Name: In Vivo Forward Genetic Screen zur Identifizierung neuartiger neuroprotektive gene in Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Entdecken Sie die Forward-Genetik zur Identifizierung neuroprotektiver Gene bei Drosophila melanogaster. Diese Methode nutzt Klettertests und Histologie, um neue Gene für neurodegenerative Erkrankungen zu finden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Besonders dankbar sind wir Dr. Barry Ganetzky, in dessen Labor der genetische Bildschirm durchgeführt wurde, der die Identifizierung und Charakterisierung von Brat als neuroprotektives Gen ermöglicht. Wir danken Dr. Steven Robinow für die freundlicherweise Bereitstellung der Sammlung von ENU-mutagenisierten Fliegen, die in dem in diesem Artikel vorgestellten genetischen Bildschirm verwendet werden. Wir danken den Mitgliedern des Ganetzky-Labors, Drs. Grace Boekhoff-Falk und David Wassarman für die hilfreichen Diskussionen während der gesamten Dauer dieses Projekts, Ling Ling Ho und Bob Kreber für technische Hilfe, Dr. Aki Ikeda für die Nutzung seiner Mikrotome-Anlage an der University of Wisconsin und Dr. Kim Lackey and the Optical Analysis Facility at the University of Alabama.

<ol><li>Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell+cycle%3A+the+neuron+itself+and+its+circumstances%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances.</a> Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).</li>
<li>Aranda-Anzaldo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+post-mitotic+state+in+neurons+correlates+with+a+stable+nuclear+higher-order+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Communicative+%26+Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure.</a> Communicative & Integrative Biology. 5 (2), 134-139 (2012).</li>
<li>Haelterman, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+chemically+induced+mutations+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of chemically induced mutations in Drosophila melanogaster.</a> Genome Res. 24 (10), 1707-1718 (2014).</li>
<li>Moresco, E. M., Li, X., Beutler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+forward+with+genetics%3A+recent+technological+advances+and+forward+genetics+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Going forward with genetics: recent technological advances and forward genetics in mice.</a> The American Journal of Pathology. 182 (5), 1462-1473 (2013).</li>
<li>St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).</li>
<li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreenspan%2C+RJ+%22Fly+pushing%3A+The+theory+and+practice+of+Drosophila+genetics%22">Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Second edition (2004).</li>
<li>Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+analysis+of+human+disease-associated+gene+sequences+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster.</a> Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).</li>
<li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+the+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of the eukaryotes.</a> Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).</li>
<li>Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+assay+Drosophila+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Methods to assay Drosophila behavior.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).</li>
<li>Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+locomotor%2C+learning%2C+and+memory+deficits+in+Drosophila+models+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).</li>
<li>Karres, J. S., Hilgers, V., Carrera, I., Treisman, J., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conserved+microRNA+miR-8+tunes+atrophin+levels+to+prevent+neurodegeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The conserved microRNA miR-8 tunes atrophin levels to prevent neurodegeneration in Drosophila.</a> Cell. 131 (1), 136-145 (2007).</li>
<li>Helfrich, C., Engelmann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian-Rhythm+of+the+Locomotor-Activity+in+Drosophila-Melanogaster+and+Its+Mutants+Sine+Oculis+and+Small+Optic+Lobes%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Entomology%22%5BJournal%5D)">Circadian-Rhythm of the Locomotor-Activity in Drosophila-Melanogaster and Its Mutants Sine Oculis and Small Optic Lobes.</a> Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).</li>
<li>R Development Core Team. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+language+and+environment+for+statistical+computing%22">R: A language and environment for statistical computing</a>. , Foundation for Statistical Computing. (2008).</li>
<li>Bokel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMS+screens+%3A+from+mutagenesis+to+screening+and+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Bioogyl%22%5BJournal%5D)">EMS screens : from mutagenesis to screening and mapping.</a> Methods in Molecular Bioogyl. 420, 119-138 (2008).</li>
<li>Lindsley, D. L., Zimm, G. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLindsley%2C+DL+%22The+Genome+of+Drosophila+Melanogaster%22">The Genome of Drosophila Melanogaster</a>. , (1992).</li>
<li>Cook, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+chromosomal+deletions+to+provide+extensive+coverage+and+subdivision+of+the+Drosophila+melanogaster+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome.</a> Genome Biology. 13 (3), R21(2012).</li>
<li>Loewen, C., Boekhoff-Falk, G., Ganetzky, B., Chtarbanova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Mutation+in+Brain+Tumor+Causes+Both+Neural+Over-Proliferation+and+Neurodegeneration+in+Adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Genomes+Genetics+G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">A Novel Mutation in Brain Tumor Causes Both Neural Over-Proliferation and Neurodegeneration in Adult Drosophila.</a> Genes Genomes Genetics G3 (Bethesda). 8 (10), 3331-3346 (2018).</li>
<li>Gloor, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+repressors+of+P+element+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Type I repressors of P element mobility.</a> Genetics. 135 (1), 81-95 (1993).</li>
<li>Komori, H., Xiao, Q., McCartney, B. M., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+specifies+intermediate+progenitor+cell+identity+by+attenuating+beta-catenin%2FArmadillo+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Brain tumor specifies intermediate progenitor cell identity by attenuating beta-catenin/Armadillo activity.</a> Development. 141 (1), 51-62 (2014).</li>
<li>Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+swiss+cheese+mutant+causes+glial+hyperwrapping+and+brain+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila.</a> The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7425-7432 (1997).</li>
<li>Kang, K. H., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+neural+stem+cell+self-renewal+and+differentiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila.</a> Cell and Tissue Research. 359 (1), 33-45 (2015).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Gene-Expression+as+a+Means+of+Altering+Cell+Fates+and+Generating+Dominant+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Loewen, C. A., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mito-Nuclear+Interactions+Affecting+Lifespan+and+Neurodegeneration+in+a+Drosophila+Model+of+Leigh+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mito-Nuclear Interactions Affecting Lifespan and Neurodegeneration in a Drosophila Model of Leigh Syndrome.</a> Genetics. 208 (4), 1535-1552 (2018).</li>
<li>Cao, Y., Chtarbanova, S., Petersen, A. J., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnr1+mutations+cause+neurodegeneration+in+Drosophila+by+activating+the+innate+immune+response+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dnr1 mutations cause neurodegeneration in Drosophila by activating the innate immune response in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), E1752-E1760 (2013).</li>
<li>Lessing, D., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+the+brain%3A+insight+into+human+neurodegeneration+from+Drosophila+melanogaster+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).</li>
<li>Peng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Polo+ameliorates+APP-induced+Alzheimer%27s+disease-like+symptoms+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Loss of Polo ameliorates APP-induced Alzheimer's disease-like symptoms in Drosophila.</a> Scientific Reports. 5, 16816(2015).</li>
<li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+mutagens%2C+transposons%2C+and+transgenes+to+interrogate+gene+function+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster.</a> Methods. 68 (1), 15-28 (2014).</li>
<li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Genome+Sequencing+and+a+New+Bioinformatics+Platform+Allow+for+Rapid+Gene+Identification+in+D.+melanogaster+EMS+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Whole Genome Sequencing and a New Bioinformatics Platform Allow for Rapid Gene Identification in D. melanogaster EMS Screens.</a> Biology (Basel). 1 (3), 766-777 (2012).</li>
<li>Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-sensitive+paralytic+mutants+are+enriched+for+those+causing+neurodegeneration+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in drosophila.</a> Genetics. 161 (3), 1197-1208 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Forward genetische Screens in Drosophila waren ein effektiver Ansatz, um Gene zu identifizieren, die an verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt sind, einschließlich altersabhängiger Neuroprotektion5,23,24, 25. Mit dieser Strategie gelang es uns, Brat als neuartiges neuroprotektives Gen zu identifizieren17.
Ein kritisch...

Neuronen sind zum größten Teil post-mitotisch und unfähig,1,2zu teilen. Bei den meisten Tieren gibt es neuroprotektive Mechanismen, um diese Zellen während der gesamten Lebensdauer des Organismus zu erhalten, besonders im Alter, wenn Neuronen am anfälligsten für Schäden sind. Gene, die diesen Mechanismen zugrunde liegen, können bei Mutanten identifiziert werden, die Neurodegeneration aufweisen, einem phänotyptischen Indikator für den Verlust des Neuroprotektions, mit einem vorwärts genetischen Protokoll. Vorwärtsgenetische Siebe, die chemische Mutagene wie Ethylmethansulfonat (EMS) oder N-Ethyl-N-Nitrosourea (ENU) verwenden, sind aufgrund der zufälligen Punktmutationen, die sie induzieren, besonders nützlich, was zu einem von Natur aus unvoreingenommenen Ansatz führt, der Licht auf zahlreiche Genfunktionen in eukaryotischen Modellorganismen3,4,5 (im Gegensatz dazu erzeugt die Röntgenmutagenese DNA-Brüche und kann zu Einer Neuanordnung anstelle von Punktmutationen führen6).
Die gemeine Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist ein ideales Thema für diese Bildschirme aufgrund ihrer hohen Qualität, gut benoteten Genomsequenz, ihrer langen Geschichte als Modellorganismus mit hochentwickelten genetischen Werkzeugen und vor allem ihrer gemeinsamen Evolutionsgeschichte mit Menschen7,8. Ein begrenzender Faktor für die Anwendbarkeit dieses Protokolls ist die frühe Letalität, die durch die mutierten Gene verursacht wird, was Tests im Altervon 9Jahren verhindern würde. Bei nicht-tödlichen Mutationen ist jedoch ein Klettertest, der negative Geotaxis ausnutzt, eine einfache, wenn auch umfangreiche Methode zur Quantifizierung beeinträchtigter motorischer Funktionsfähigkeit10. Um eine ausreichende bewegungsmotorische Reaktivität zu zeigen, sind Fliegen auf neuronale Funktionen angewiesen, um die Richtung zu bestimmen, ihre Position zu spüren und die Bewegung zu koordinieren. Die Unfähigkeit von Fliegen, als Reaktion auf Reize ausreichend zu klettern, kann daher auf neurologische Defektehinweisen 11. Sobald ein bestimmter defekter Kletterphänotyp identifiziert ist, können weitere Tests mit einem sekundären Bildschirm wie der histologischen Analyse von Hirngewebe verwendet werden, um Neurodegeneration in kletterdefekten Fliegen zu identifizieren. Nachfolgende Genkartierung kann dann verwendet werden, um die genomische Region auf dem Chromosom zu enthüllen, das das defekte neuroprotektive Gen von Interesse trägt. Um den chromosomalen Bereich von Interesse einzugrenzen, kann eine meiotische Kartierung mit mutierten Fliegenlinien durchgeführt werden, die dominante Markergene mit bekannten Positionen auf dem Chromosom tragen. Die Markergene dienen als Bezugspunkt für die Mutation, da die Häufigkeit der Rekombination zwischen zwei Loci eine messbare Entfernung bietet, die verwendet werden kann, um die ungefähre Position eines Gens abzubilden. Schließlich erzeugt das Überschreiten der mutierten Linien mit Linien mit ausgewogenen Mängeln auf dem meiotisch kartierten chromosomalen Bereich von Interesse einen Komplementierungstest, bei dem das Gen von Interesse überprüft werden kann, wenn sein bekannter Phänotyp5exprimiert wird. Polymorphe Nukleotidsequenzen im identifizierten Gen, die möglicherweise zu veränderten Aminosäuresequenzen führen, können durch Sequenzierung des Gens und Vergleich mit der Drosophila-Genomsequenz ausgewertet werden. Die anschließende Charakterisierung des gens von Interesse kann das Testen zusätzlicher mutierter Allele, Mutationsrettungsexperimente und die Untersuchung zusätzlicher Phänotypen umfassen.

<table><tbody><tr><td>Großgeräte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Abzug für Histologie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lichtmikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipe E100</td><td>Bevorzugtes Objektiv für die Bildgebung ist 20x</td></tr><tr><td>Bildgebungssoftware</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Kamera</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly Push and Climbing Assay</td>VWR&<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>reg; Drosophila-Fläschchen, schmal</td><td>VWR</td><td>75813-160</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Allzweck-Labor-Beschriftungsband</td><td>VWR</td><td>89097-912</td><td></td></tr><tr><td>Standard-Mauspad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Motic</td><td></td><td>Modell SMZ-168</td></tr><tr><td>CO2 Anästhesiestation (Blaspistole, Fußventil, Ultimate Flypad)</td><td>Genesee Scientific</td><td>54-104, 59-121, 59-172</td><td> Zu den</td></tr><tr><td>CO2-Tank-Bürsten mit feiner Spitze</td><td>gehören SOLO HORTON BRUSHES, INC.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Inkubator</td><td>VWR</td><td>89510-750</td><td></td></tr><tr><td>Gene mapping</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CantonS</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>9517</td><td></td></tr><tr><td>w1118</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>5905</td><td></td></tr><tr><td>yw&nbsp;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>6599</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Linie, die für die Rekombinationskartierung verwendet</td><td>wird Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>3227</td><td>Genotyp: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3</td></tr><tr><td>CyO/sno[Sco]&nbsp;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>2555</td><td>Drosophila Balancer-Linie für die Rekombinationskartierung Deficiency</td></tr><tr><td>Kit für Chromosom</td><td>2L Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>DK2L</td><td>Cook et al., 2012</td></tr><tr><td>Histology analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, (100%)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; &nbsp; Premium Mikrozentrifugenröhrchen: 1,5 mL</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Histochoice Clearingmittel 1x</td><td>VWR Life Sciences</td><td>97060-934</td><td></td></tr><tr><td>Harris Hämatoxylin</td><td>VWR</td><td>95057-858</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific & Handel; &nbsp; Richard-Allan Wissenschaft & Handel; Eindeckmedium</td><td>Thermo Scientific&trade; 4112</td><td>22-110-610</td><td>CyO/sna[Sco]</td></tr><tr><td>Unifrost Poly-L-Lysin Objektträger, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select Plus</td><td>Azer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; &nbsp; Deckgläser: Rechtecke</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545M</td><td>Abmessungen: 24 mm x 60 mm</td></tr><tr><td>Rückverfolgbarer Timer</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide Warmer</td><td>Barnstead International</td><td></td><td>Modell-Nr. 26025</td></tr><tr><td>Slide Tablett und Racks</td><td>DWK Life Sciences</td><td></td><td>Rack für 20 Slides</td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; &nbsp; Allzweck-Pinzette mit extra langer</td><td>Länge Fisherbrand</td><td>10-316A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes&trade;</td><td>Kimberly-Clark&Handel; Professionell&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-Zoll-Puritan-Applikatoren</td><td>Laubholzprodukte Company, Guilford, Maine</td><td>807-12</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Rasierklingen</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Tupperware oder Glasbehälter für Histologieflüssigkeiten</td><td></td><td></td><td>16 + 1 für fließendes Wasser</td></tr> High <tr><td>Profile Beschichtete Mikrotomklingen</td><td>VWR</td><td>95057-834</td><td></td></tr><tr><td>Corning&trade; &nbsp; Runder Eiskübel mit Deckel, 4 L</td><td>Corning&trade;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Becher</td><td></td><td></td><td>oder anderer Behälter für Eiswasser und Kassetten</td></tr><tr><td>Tissue Bath</td><td>Precision Scientific Company</td><td>66630</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Molekulare Analyse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard&reg; SV Gel und PCR Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Ex Taq DNA-Polymerase</td><td>TaKaRa</td><td></td><td>5 U/&mu; l</td></tr><tr><td>Invitrogen&Handel; &nbsp; SYBR&Handel; Sicher & Handel; DNA-Gel-Färbung</td><td>&nbsp; Invitrogen&Handel;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure&Handel; Agarose</td><td>&nbsp; Invitrogen&Handel;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 Kb Plus DNA-Leiter</td><td>&nbsp; Invitrogen&Handel;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ApE-A Plasmid Editor Software</td><td></td><td></td><td>Zum kostenlosen Download verfügbar</td></tr><tr><td>Statistische Analyse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>R Softwarepaket</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weitere Analyse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1]</td><td>Bloomington Drosophila Lager Center</td><td>59967</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo forward genetic screen zur identifizierung neuartiger neuroprotektive gene in drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

Es gibt viel über den Beginn und das Fortschreiten neurodegenerativer Erkrankungen zu verstehen, einschließlich der zugrunde liegenden Gene, die dafür verantwortlich sind. Das Forward-Genscreening mit chemischen Mutagenen ist eine nützliche Strategie für die Kartierung mutierter Phänotypen zu Genen zwischen Drosophila und anderen Modellorganismen, die konservierte Zellwege mit Menschen teilen. Wenn das mutierte Gen von Interesse in frühen Entwicklungsstadien von Fliegen nicht tödlich ist, kann ein Klettertest durchgeführt werden, um auf phänotypische Indikatoren für eine verminderte Gehirnfunktion, wie niedrige Kletterraten, zu überprüfen. Anschließend kann eine sekundäre histologische Analyse des Hirngewebes durchgeführt werden, um die neuroprotektive Funktion des Gens durch Bewertung von Phänendern der Neurodegeneration zu überprüfen. Gen-Mapping-Strategien umfassen meiotische und Mangel-Mapping, die auf diesen gleichen Assays verlassen können durch DNA-Sequenzierung gefolgt werden, um mögliche Nukleotid-Änderungen im Gen von Interesse zu identifizieren.

In diesem Aerticle stellen wir die Schritte vor, die verwendet werden, um den Genhirntumor (brat) als eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der neuronalen Integrität (z. B. Neuroprotektion) bei erwachsenen Fliegen17zu identifizieren; eine Methode, die verwendet werden kann, um Gene zu identifizieren, die am Neuroprotektionsschutz beteiligt sind. Wir verwendeten einen vorwärtsgenetischen Ansatz (die Strategie ist in Abbildung 1A...

Wir präsentieren ein Protokoll mit einem vorwärts genetischen Ansatz, um Mutanten zu überprüfen, die Neurodegeneration in Drosophila melanogasterzeigen. Es beinhaltet einen Klettertest, histologische Analysen, Genkartierung und DNA-Sequenzierung, um letztendlich neue Gene im Zusammenhang mit dem Prozess des Neuroprotektions zu identifizieren.

In Vivo Forward Genetic Screen zur Identifizierung neuartiger neuroprotektive gene in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, die Macht der Vorwärtsgenetik zu nutzen, um Gene zu identifizieren, die, wenn dysreguliert, zu Neurodegeneration führen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie einen unvoreingenommenen und unkomplizierten Ansatz für die Identifizierung neuroprotektiver Gene bietet, die in Säugetiermodellen schwieriger durchzuführen sein könnten. Diese Technik kann verwendet werden, um neue Gene zu identifizieren, die in den Prozess der Neurodegeneration involviert sind, die mit vielen Krankheiten wie Alzheimer und Parkinson verbunden ist.Neben der Identifizierung neuroprotektiver Gene kann der vorwärtsgenetische Ansatz verwendet werden, um Gene zu entdecken, die an anderen biologischen Prozessen wie neuronaler Funktion und Übertragung beteiligt sind. Zu Beginn sammeln Sie homozygote Fliegen aus Linien, die zur enU mutagenisierten Sammlung von Drosophila-Mutanten gehören, die dem zweiten Chromosom zugeordnet sind. Drehen Sie die Fliegen im Alter von 10 bis 12 Tagen in eine Testkammer ohne Anästhesie eine Linie nach der anderen und lassen Sie sie für fünf Minuten erholen.Tippen Sie mit der Fünf-Zentimeter-Linie auf der Seite nach unten dreimal auf ein Mauspad, das auf einer festen Oberfläche platziert ist, so dass alle Fliegen den Test unten beginnen. Beobachten Sie die Flugfortbewegung über einen Zeitraum von 10 Sekunden. Erfassen Sie die Anzahl der Fliegen, die die Fünf-Zentimeter-Linie innerhalb dieser Zeit erreichen oder passieren, sowie die Gesamtzahl der getesteten Fliegen.Warten Sie eine Minute, bevor Sie eine zweite Testversion starten. Wiederholen Sie mindestens drei Testreplikationen pro Zeile. Nach der Anästhesisierung der Fliegen auf einem Kohlendioxid-Pad, fliegen Köpfe mit einer chirurgischen Klinge und verwenden Sie einen Pinsel, um sie sanft in einem Milliliter Von Carnoy fixativ in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr zu platzieren.Dann lagern Sie die Röhre bei vier Grad Celsius über Nacht. Achten Sie am nächsten Tag darauf, dass die Köpfe in der Fixierlösung versenkt werden. Verwenden Sie unter einer Dunstabzugshaube eine P1000-Pipette, um die Fixierlösung durch einen Milliliter 70% Ethanol zu ersetzen und die Proben für die zukünftige Analyse bei vier Grad Celsius zu halten.Mit einer Pasteur-Pipette die festinstallierten Köpfe in Mikrobiopsiekassetten übertragen und die Kassetten schließen. Senden Sie die Kassetten zur Verarbeitung an eine Histologieeinrichtung oder legen Sie sie in einer automatisierten Tissueverarbeitungsmaschine, sofern vor Ort verfügbar. Führen Sie das Programm aus, um die Köpfe mit Paraffin zu dehydrieren, zu löschen und zu infiltrieren.Dann übertragen Sie die Kassetten in eine Paraffin-Einbettstation mit Paraffin, das bei 60 Grad Celsius erhitzt wird, und legen Sie Metallbasisformen, die zu den Kassetten passen, auf die beheizte Station. Verwenden Sie feine Zangen, um die Köpfe so auszurichten, dass sie der Oberseite in der Basisform gegenüberstehen. Die richtige Kopforientierung ist für die Histologieanalyse entscheidend.Nach dem Härten schneiden Sie jeden Paraffinblock, um die zu schneidende Oberfläche zu minimieren. Schneiden Sie fünf Mikrometerabschnitte jedes Blocks auf dem Mikrotom. Als nächstes legen Sie die geschnittenen Paraffinbänder in einem beheizten Wasserbad bei 35 Grad Celsius für maximal fünf Minuten.Tauchen Sie eine polylysinbeschichtete Rutsche in das beheizte Wasserbad ein und platzieren Sie die geschnittenen Bänder mit einem Holzapplikator auf der Rutsche. Lassen Sie die Rutschen über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. Am nächsten Tag, verwenden Sie eine Rutsche wärmer, um die Rutschen für 15 Minuten bei 63 Grad Celsius zu erwärmen.Unter einer Dunstabzugshaube legen Sie die Dias auf eine Rutsche und legen Sie das Rack für fünf Minuten zweimal in HistoChoice, gefolgt von mehreren Ethanol- und destillierten Wasserbadbehandlungen nach dem Manuskript. Übertragen Sie das Rack für zwei bis fünf Minuten in einen mit Harris Hematoxylin gefüllten Behälter. Nehmen Sie dann das Rack aus der Hämatoxylin-Lösung und legen Sie es 10 Minuten unter fließendes Leitungswasser, bevor Sie die folgenden Färbeschritte durchführen.Nach der Färbung, mit Zangen, nehmen Sie die Dias aus der HistoChoice oder Xylene Lösung. Eine dünne Schicht permanenten Montagemediums auf die Probe tropfen und vorsichtig einen Deckelschlupf auf die Oberseite legen. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen.Nachdem das Montagemedium gehärtet ist, legen Sie das Dia unter ein Lichtmikroskop, um Bilder von repräsentativen Hirnabschnitten bei etwa Midbrain zu erhalten. Zuerst bereiten Sie ein Lebensmittel mit Durchstechflasche für die Erzeugung heterozygoter weiblicher Fliegen zu. Nach der Kohlendioxid-Anästhesie, verwenden Sie einen Pinsel, um fünf Männchen der mutierten Linie und 10 jungfrauen Weibchen des sternopleuralen eingeklemmten Lappen zu übertragen und über Curly O Linie in die Durchstechflasche zu heften, um ein Kreuz zu machen.Legen Sie die Durchstechflasche bei 25 Grad Celsius. Sammeln Sie nach 10 bis 12 Tagen mindestens 15 jungfräuliche weibliche Nachkommen, die das mutierte Chromosom und das Markerchromosom tragen. Überqueren Sie sie zu fünf Männchen aus einer ausgewogenen Linie, die eine andere sichtbare dominante Marker Curly O über Scutoid oder gleichwertig trägt.Nach 10 bis 12 Tagen sammeln Sie die heterozygote männliche Nachkommenschaft, die entweder Scutoid oder Curly O und das potenziell rekombinierte Chromosom vom Kreuz trägt. Paaren Sie sie einzeln mit jungfräulichen Weibchen aus dem Bestand, der das mutierte Chromosom trägt. Zehn bis 12 Tage später, sammeln Sie die Nachkommen aus dem letzten Kreuz in neue Lebensmittel mit Fläschchen und altern die Fliegen bei 29 Grad Celsius bis 10 bis 14 Tage.Führen Sie Histologie auf Fliegenköpfen und wiederholen für Nachkommen jedes einzelnen Kreuzes. Führen Sie mit diesen Informationen eine Mangelzuordnung auf einem verengten Bereich des Chromosoms durch, um die Position der rezessiven Mutation zu verfeinern. Jede Mangellinie hat eine Deletion verschiedener Regionen der Chromosomen, so dass sie für Komplementierungstests verwendet werden können.Als nächstes kreuzen Sie Linien aus dem Drosophila-Mangelkit für das zweite Chromosom und suchen nach einer Nichtkomplementierung des Phänotyps des Interesses. Um eine Referenz für die DNA-Sequenzanalyse zu erhalten, laden Sie eine FASTA-Formatdatei mit der genomischen Konsenssequenz des BRAT-Gens aus FlyBase herunter oder verwenden Sie eine Datei mit Ergebnissen für die BRAT-Sequenz einer genetischen Hintergrundkontrolle, zum Beispiel die ursprünglich mutagenisierte Drosophila-Linie. Öffnen Sie Sequenzdateien im A Plasmid Editor.Wechseln Sie zu Bearbeiten, und klicken Sie auf Sequenzen ausrichten. Wählen Sie mit der Maus des Computers alle zu vergleichenden Sequenzen aus. Geben Sie im Drop-Menü die Referenzsequenz für diese Ausrichtung an.Überprüfen Sie den sequenzierten Bereich auf Nukleotidänderungen im Vergleich zur Referenzsequenz. Wenn gewünscht, speichern Sie die Ausrichtung auf einem Computer im RTF-Format, indem Sie auf Text und dann speichern klicken. Führen Sie das Rettungsexperiment durch, indem Sie F1-Nachkommen von jedem Kreuz sammeln.Wählen Sie sorgfältig weg markierte Balancer. Altern Sie die Fliegen auf Drosophila Nahrungsmedium bei 29 Grad Celsius und führen Histologie-Analyse auf Gehirne, um für Neurodegeneration wie zuvor zu suchen. Um eine altersabhängige Analyse der Neurodegeneration bei 867 Mutanten durchzuführen, altern die Fliegen auf fünf, 15 und 25 Tage und führen anschließende histologische Analysen durch.Dieses Protokoll stellt einen vorwärtsgenetischen Ansatz dar, um eine Ansammlung chemisch erbtagenisierter Fliegen mithilfe eines Kletterassays zu überprüfen. Von 235 homozygoten Linien wiesen etwa 37% der getesteten Linien eine Kletterpassrate unter 50% auf, wenn sie im Alter von 10 bis 12 Tagen getestet wurden. Nachfolgende histologische Darstellung auf 51 der Linien mit der niedrigsten Kletterpassrate zeigte, dass 29 dieser Linien sichtbares Aussehen von Löchern im Gehirn Neuropil von mild bis schwere Anzeichen für Neurodegeneration zeigten.Der Neurodegeneration-Phänotyp bei 867 Fliegen ist rezessiv, da die Gehirne von heterozygoten 867 Fliegen, die zu einem wilden Stamm überkreuzt wurden, mit denen von Kontrollen vergleichbar waren. Die Mangellinie Df24116 ergänzt den 867 mutierten Phänotyp auf Basis des Klettertestes nicht. Die histologische Verifizierung zeigt, dass die Mangellinie Df24116 den Phänotyp 867 neurodegeneration nicht ergänzt, während Df9296 dies tut.Die Untersuchung des Hirnphänotyps von 867 Mutanten, die zu zusätzlichen Mangellinien gekreuzt wurden, bestätigte, dass die Mutation in der Region des Genoms enthalten ist, die das Gen BRAT enthält. Es ist wichtig, sich während dieses Verfahrens daran zu erinnern, so streng und präzise wie möglich zu arbeiten, da dieses Protokoll mehrere Schritte kombiniert, die bei unsachgemäßer Ausführung die Identifizierung von Mutanten mit Neurodegeneration in Kandidatengenen beeinflussen können. Abhängig von den identifizierten Genen kann die nachfolgende Analyse das Testen zusätzlicher Proteine des Interesses oder Wechselwirkungen mit Genen umfassen, die eine Rolle in bekannten Pfaden der Neurodegeneration spielen.Denken Sie während des Histologie-Verfahrens daran, die fixative Lösung des Carnoy mit Vorsicht zu behandeln, da sie Chloroform enthält. Tragen Sie Handschuhe und verwenden Sie mit ausreichender Belüftung ideal unter der Dunstabzugshaube. In ähnlicher Weise führen Sie alle Histologie Färbung unter der Rauchhaube.

in-vivo-forward-genetic-screen-to-identify-novel-neuroprotective

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Gepaart Nanoinjection und Elektrophysiologie-Test zum Screening auf Bioaktivität der Verbindungen unter Verwendung des Drosophila melanogaster Riesen-Fiber System

Dieses Video beschreibt eine einfache Methode zur Quantifizierung der Fortbewegung von Fliegen und zeigt den durchgeführten Kletter-Assay. Der Fly-Climbing-Assay ist ein allgemeiner Test der motorischen Funktion, der auf einer negativen Geotaxis-Reaktion beruht.

Fly Climbing Assay: Eine Methode zum Testen der allgemeinen Fortbewegung bei Drosophila melanogaster

Hier beschreiben wir zwei Tests, die getroffen wurden, um altersabhängige Neurodegeneration dopaminerger (DA) in Neuronen zu...

Beurteilung Neurodegenerative Phänotypen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Dopaminergen Neuronen durch Klettern Assays und Whole Brain Immunostaining

Dieses Protokoll beschreibt die Dissektion und Immunostaining von Erwachsenen Drosophila Melanogaster Gewebe des Gehirns. Insbesondere unterstreicht dieses Protokoll die Verwendung von Drosophila Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen als Beispiel neuronale Teilmengen, die genau verwendet werden, um die allgemeinen Grundsätze für viele Aspekte der neuronalen Entwicklung aufzudecken.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Hier präsentieren wir ein Protokoll mit der Drosophila sensorischen Neuron - dendritischen Arborization (da) Verletzungen Modell Neuron, das in Vivo verbindet live imaging, zwei-Photonen-Laser Axotomie/Dendriotomy und die mächtigen fliegen genetische Toolbox, als eine Plattform für das screening potenzieller Projektträger und Inhibitoren der Neuroregeneration.

Eine Drosophila In Vivo Verletzungen Modell für das Studium Neuroregeneration in den peripheren und zentralen Nervensystems

Ziel dieses Protokolls ist es, das Design und die Leistung von In-vivo-Experimenten in Drosophila melanogaster zu skizzieren, um die funktionellen Folgen seltener Genvarianten im Zusammenhang mit menschlichen Krankheiten zu bewerten.

In Vivo Funktionelle Studie von krankheitsassoziierten seltenen menschlichen Varianten mit Drosophila

Blut - Hirn-Schranke Integrität ist entscheidend für die Funktion des Nervensystems. Bei Drosophila melanogasterwird die Blut-Hirn-Schranke bei der späten Embryogenese durch Gliazellen gebildet. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung der Bildung und Erhaltung von Blut-Hirn-Barrieren bei D. melanogaster Embryonen und dritten Instarlarven.

Assay für Blut - Hirn-Barriere Integrität in Drosophila melanogaster

Dieser Artikel enthält detaillierte Protokolle zur Zufügung einer penetrierenden traumatischen Hirnverletzung (PTBI) bei erwachsenen Drosophila und zur Untersuchung der daraus resultierenden Neurogenese.

Stimulation und Analyse der adulten Neurogenese im zentralen Gehirn von Drosophila

Das Protokoll stellt eine kostengünstige Methode mit hohem Durchsatz zur Beurteilung der Neurotoxizität in der Fruchtfliege durch die Quantifizierung der Bewegungsstörung als Alternative zu herkömmlichen Säugetiermodellen dar. Ziel ist es, die neurotoxischen Wirkungen von pharmazeutischen Wirkstoffen, Umwelteinflüssen oder genetischen Veränderungen anhand eines sensitiven, reproduzierbaren und ethisch günstigen Modells zu bewerten.

Verhaltensanalyse der lokomotorischen Dysfunktion bei Drosophila melanogaster als Aussage für Neurotoxizität

Wir beschreiben eine robuste Strategie Gen - Ersatz zu genetisch den Pilz Sauereien manipulieren Ustilago maydis. Dieses Protokoll wird erklärt, wie Deletionsmutanten zu erzeugen Infektion Phänotypen zu untersuchen. Es kann erweitert werden , um Gene in jeder gewünschten Weise zu modifizieren, beispielsweise durch eine Sequenz Hinzufügen eines fluoreszierenden Protein - Tag kodiert.

Genetische Manipulation der Pflanze Pathogen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Zu Pilzbiologie und Pflanzen Mikroben-Interaktionen Studie

Entdecken Sie die Forward-Genetik zur Identifizierung neuroprotektiver Gene bei Drosophila melanogaster. Diese Methode nutzt Klettertests und Histologie, um neue Gene für neurodegenerative Erkrankungen zu finden.

In Vivo Forward Genetic Screen zur Identifizierung neuartiger neuroprotektive gene in Drosophila melanogaster

Weitere Videos entdecken