td><td>212240</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium bovis BCG lux</td><td>Various</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>n-Decylaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7384-100G</td><td></td></tr><tr><td>Orbital-Schüttelinkubator</td><td>Beliebiger Lieferant</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbat 80 (Tween-80)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8074-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Kleine Schachtel</td><td>Jeder Lieferant n</td><td>/a</td><td>dunkle, belüftete oder nicht versiegelte Box empfohlen</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Jeder Lieferant</td><td>n/a</td><td>Kurze und schmale Pinzette/Blunt lange Pinzette</td></tr><tr><td>Winterm (V1.08)</td><td>Berthold</td><td>n/a</td><td>Programm LB953. TTB</td></tr><tr><td>Petrischale (94/15 mm)</td><td>Greiner</td><td>633181</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier (94 mm)</td><td>Alle Lieferanten</td><td>n/a</td><td>Passend zuschneiden</td></tr></tbody></table>

verwendung der wirbellosen galleria mellonella als infektionsmodell zur untersuchung des mycobacterium tuberculosis complex

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Tuberkulose ist die weltweit führende Ursache für die Sterblichkeit von Infektionskrankheiten und etwa ein Viertel der Weltbevölkerung wird angenommen, dass sie mit Mycobacterium tuberculosisinfiziert ist. Trotz jahrzehntelanger Forschung müssen viele der Mechanismen hinter dem Erfolg von M. tuberculosis als pathogener Organismus noch untersucht werden, und die Entwicklung sichererer, wirksamerer antimykobakterieller Medikamente ist dringend erforderlich, um dem Anstieg und der Ausbreitung der medikamentenresistenten Tuberkulose. Das Fortschreiten der Tuberkuloseforschung wird jedoch durch traditionelle Säugetierinfektionsmodelle, die teuer, zeitaufwändig und ethisch anspruchsvoll sind, in einen Engpass gesteckt. Zuvor haben wir die Larven des Insekts Galleria mellonella (größere Wachsmotte) als neuartiges, reproduzierbares, kostengünstiges, hochdurchlässiges und ethisch akzeptables Infektionsmodell für Mitglieder des M. tuberculosis-Komplexes etabliert. Hier beschreiben wir die Erhaltung, Zubereitung und Infektion von G. mellonella mit biolumineszierendem Mycobacterium bovis BCG lux. Mit diesem Infektionsmodell kann eine mykobakterielle dosisabhängige Virulenz beobachtet werden, und eine schnelle Auslesung der in vivo mykobakteriellen Belastung mittels Biolumineszenzmessungen ist leicht erreichbar und reproduzierbar. Obwohl es Einschränkungen gibt, wie das Fehlen eines vollständig kommentierten Genoms für die transkriptomische Analyse, kann eine ontologische Analyse gegen genetisch ähnliche Insekten durchgeführt werden. Als kostengünstiges, schnelles und ethisch akzeptables Modell für Tuberkulose kann G. mellonella als Vorscreen verwendet werden, um die Wirksamkeit und Toxizität von Arzneimitteln zu bestimmen und die vergleichende mykobakterielle Virulenz vor der Anwendung konventioneller Säugetiere zu bestimmen. Modelle. Die Verwendung des G. mellonella-Mykobakterien-Modells wird zu einer Verringerung der beträchtlichen Anzahl von Tieren führen, die derzeit in der Tuberkuloseforschung verwendet werden.

Hier stellen wir repräsentative Daten vor, die mit dem Modell g. mellonella — BCG lux infektionsmodell erhalten werden können und heben die Vorteile von G. mellonella als Infektionsmodell für Mitglieder des MTBC hervor (Abbildung 1). Experimentelle Verfahren mit wichtigen technischen Punkten sind in Abbildung 2beschrieben.
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Galleria mellonella wurde vor kurzem als reproduzierbares, billiges und ethisch akzeptables Infektionsmodell für den Mycobacterium tuberculosis-Komplex etabliert. Hier beschreiben und zeigen wir die Schritte, die unternommen wurden, um eine erfolgreiche Infektion von G. mellonella mit biolumineszierendem Mycobacterium bovis BCG lux zu etablieren.

Verwendung der wirbellosen Galleria mellonella als Infektionsmodell zur Untersuchung des Mycobacterium tuberculosis Complex

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Galleria mellonella als alternatives Infektionsmodell zur Untersuchung der Tuberkulose, wodurch die Anzahl der in der Forschung verwendeten Säugetiermodelle reduziert wird. Im Vergleich zu herkömmlichen Säugetiermodellen wie Mäusen ist Galleria mellonella ein billigeres, ethisch akzeptables und zugänglicheres Modell zur Untersuchung von Tuberkulose. Eine weitere Optimierung dieses Modells wird das Screening der Wirksamkeit und Toxizität von Kandidaten antimykobakteriellen Arzneimitteln ermöglichen und zur Entwicklung dringend benötigter neuartiger Therapeutika für Tuberkulose beitragen.Galleria mellonella besitzt ein komplexes angeborenes Immunsystem, das mit dem von Säugetieren vergleichbar ist. Die Untersuchung der Wirts-Pathogen-Wechselwirkung kann die Rolle der angeborenen Immunität bei Tuberkulose weiter aufzeigen. Die Verwendung von Galleria mellonella als Infektionsmodell ist nicht auf Tuberkulose beschränkt und wurde in den letzten zehn Jahren häufig für andere bakterielle und Pilzerreger verwendet.Zunächst entfrosten Sie einen gefrorenen 1,2-Milliliter-Glyzerinbestand von Mycobacterium bovis BCG lux, dem Montrealer Impfstoffst

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Mündliche und intra haemocolic Infektion der Larven der größeren...

Das Insekt<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Als leistungsfähiges Infektion Modell zur bakterielle Pathogenität Untersuchen

Dieses Video zeigt eine Methode zur Etablierung eines Mycobacterium bovis-Infektionsmodells in den Larven der Großen Wachsmotte, Galleria mellonella. Ein biolumineszierender Stamm von Mycobacterium bovis BCG wird in die Hämolymphe der Larve injiziert, um eine Infektion zu etablieren, und die Biolumineszenz wird in vordefinierten Intervallen gemessen, um den Fortschritt der Infektion zu untersuchen.

Eine Technik zur Etablierung eines bakteriellen Infektionsmodells in Insektenlarven

Dieses Video zeigt die in vivo Messung der bakteriellen Belastung mit Bacillus Calmette-Guérin, BCG, lux-infizierten Insektenlarven. Der Prozess umfasst die Homogenisierung der Larven, die Behandlung mit einem Luciferase-Substrat und die Biolumineszenzmessung, um die relativen Lichteinheiten zu bestimmen, die mit der bakteriellen Belastung korrelieren.

Messung der in vivo Belastung durch Bakterien, die Luziferase exprimieren, in einer Insektenlarve

Die Larve der Wachsmotte Galleria mellon wurde vor kurzem als ein in vivo Modell, um Legionella pneumophila-Infektion zu studieren etabliert. Hier zeigen wir grundlegende Techniken, die Pathogenese von Legionellen in den Larven charakterisieren, einschließlich Impfung, Messung der bakteriellen Virulenz und Replikation sowie die Extraktion und Analyse von infizierten Blutzellen.

Die Verwendung von<em&gt; Galleria mellon</em&gt; Als Modellorganismus zum Studium<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infektion

Wir beschreiben die optische Bildgebung von Mäusen mit Mycobacterium Tuberculosis (Mycobacterium Tuberculosis) mit Reporter Enzym Fluoreszenz (REF) infiziert. Dieses Protokoll ermöglicht den sensitiver und spezifischen Nachweis von Mycobacterium Tuberculosis in präklinischen Tiermodellen für die Pathogenese, Therapie und Impfstoff-Forschung.

Mycobacterium Tuberculosis in Mäusen mit Reporter Enzym Fluoreszenz Imaging

Galleria Mellonella dient als ein Wirbellosen Modell für disseminierter Candidiasis. Hier beschreiben wir die Infektion Protokoll und unterstützende Daten für das Modell Wirksamkeit.

Die Galleria Mellonella Waxworm Infektionsmodell für verbreitet Candidiasis

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für eine orale Verabreichung Modell mit Galleria Mellonella Larven und wie prägen angeborene Immunantwort induziert. Unter Verwendung dieses Protokolls, werden Forscher ohne praktische Erfahrung der G. Mellonella Zwangsfütterung Methode verwenden können.

Ein Galleria Mellonella mündliche Administrationsmodell zu Study Commensal-Induced angeborene Immunantwort

In dieser Studie wird ein standardisierter Rahmen zur Optimierung von G. mellonella-Infektionsmodellen für die präklinische antimikrobielle Bewertung vorgestellt. Die Anwendung eines G. mellonella-Modells als Teil einer präklinischen antimikrobiellen Entwicklungspipeline könnte die Anzahl unwirksamer Wirkstoffe, die in klinische Studien übergehen, verringern.

Galleria mellonella als antimikrobielles Screening-Modell

Hier stellen wir ein Protokoll für die Durchführung einer niedrig dosierten intradermalen Inokulation von Mycobacterium avium in einem Mausohr vor, um expositionsähnliche Bedingungen widerzuspiegeln.

Intradermale Inokulation von Mycobacterium avium im Mausohr

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die intravitale Bildgebung einer abgeschwächten, BSL-2-zugelassenen Mycobacterium tuberculosis. Spannung in der Mauslunge unter Verwendung eines permanenten Lungenfensters. Dieser Ansatz ermöglicht eine longitudinale, einzelzellige Auflösungsanalyse früher Wirts-Pathogen-Interaktionen, einschließlich bacillärer Lokalisation, vaskulärer Dynamik und Makrophagenaufnahme innerhalb derselben Lungenmikroumgebung.

Intravitale Bildgebung der abgeschwächten auxotrophen Mycobacterium tuberculosis in der Mauslunge während früher intravaskulärer Infektion

Erfahren Sie die Verwendung von Galleria mellonella als alternatives Infektionsmodell zur Tuberkuloseforschung mit Mycobacterium bovis BCG lux. Diese ethisch vertretbare Methode reduziert Säugetiermodelle und ermöglicht effizientes Drug Screening.

Verwendung der wirbellosen Galleria mellonella als Infektionsmodell zur Untersuchung des Mycobacterium tuberculosis Complex

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