Name: In Vivo Forward Genetic Screen zur Identifizierung neuartiger neuroprotektive gene in Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Entdecken Sie die Forward-Genetik zur Identifizierung neuroprotektiver Gene bei Drosophila melanogaster. Diese Methode nutzt Klettertests und Histologie, um neue Gene für neurodegenerative Erkrankungen zu finden.

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Besonders dankbar sind wir Dr. Barry Ganetzky, in dessen Labor der genetische Bildschirm durchgeführt wurde, der die Identifizierung und Charakterisierung von Brat als neuroprotektives Gen ermöglicht. Wir danken Dr. Steven Robinow für die freundlicherweise Bereitstellung der Sammlung von ENU-mutagenisierten Fliegen, die in dem in diesem Artikel vorgestellten genetischen Bildschirm verwendet werden. Wir danken den Mitgliedern des Ganetzky-Labors, Drs. Grace Boekhoff-Falk und David Wassarman für die hilfreichen Diskussionen während der gesamten Dauer dieses Projekts, Ling Ling Ho und Bob Kreber für technische Hilfe, Dr. Aki Ikeda für die Nutzung seiner Mikrotome-Anlage an der University of Wisconsin und Dr. Kim Lackey and the Optical Analysis Facility at the University of Alabama.

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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Forward genetische Screens in Drosophila waren ein effektiver Ansatz, um Gene zu identifizieren, die an verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt sind, einschließlich altersabhängiger Neuroprotektion5,23,24, 25. Mit dieser Strategie gelang es uns, Brat als neuartiges neuroprotektives Gen zu identifizieren17.
Ein kritisch...

Neuronen sind zum größten Teil post-mitotisch und unfähig,1,2zu teilen. Bei den meisten Tieren gibt es neuroprotektive Mechanismen, um diese Zellen während der gesamten Lebensdauer des Organismus zu erhalten, besonders im Alter, wenn Neuronen am anfälligsten für Schäden sind. Gene, die diesen Mechanismen zugrunde liegen, können bei Mutanten identifiziert werden, die Neurodegeneration aufweisen, einem phänotyptischen Indikator für den Verlust des Neuroprotektions, mit einem vorwärts genetischen Protokoll. Vorwärtsgenetische Siebe, die chemische Mutagene wie Ethylmethansulfonat (EMS) oder N-Ethyl-N-Nitrosourea (ENU) verwenden, sind aufgrund der zufälligen Punktmutationen, die sie induzieren, besonders nützlich, was zu einem von Natur aus unvoreingenommenen Ansatz führt, der Licht auf zahlreiche Genfunktionen in eukaryotischen Modellorganismen3,4,5 (im Gegensatz dazu erzeugt die Röntgenmutagenese DNA-Brüche und kann zu Einer Neuanordnung anstelle von Punktmutationen führen6).
Die gemeine Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist ein ideales Thema für diese Bildschirme aufgrund ihrer hohen Qualität, gut benoteten Genomsequenz, ihrer langen Geschichte als Modellorganismus mit hochentwickelten genetischen Werkzeugen und vor allem ihrer gemeinsamen Evolutionsgeschichte mit Menschen7,8. Ein begrenzender Faktor für die Anwendbarkeit dieses Protokolls ist die frühe Letalität, die durch die mutierten Gene verursacht wird, was Tests im Altervon 9Jahren verhindern würde. Bei nicht-tödlichen Mutationen ist jedoch ein Klettertest, der negative Geotaxis ausnutzt, eine einfache, wenn auch umfangreiche Methode zur Quantifizierung beeinträchtigter motorischer Funktionsfähigkeit10. Um eine ausreichende bewegungsmotorische Reaktivität zu zeigen, sind Fliegen auf neuronale Funktionen angewiesen, um die Richtung zu bestimmen, ihre Position zu spüren und die Bewegung zu koordinieren. Die Unfähigkeit von Fliegen, als Reaktion auf Reize ausreichend zu klettern, kann daher auf neurologische Defektehinweisen 11. Sobald ein bestimmter defekter Kletterphänotyp identifiziert ist, können weitere Tests mit einem sekundären Bildschirm wie der histologischen Analyse von Hirngewebe verwendet werden, um Neurodegeneration in kletterdefekten Fliegen zu identifizieren. Nachfolgende Genkartierung kann dann verwendet werden, um die genomische Region auf dem Chromosom zu enthüllen, das das defekte neuroprotektive Gen von Interesse trägt. Um den chromosomalen Bereich von Interesse einzugrenzen, kann eine meiotische Kartierung mit mutierten Fliegenlinien durchgeführt werden, die dominante Markergene mit bekannten Positionen auf dem Chromosom tragen. Die Markergene dienen als Bezugspunkt für die Mutation, da die Häufigkeit der Rekombination zwischen zwei Loci eine messbare Entfernung bietet, die verwendet werden kann, um die ungefähre Position eines Gens abzubilden. Schließlich erzeugt das Überschreiten der mutierten Linien mit Linien mit ausgewogenen Mängeln auf dem meiotisch kartierten chromosomalen Bereich von Interesse einen Komplementierungstest, bei dem das Gen von Interesse überprüft werden kann, wenn sein bekannter Phänotyp5exprimiert wird. Polymorphe Nukleotidsequenzen im identifizierten Gen, die möglicherweise zu veränderten Aminosäuresequenzen führen, können durch Sequenzierung des Gens und Vergleich mit der Drosophila-Genomsequenz ausgewertet werden. Die anschließende Charakterisierung des gens von Interesse kann das Testen zusätzlicher mutierter Allele, Mutationsrettungsexperimente und die Untersuchung zusätzlicher Phänotypen umfassen.

<table><tbody><tr><td>Großgeräte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Abzug für Histologie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lichtmikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipe E100</td><td>Bevorzugtes Objektiv für die Bildgebung ist 20x</td></tr><tr><td>Bildgebungssoftware</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Kamera</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly Push and Climbing Assay</td>VWR&<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>reg; Drosophila-Fläschchen, schmal</td><td>VWR</td><td>75813-160</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Allzweck-Labor-Beschriftungsband</td><td>VWR</td><td>89097-912</td><td></td></tr><tr><td>Standard-Mauspad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Motic</td><td></td><td>Modell SMZ-168</td></tr><tr><td>CO2 Anästhesiestation (Blaspistole, Fußventil, Ultimate Flypad)</td><td>Genesee Scientific</td><td>54-104, 59-121, 59-172</td><td> Zu den</td></tr><tr><td>CO2-Tank-Bürsten mit feiner Spitze</td><td>gehören SOLO HORTON BRUSHES, INC.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Inkubator</td><td>VWR</td><td>89510-750</td><td></td></tr><tr><td>Gene mapping</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CantonS</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>9517</td><td></td></tr><tr><td>w1118</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>5905</td><td></td></tr><tr><td>yw&nbsp;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>6599</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Linie, die für die Rekombinationskartierung verwendet</td><td>wird Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>3227</td><td>Genotyp: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3</td></tr><tr><td>CyO/sno[Sco]&nbsp;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>2555</td><td>Drosophila Balancer-Linie für die Rekombinationskartierung Deficiency</td></tr><tr><td>Kit für Chromosom</td><td>2L Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>DK2L</td><td>Cook et al., 2012</td></tr><tr><td>Histology analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, (100%)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; &nbsp; Premium Mikrozentrifugenröhrchen: 1,5 mL</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Histochoice Clearingmittel 1x</td><td>VWR Life Sciences</td><td>97060-934</td><td></td></tr><tr><td>Harris Hämatoxylin</td><td>VWR</td><td>95057-858</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific & Handel; &nbsp; Richard-Allan Wissenschaft & Handel; Eindeckmedium</td><td>Thermo Scientific&trade; 4112</td><td>22-110-610</td><td>CyO/sna[Sco]</td></tr><tr><td>Unifrost Poly-L-Lysin Objektträger, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select Plus</td><td>Azer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; &nbsp; Deckgläser: Rechtecke</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545M</td><td>Abmessungen: 24 mm x 60 mm</td></tr><tr><td>Rückverfolgbarer Timer</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide Warmer</td><td>Barnstead International</td><td></td><td>Modell-Nr. 26025</td></tr><tr><td>Slide Tablett und Racks</td><td>DWK Life Sciences</td><td></td><td>Rack für 20 Slides</td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; &nbsp; Allzweck-Pinzette mit extra langer</td><td>Länge Fisherbrand</td><td>10-316A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes&trade;</td><td>Kimberly-Clark&Handel; Professionell&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-Zoll-Puritan-Applikatoren</td><td>Laubholzprodukte Company, Guilford, Maine</td><td>807-12</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Rasierklingen</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Tupperware oder Glasbehälter für Histologieflüssigkeiten</td><td></td><td></td><td>16 + 1 für fließendes Wasser</td></tr> High <tr><td>Profile Beschichtete Mikrotomklingen</td><td>VWR</td><td>95057-834</td><td></td></tr><tr><td>Corning&trade; &nbsp; Runder Eiskübel mit Deckel, 4 L</td><td>Corning&trade;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Becher</td><td></td><td></td><td>oder anderer Behälter für Eiswasser und Kassetten</td></tr><tr><td>Tissue Bath</td><td>Precision Scientific Company</td><td>66630</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Molekulare Analyse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard&reg; SV Gel und PCR Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Ex Taq DNA-Polymerase</td><td>TaKaRa</td><td></td><td>5 U/&mu; l</td></tr><tr><td>Invitrogen&Handel; &nbsp; SYBR&Handel; Sicher & Handel; DNA-Gel-Färbung</td><td>&nbsp; Invitrogen&Handel;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure&Handel; Agarose</td><td>&nbsp; Invitrogen&Handel;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 Kb Plus DNA-Leiter</td><td>&nbsp; Invitrogen&Handel;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ApE-A Plasmid Editor Software</td><td></td><td></td><td>Zum kostenlosen Download verfügbar</td></tr><tr><td>Statistische Analyse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>R Softwarepaket</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weitere Analyse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1]</td><td>Bloomington Drosophila Lager Center</td><td>59967</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo forward genetic screen zur identifizierung neuartiger neuroprotektive gene in drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

Es gibt viel über den Beginn und das Fortschreiten neurodegenerativer Erkrankungen zu verstehen, einschließlich der zugrunde liegenden Gene, die dafür verantwortlich sind. Das Forward-Genscreening mit chemischen Mutagenen ist eine nützliche Strategie für die Kartierung mutierter Phänotypen zu Genen zwischen Drosophila und anderen Modellorganismen, die konservierte Zellwege mit Menschen teilen. Wenn das mutierte Gen von Interesse in frühen Entwicklungsstadien von Fliegen nicht tödlich ist, kann ein Klettertest durchgeführt werden, um auf phänotypische Indikatoren für eine verminderte Gehirnfunktion, wie niedrige Kletterraten, zu überprüfen. Anschließend kann eine sekundäre histologische Analyse des Hirngewebes durchgeführt werden, um die neuroprotektive Funktion des Gens durch Bewertung von Phänendern der Neurodegeneration zu überprüfen. Gen-Mapping-Strategien umfassen meiotische und Mangel-Mapping, die auf diesen gleichen Assays verlassen können durch DNA-Sequenzierung gefolgt werden, um mögliche Nukleotid-Änderungen im Gen von Interesse zu identifizieren.

In diesem Aerticle stellen wir die Schritte vor, die verwendet werden, um den Genhirntumor (brat) als eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der neuronalen Integrität (z. B. Neuroprotektion) bei erwachsenen Fliegen17zu identifizieren; eine Methode, die verwendet werden kann, um Gene zu identifizieren, die am Neuroprotektionsschutz beteiligt sind. Wir verwendeten einen vorwärtsgenetischen Ansatz (die Strategie ist in Abbildung 1A...

Wir präsentieren ein Protokoll mit einem vorwärts genetischen Ansatz, um Mutanten zu überprüfen, die Neurodegeneration in Drosophila melanogasterzeigen. Es beinhaltet einen Klettertest, histologische Analysen, Genkartierung und DNA-Sequenzierung, um letztendlich neue Gene im Zusammenhang mit dem Prozess des Neuroprotektions zu identifizieren.

In Vivo Forward Genetic Screen zur Identifizierung neuartiger neuroprotektive gene in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, die Macht der Vorwärtsgenetik zu nutzen, um Gene zu identifizieren, die, wenn dysreguliert, zu Neurodegeneration führen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie einen unvoreingenommenen und unkomplizierten Ansatz für die Identifizierung neuroprotektiver Gene bietet, die in Säugetiermodellen schwieriger durchzuführen sein könnten. Diese Technik kann verwendet werden, um neue Gene zu identifizieren, die in den Prozess der Neurodegeneration involviert sind, die mit vielen Krankheiten wie Alzheimer und Parkinson verbunden ist.Neben der Identifizierung neuroprotektiver Gene kann der vorwärtsgenetische Ansatz verwendet werden, um Gene zu entdecken, die an anderen biologischen Prozessen wie neuronaler Funktion und Übertragung beteiligt sind. Zu Beginn sammeln Sie homozygote Fliegen aus Linien, die zur enU mutagenisierten Sammlung von Drosophila-Mutanten gehören, die dem zweiten Chromosom zugeordnet sind. Drehen Sie die Fliegen im Alter von 10 bis 12 Tagen in eine Testkammer ohne Anästhesie eine Linie nach der anderen und lassen Sie sie für fünf Minuten erholen.Tippen Sie mit der Fünf-Zentimeter-Linie auf der Seite nach unten dreimal auf ein Ma

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Gepaart Nanoinjection und Elektrophysiologie-Test zum Screening auf Bioaktivität der Verbindungen unter Verwendung des Drosophila melanogaster Riesen-Fiber System

Dieses Video beschreibt eine einfache Methode zur Quantifizierung der Fortbewegung von Fliegen und zeigt den durchgeführten Kletter-Assay. Der Fly-Climbing-Assay ist ein allgemeiner Test der motorischen Funktion, der auf einer negativen Geotaxis-Reaktion beruht.

Fly Climbing Assay: Eine Methode zum Testen der allgemeinen Fortbewegung bei Drosophila melanogaster

Hier beschreiben wir zwei Tests, die getroffen wurden, um altersabhängige Neurodegeneration dopaminerger (DA) in Neuronen zu...

Beurteilung Neurodegenerative Phänotypen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Dopaminergen Neuronen durch Klettern Assays und Whole Brain Immunostaining

Dieses Protokoll beschreibt die Dissektion und Immunostaining von Erwachsenen Drosophila Melanogaster Gewebe des Gehirns. Insbesondere unterstreicht dieses Protokoll die Verwendung von Drosophila Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen als Beispiel neuronale Teilmengen, die genau verwendet werden, um die allgemeinen Grundsätze für viele Aspekte der neuronalen Entwicklung aufzudecken.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Hier präsentieren wir ein Protokoll mit der Drosophila sensorischen Neuron - dendritischen Arborization (da) Verletzungen Modell Neuron, das in Vivo verbindet live imaging, zwei-Photonen-Laser Axotomie/Dendriotomy und die mächtigen fliegen genetische Toolbox, als eine Plattform für das screening potenzieller Projektträger und Inhibitoren der Neuroregeneration.

Eine Drosophila In Vivo Verletzungen Modell für das Studium Neuroregeneration in den peripheren und zentralen Nervensystems

Ziel dieses Protokolls ist es, das Design und die Leistung von In-vivo-Experimenten in Drosophila melanogaster zu skizzieren, um die funktionellen Folgen seltener Genvarianten im Zusammenhang mit menschlichen Krankheiten zu bewerten.

In Vivo Funktionelle Studie von krankheitsassoziierten seltenen menschlichen Varianten mit Drosophila

Blut - Hirn-Schranke Integrität ist entscheidend für die Funktion des Nervensystems. Bei Drosophila melanogasterwird die Blut-Hirn-Schranke bei der späten Embryogenese durch Gliazellen gebildet. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung der Bildung und Erhaltung von Blut-Hirn-Barrieren bei D. melanogaster Embryonen und dritten Instarlarven.

Assay für Blut - Hirn-Barriere Integrität in Drosophila melanogaster

Dieser Artikel enthält detaillierte Protokolle zur Zufügung einer penetrierenden traumatischen Hirnverletzung (PTBI) bei erwachsenen Drosophila und zur Untersuchung der daraus resultierenden Neurogenese.

Stimulation und Analyse der adulten Neurogenese im zentralen Gehirn von Drosophila

Das Protokoll stellt eine kostengünstige Methode mit hohem Durchsatz zur Beurteilung der Neurotoxizität in der Fruchtfliege durch die Quantifizierung der Bewegungsstörung als Alternative zu herkömmlichen Säugetiermodellen dar. Ziel ist es, die neurotoxischen Wirkungen von pharmazeutischen Wirkstoffen, Umwelteinflüssen oder genetischen Veränderungen anhand eines sensitiven, reproduzierbaren und ethisch günstigen Modells zu bewerten.

Verhaltensanalyse der lokomotorischen Dysfunktion bei Drosophila melanogaster als Aussage für Neurotoxizität

Wir beschreiben eine robuste Strategie Gen - Ersatz zu genetisch den Pilz Sauereien manipulieren Ustilago maydis. Dieses Protokoll wird erklärt, wie Deletionsmutanten zu erzeugen Infektion Phänotypen zu untersuchen. Es kann erweitert werden , um Gene in jeder gewünschten Weise zu modifizieren, beispielsweise durch eine Sequenz Hinzufügen eines fluoreszierenden Protein - Tag kodiert.

Genetische Manipulation der Pflanze Pathogen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Zu Pilzbiologie und Pflanzen Mikroben-Interaktionen Studie

Entdecken Sie die Forward-Genetik zur Identifizierung neuroprotektiver Gene bei Drosophila melanogaster. Diese Methode nutzt Klettertests und Histologie, um neue Gene für neurodegenerative Erkrankungen zu finden.

In Vivo Forward Genetic Screen zur Identifizierung neuartiger neuroprotektive gene in Drosophila melanogaster

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