Trennung von Rattenepidermis und Dermis mit Thermolysin zum Nachweis ortsspezifischer entzündlicher mRNA und Proteine

Unser Protokoll ist eine einfach anzuwendende und kostengünstige epidermal-dermale Trenntechnik zur Bestimmung der ortsspezifischen Produktion von Entzündungsmediatoren und Neurotrophinen bei Hautentzündungen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die enzymatische Trennung der Epidermis von der Dermis bei vier Grad Celsius durchgeführt wird, wodurch die Integrität von mRNA und Protein erhalten bleibt. Diese Methode gibt Aufschluss über die Arten von Mediatoren, die primäre afferenten Terminals bei akuten und chronischen Entzündungen für die Entwicklung neuartiger therapeutischer Interventionen sensibilisieren.

Wundheilung, Hautkrankheiten, chronische Wunden und Verbrennungen könnten von dieser Forschung profitieren. Und diese Methode könnte auf andere epitheliale Oberflächen wie den GI-Trakt und die Hornhaut angewendet werden. Die optimale Trennzeit kann zwischen den Laboren leicht variieren.

Ein vorversuchsvoller Vergleich verschiedener Zeitpunkte in Kombination mit einer 2D-Morphologieauswertung wird empfohlen, um die Qualität der Trennung zu bestimmen. Nachdem sie eine mangelnde Reaktion auf den Pedalreflex bei einer betäubten acht bis neun Wochen alten Sprague Dawley-Ratte bestätigt hat, injizieren Sie die rechte glabrous Hinterpfote subkutan mit 100 Mikrolitern 1X Lambda-Carrageen, verdünnt in PBS. Verwenden Sie Bremssättel, um die Mittelfußdicke der Hinterpfote unmittelbar vor und nach 6 und 12 Stunden nach der Injektion zu messen, um das Volumen des Ödems als Reaktion auf den Reiz zu bestimmen.

Verwenden Sie am entsprechenden experimentellen Endpunkt ein scharfes Skalpell, um ein ein mal zwei Millimeter großes Stück glabrous Hinterpfotenhaut aus der injizierten Pfote zu entnehmen, und verwenden Sie eine Mikrodissektionszette, um die Haut in einem Milliliter kaltes DMEM in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis für 15 bis 60 Minuten zu übertragen. Während das Gewebe inkubiert, fügen Sie einen Milliliter frisch zubereitetes aktiviertes Thermolysin zu 10 Vertiefungen einer 24-Well-Zellkulturplatte auf Eis hinzu. Verwenden Sie am Ende der Inkubation die Mikrodissektionszette, um eine Hautprobe in jede Vertiefung des aktivierten Thermolysins, Stratum corneum Seite nach oben zu übertragen, ohne die Proben in die Lösung einzutauchen.

Es ist wichtig, dass die Haut nicht in das Thermolysin eingetaucht ist und dass das Stratum corneum nach oben zeigt, um eine effektive Trennung zu erreichen. Verwenden Sie nach zwei bis drei Stunden die Mikrodissektionszette, um eine Hautprobe in sieben bis acht Milliliter von vier Grad Celsius DMEM in eine Petrischale zu tauchen, damit sich die Epidermis mehr Von der Dermis trennen kann. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Epidermis sanft um den Umfang der Haut zu bürsten, bis die fast durchscheinende Epidermis an den Rändern der Probe beobachtet wird.

Wenn sich die Epidermis merklich von der Dermis trennt, greifen Sie vorsichtig jede Hautschicht mit einer einzigen Zangenpaar und ziehen Sie die Epidermis langsam aus der Dermis, dann bewerten Sie die Transluzenz der isolierten Epidermis durch Lichtmikroskopie, um sicherzustellen, dass sie optisch konsistent ist. Wenn die Schichten richtig getrennt wurden, legen Sie das epidermale und dermale Gewebe für 30 Minuten in einzelne Behälter mit fünf Millimolar-EDTA in DMEM bei vier Grad Celsius. Nach der Thermolysin-Deaktivierung einen Teil der Epidermis in einem geeigneten Fixiermittel für eine Stunde bei Raumtemperatur mit Rühren fixieren.

Am Ende der Inkubation das fixierte Gewebe für eine Stunde bei Raumtemperatur unter Rühren in 10% Saccharose in PBS legen, bevor die Probe in einer geeigneten Gewebeeinbettungsmatrix zum Schnitten eingefroren wird. Verwenden Sie einen Kryostaten, um 14 Mikrometer dicke Querschnitte zu erhalten, und montieren Sie die Abschnitte auf gelatinebeschichteten Glasmikroskopobjektträgern. Nach dem Trocknen auf einem Objektträgerwärmer die Proben 90 Sekunden lang mit einer Arbeitslösung aus Toluidinblau beflecken.

Danach vorsichtig Toluidinblau von den Objektträgern mit PBS waschen und Den Abdecklippen mit einem wässrigen Montagemedium entgegentreten, dann die Epidermis mit Hellfeldmikroskopie bei einer 50- bis 250-fachen Vergrößerung beobachten. Carrageen-Injektion in die Hinterpfote der Ratte verursacht klassische Entzündungssymptome wie Rötung und Ödeme sowohl 6 als auch 12 Stunden nach der Injektion. Die Hellfeldmikroskopie kann verwendet werden, um die Wirksamkeit der Thermolysintrennung der Epidermis und Dermis der glabrous Hinterpfotenhaut der Ratte zu bewerten.

Tatsächlich zeigt die toluidinblaue Färbung der epidermalen Querschnitte, dass die Epidermis an der Basismembran von der Dermis getrennt ist, die epidermalen Rete-Grate und die Vertiefungen aus der dermalen Papille jedoch intakt bleiben. Weiterhin werden alle Keratinozytenzellschichten beobachtet. Das western Blotting der thermolysinseistenten Epidermis führt zu konsistenten Ergebnissen, was auf stabile Proteinspiegel während der Technik bei vier Grad Celsius hinweist.

In der naiven Rattenepidermis wird nur sehr wenig NGF-Protein nachgewiesen, aber die NGF-Proteinspiegel sind nach sechs Stunden Carrageen-induzierter Entzündung signifikant hochreguliert. 12 Stunden nach der Injektion sind die NGF-Spiegel im Vergleich zu denen, die nach sechs Stunden beobachtet wurden, reduziert, bleiben aber im Vergleich zu den Kontrollen erhöht. Wie von der Western-Blot-Analyse erwartet, wird die NGF-Immunreaktivität nicht bei naiven Kontroll-Epidermis-Gewebeproben nachgewiesen, aber sechs Stunden nach der Carrageen-induzierten Entzündung wird NGF-Immunreaktivität in den meisten Keratinozyten des Stratum granulosum und Stratum lucidum beobachtet.

Einige Zellen im Stratum spinosum sind auch immunreaktiv mit NGF. Bei der Verwendung von Thermolysin zur Isolierung der intakten Epidermis ist es wichtig zu bedenken, dass die optimale Trennzeit vom Endbenutzer empirisch bestimmt werden muss. Verschiedene proteomische und molekulare Techniken können verwendet werden, um die Expression spezifischer Proteine und/oder primärer Gentranskripte zu validieren, um zu bestätigen, dass dieses Verfahren die Basalexpression nicht verändert.

Diese Technik der epidermal-dermalen Trennung wird es den Forschern ermöglichen, zusätzliche Fragen zur ortsspezifischen Expression von Neurotrophinen und Entzündungsmediatoren in verschiedenen kutanen Entzündungsmodellen zu beantworten. Piktrinsäure und Paraformaldehyd sind gefährlich. Arbeiten Sie mit beiden Chemikalien in einem Abzug, verwenden Sie persönliche Schutzkleidung und Handschuhe und waschen Sie Gesicht und Hände nach der Handhabung.