Name: Generation von Alpha-Synuclein vorgeformten Fibrillen aus Monomers und Einsatz In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Lernen Sie die standardisierte Generierung von Alpha-Synuclein vorgeformten Fibrillen aus Monomeren für Parkinson-Modellierung in Nagetieren. Dieses Protokoll sichert reproduzierbare Pathologie und validierte Qualitätskontrolle.

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Unterstützt wurde diese Forschung durch Stipendien der Michael J. Fox Foundation, des National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS099416) und des Weston Brain Institute.

<ol><li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+alpha-synuclein+transmission+initiates+Parkinson-like+neurodegeneration+in+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice.</a> Science. 338, 949-953 (2012).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+Biological+Compatibility+with+Host+Alpha-Synuclein+Influences+Fibril+Pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity.</a> Cell Reports. 16, 3373-3387 (2016).</li>
<li>Paumier, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrastriatal+injection+of+pre-formed+mouse+alpha-synuclein+fibrils+into+rats+triggers+alpha-synuclein+pathology+and+bilateral+nigrostriatal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Intrastriatal injection of pre-formed mouse alpha-synuclein fibrils into rats triggers alpha-synuclein pathology and bilateral nigrostriatal degeneration.</a> Neurobiology of Disease. 82, 185-199 (2015).</li>
<li>Abdelmotilib, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Synuclein+fibril-induced+inclusion+spread+in+rats+and+mice+correlates+with+dopaminergic+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">alpha-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic Neurodegeneration.</a> Neurobiology of Disease. 105, 84-98 (2017).</li>
<li>Duffy, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+body-like+alpha-synuclein+inclusions+trigger+reactive+microgliosis+prior+to+nigral+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Lewy body-like alpha-synuclein inclusions trigger reactive microgliosis prior to nigral degeneration.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 129(2018).</li>
<li>Duffy, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+Over+Quantity%3A+Advantages+of+Using+Alpha-Synuclein+Preformed+Fibril+Triggered+Synucleinopathy+to+Model+Idiopathic+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Quality Over Quantity: Advantages of Using Alpha-Synuclein Preformed Fibril Triggered Synucleinopathy to Model Idiopathic Parkinson's Disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 621(2018).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+seed+the+formation+of+Lewy+body-like+intracellular+inclusions+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20051-20056 (2009).</li>
<li>Volpicelli-Daley, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+induce+Lewy+body+pathology+leading+to+synaptic+dysfunction+and+neuron+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death.</a> Neuron. 72, 57-71 (2011).</li>
<li>Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+exogenous+alpha-synuclein+preformed+fibrils+to+primary+neuronal+cultures+to+seed+recruitment+of+endogenous+alpha-synuclein+to+Lewy+body+and+Lewy+neurite-like+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates.</a> Nature Protocols. 9, 2135-2146 (2014).</li>
<li>Kuusisto, E., Salminen, A., Alafuzoff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-binding+protein+p62+is+present+in+neuronal+and+glial+inclusions+in+human+tauopathies+and+synucleinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-binding protein p62 is present in neuronal and glial inclusions in human tauopathies and synucleinopathies.</a> Neuroreport. 12, 2085-2090 (2001).</li>
<li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Misfolded+proteinase+K-resistant+hyperphosphorylated+alpha-synuclein+in+aged+transgenic+mice+with+locomotor+deterioration+and+in+human+alpha-synucleinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Misfolded proteinase K-resistant hyperphosphorylated alpha-synuclein in aged transgenic mice with locomotor deterioration and in human alpha-synucleinopathies.</a> The Journal of Clinical Investigation. 110, 1429-1439 (2002).</li>
<li>Li, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Lewy+body+pathology+in+12-+and+16-year-old+intrastriatal+mesencephalic+grafts+surviving+in+a+patient+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Movement+disorders+%3A+official+journal+of+the+Movement+Disorder+Society%22%5BJournal%5D)">Characterization of Lewy body pathology in 12- and 16-year-old intrastriatal mesencephalic grafts surviving in a patient with Parkinson's disease.</a> Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 25, 1091-1096 (2010).</li>
<li>Shimozawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+pathological+alpha-synuclein+in+marmoset+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Propagation of pathological alpha-synuclein in marmoset brain.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, 12(2017).</li>
<li>Polinski, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+Practices+for+Generating+and+Using+Alpha-Synuclein+Pre-Formed+Fibrils+to+Model+Parkinson%27s+Disease+in+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson's Disease in Rodents.</a> Journal of Parkinson's Disease. 8, 303-322 (2018).</li>
<li>Fares, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+de+novo+alpha-synuclein+fibrillization+in+a+neuronal+model+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Induction of de novo alpha-synuclein fibrillization in a neuronal model for Parkinson's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 912-921 (2016).</li>
<li>Fenyi, A., Coens, A., Bellande, T., Melki, R., Bousset, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+efficacy+of+different+procedures+that+remove+and+disassemble+alpha-synuclein%2C+tau+and+A-beta+fibrils+from+laboratory+material+and+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Assessment of the efficacy of different procedures that remove and disassemble alpha-synuclein, tau and A-beta fibrils from laboratory material and surfaces.</a> Scientific Reports. 8, 10788(2018).</li>
<li>Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survivable+stereotaxic+surgery+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Survivable stereotaxic surgery in rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2008).</li>
<li>Tarutani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Fragmented+Pathogenic+alpha-Synuclein+Seeds+on+Prion-like+Propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Effect of Fragmented Pathogenic alpha-Synuclein Seeds on Prion-like Propagation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 18675-18688 (2016).</li>
<li>Wall, N. R., De La Parra, M., Callaway, E. M., Kreitzer, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+innervation+of+direct-+and+indirect-pathway+striatal+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential innervation of direct- and indirect-pathway striatal projection neurons.</a> Neuron. 79, 347-360 (2013).</li>
</ol>

Joseph Patterson, Kelvin Luk und Caryl Sortwell sind derzeit an vertraglichen Vereinbarungen mit der Michael J. Fox Foundation zur Qualitätskontrolle von Material zur Qualitätskontrolle beteiligt, das von Proteos, Inc. Coauthor Nicole Polinski, erzeugt wurde, ist Mitarbeiterin des Michael J. Fox. Foundation, die Proteos, Inc. mit der Herstellung von α-syn Monomer beauftragt hat. Die Coautoren Megan Duffy, Laura Volpicelli-Daley und Nicholas Kanaan haben nichts zu verraten.

Die Produktion von α-syn PFFs, die in der Lage sind, Neuronen zu säen und zu Lewy körperähnlichen Einschlüssen zu führen, ist von mehreren Faktoren und Schritten abhängig. Ein entscheidender Faktor ist, dass die Monomere, die zur Herstellung von Fibrillen verwendet werden, speziell für die Fibrilisierung4,9, 14,15formuliertwerden müssen. Wenn die Monomere nicht für die Fibrilisierung formuliert sind, dürfen sich die Fibrillen nicht bilden, oder die Fibrillen, die sich bilden, dürfen keine α-syn-Pathologie erzeugen. Ebenso beeinflusst der Puffer, in dem sich die Monomere befinden, auch die Fibrilisierung. Für die besten Ergebnisse sollte die Salzkonzentration bei etwa 100 mM NaCl und pH zwischen 7,0 und 7,3 liegen. Ein erster Schritt, der eine Variabilität einführt, ist die Methode, bei der der anfängliche Proteingehalt ermittelt wird, wobei die Messung bei A280 wahrscheinlich genauere Ergebnisse liefert und somit die bevorzugte Methode ist. Die Diskrepanz in der Proteinkonzentration kann die Wirksamkeit des Fibrilisierungsprozesses verringern und die in Experimenten verwendete PFF-Konzentration verändern. Beides könnte zu einer Verringerung der Aussaateffizienz und der Chargenvariante zwischen den Experimenten führen.
Erste Qualitätskontrollmaßnahmen bestätigen die kritischen Merkmale der PFFs, insbesondere, dass sie eine fibrilläre Konformation haben (Elektronenmikroskopie), Amyloid-Strukturen (Thioflavin T Assay) enthalten und pektierbar sind (Sedimentations-Assay). Es ist wichtig zu beachten, dass die Ergebnisse des Thioflavin T-Tests mit der Zeit schwanken und nicht direkt gemessen werden, wie viele Amyloidstrukturen vorhanden sind, sondern dass der Thioflavin T-Test nur als Indikator für die Präsenz von Amyloidstrukturen innerhalb verwendet werden sollte. Die Probe. Thioflavin T wird typischerweise in In-vitro-TAssays verwendet, wie zum Beispiel in dem oben erwähnten Test, um zu zeigen, dass die Fibrils Amyloid-Strukturen enthalten. Alternativ wird Thioflavin S im Gewebe verwendet, um Amyloidstrukturen zu erkennen, wie in Abbildung7 gezeigt. Was den Sedimentationsuntersuchungen betrifft, so zeigen die Ergebnisse nur, dass die PFFs überwiegend im pelletablen Bruchteil zu finden sind. Da die Proben unter Denaturierungsbedingungen laufen, ist auf den Gelen ein einziges markantes Band von etwa 14 kDa, die Größe der α-syn-Monomere, vorhanden. Dies ist im Gegensatz zu den verschiedenen Bändern, die bei höheren molekularen Gewichten vorhanden sind, die mit PFFs zu erwarten wären, wenn ein einheimisches oder nicht-denaturierendes Gel verwendet würde. Schließlich garantiert das erfolgreiche Durchlaufen all dieser ersten Schritte zur Qualitätskontrolle keine α-syn-Inklusionseinnahme. Aus diesem Grund sollten Zellkultur-Experimente oder eine kleine Kohorte von chirurgisch injizierten Tieren verwendet werden, um die Wirksamkeit der PFFs zu testen, bevor sie in größeren Experimenten eingesetzt werden.
Die Sonikerung ist ein entscheidender Schritt in diesem Prozess, und die Parameter werden je nach Modell des verwendeten Soundators unterschiedlich sein. Sonication Parameter müssen angewendet und überprüft werden, um zu zeigen, dass kurze PFF-Fragmente produziert wurden. Die Fasergröße hat das Tragen auf die Aussaat, wobei die kürzeren Fibrillen effizienter sind. Obwohl kürzeres Fasersaat effizienter ist, wirkt dieser Effekt plateaus und die optimale PFF-Länge beträgt ca. 50 nm4,18. Es ist auch wichtig, die Proben nicht zu überklonieren und die PFFs übermäßiger Hitze auszusetzen, da dies die Aussaateffizienz verringern kann. Diese klanglichen PFFs sollten vor dem Einsatz in größeren Experimenten auf Wirksamkeit in der Kleinzellkultur oder in vivo-Experimenten getestet werden. Da verschiedene Sonikerungssitzungen das Potenzial haben, Variabilität einzuführen, sollten experimentelle Behandlungsgruppen entsprechend geplant werden.
Bei der Lieferung von PFFs in vivo kann die Lokalisierung der Injektionsstelle (n) und der Gesamtmenge der verwendeten PFFs die Anzahl der Neuronen beeinflussen, die Einschlüsse entwickeln werden, sowie den Umfang der Neurodegeneration7,14. Die Koordinaten im Protokoll bieten einen Startplatz, sollten aber im Labor getestet werden, um sicherzustellen, dass die gewünschte Zielregion vor dem Einsatz in Großversuchen die α-syn Pathologie entwickelt. Auf Wunsch können Tracking-Farbstoffe oder fluoreszierende Perlen als Möglichkeit verwendet werden, regionale Zielscheiben vor der Verwendung von PFFs zu testen. Die Menge der PFFs, die in vivo verwendet werden, variiert zwischen den Gruppen, wobei die meisten Gruppen insgesamt 5 bis 20 μg PFFs an einem oder auf zwei Injektionsstellen 1,2, 3,4, 5aufgeteilthaben. , 6 , 7 , 14. Da die Anzahl der Injektionsstellen, die Lage der Injektionsstellen und die Menge der injizierten PFFs Ergebnisse und das Fortschreiten der Synucleinopathie beeinflussen können, sollten die nachgelagerten Ergebnisse der verwendeten Parameter vor der Verwendung des Modells charakterisiert werden, um Mögliche Eingriffe testen oder zeitliche Merkmale des Modells untersuchen.
Bei der Auswahl eines Modells, das für die Prüfung von Therapeutika oder das Studium der Krankheitsfortschritte verwendet werden soll, sollte das verwendete Modell ausgewählt werden, um die gestellte Frage am besten zu beantworten. Nicht alle Modelle werden bestimmte Krankheitsmerkmale von PD besitzen oder den Zeitrahmen bieten, der für die Erprobung potenzieller Interventionen erforderlich ist. Das PFF-Modell rekapituliert wichtige Merkmale von PD, wie die α-syn Pathologie und Neurodegeneration, und kann zu bescheidenen motorischen Beeinträchtigungen führen. Das Modell bietet einen vorhersehbaren und langwierigen Zeitverlauf, bei dem sich Einschlüsse Monate vor der Neurodegeneration bilden. Dies ermöglicht es den Forschern, die verschiedenen Phasen während des langwierigen Fortschritts der Synucleinopathie zu untersuchen und zu nutzen. Die aktuelle und zukünftige Nutzung des Modells insgesamt wird voraussichtlich von Vorteil für die Erforschung des Fortschritts von Krankheiten und die Entwicklung neuer Therapien sein.

Die Parkinson-Krankheit (PD) ist in erster Linie durch zwei wichtige pathologische Merkmale gekennzeichnet: Die weit verbreitete und fortschreitende Alpha-Synuclein-Pathologie (α-syn) und die nigrostriatale Degeneration. Nach der Injektion in Wildtier-Mäuse oder Ratten führen α-syn vorgeformte Fibrillen (PFFs) zu einer fortschreitenden Anhäufung von pathologischen α-syn, die zu einer langwierigen Degeneration von substantia nigra pars compacta (SNpc) Dopamin-Neuronen im Laufe vieler Monate, sowie sensorimotorische Defizite1,2,3, 4, 5,6. Neuronen sind α-syn Fibrils ausgesetzt, entweder über direkte intrazerebrale Injektion oder in die Medien kultivierter Neuronen. Wenn die PFFs in die Neuronen aufgenommen werden, wirken die PFFs, um die Bildung von Einschlüssen durch Templation und Ansammlung von endogenen α-syn in phosphorylierte Einschlüsse 1,7, 8 zu"sägen," 9. September Die Inklusion hat ähnliche Eigenschaften wie Lewy-Körper: Das Enthalten von α-syn Phosphorylierung bei Serine 129 (pSyn), Ubiquitin und p62; besitzen amyloide Quarzstrukturen, wie sie bei der positiven Thioflavin-Färbung gezeigt werden; Und sind resistent gegen ProteinaseK Verdauung 1,3, 5,7, 8, 9, 10,11, 12. Die PFR-Exposition führt zu einer α-syn-Inklusionsbildung in primären und einigen verewigten Neuronen in der Kultur,sowie von Mäusen, Ratten und nicht-menschlichen Primaten in vivo1,2,3,4, 5,6,7,8, 9,13. Es ist wichtig zu beachten, dass PFFs nicht zu α-syn-Inklusionsbildung in allen Zellkulturmodellen führen werden und einige kultivierte Neuronen besser säen als andere.
Ein weiteres wichtiges Merkmal des in vivo α-syn PFF Modells sind die unterschiedlichen sequenziellen pathologischen Phasen, die über mehrere Monate hinweg auftreten. Bei Nagetieren, die nach einer intrastriatalen Injektion folgen, erreicht die α-syn-Inklusionsbildung in der Regel innerhalb der SNpc und vieler kortikaler Regionen innerhalb von 1-2 Monaten. Auf diese Aggregationshöhepitze folgt eine nigrostriatale Degeneration, die 2-4 Monate später1,3,5. Diese unterschiedlichen pathologischen Stadien bieten den Forschern die Plattform, mit der sie Strategien untersuchen und entwickeln können, die 1) die α-Syn-Aggregation verringern, 2) klare, bereits gebildete α-Syn-Einschlüsse, and/oder 3) eine nachfolgende Neurodegeneration verhindern. Das PFF-Modell bietet deutliche Vor-und Nachteile im Vergleich zu neurotoxicanten, transgenen und viralen Vektorvermittelungsmodellen, die α-syn überexpression sind, wie zuvor überprüft6. Die Wahl, welches Modell oder welcher Ansatz gewählt werden soll, sollte nach welchem Modell am besten zu der Frage passen, die die Ermittler stellen.
Obwohl das PFF-Modell von vielen Labors erfolgreich genutzt wurde, gibt es immer noch Gruppen, die Ungereimtheiten bei der Erzeugung von Fibrillen und der Herstellung einer konsistenten α-Syn Pathologie erlebt haben 14. Beispiele für Ungereimtheiten reichen von PFFs, die wenig oder gar keine α-Syn-Pathologie produzieren, bis hin zur Stapelsaat-Effizienz und sogar von der Formbildung von Fibrillen. Daher ist die Standardisierung der α-syn PFF Generation und in vivo-Anwendung entscheidend, um genaue Interpretationen der Auswirkungen neuartiger therapeutischer Interventionen zu ermöglichen. Das folgende Protokoll skizziert die Schritte, die für die Generierung von PFFs aus α-syn-Monomeren, die In-vitro-Qualitätskontrolle der einmal gebildeten PFFs, die Sonisierung und Messung der PFFs vor der Verwendung, und Vorschläge, um erfolgreiche in vivo Injektion von zu erleichtern PFFs in Ratten oder Mäuse.

<table><tbody><tr><td>1x Dulbecco' s phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Alpha-Synuclein (phosphoryliert bei Serin 129) Antikörper</td><td>Abcam</td><td>AB184674</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Alpha-Synuclein-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>AB15530</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchonsäure</td><td>Thermo Fisher (Pierce)</td><td>PI23228</td><td></td></tr><tr><td>Durchsichtiger medizinischer Schrumpfschlauch (0,036" Innendurchmesser)</td><td>Nordson Medical</td><td>103-0143</td><td></td></tr><tr><td>Klarer medizinischer Schrumpfschlauch (0,044" Innendurchmesser)</td><td>Nordson Medical</td><td>103-0296</td><td></td></tr><tr><td>Kupfersulfat</td><td>Thermo Fisher (Pierce)</td><td>PI23224</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>2231000574</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoTop beheizter Deckel</td><td>Eppendorf</td><td>5308000003</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/Carbon beschichtet Elektronenmikroskopie-Gitter</td><td>Eletron Microscopy Sciences</td><td>FCF300-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Glaskapillarrohr (0,53 mm Außendurchmesser; 0,09 mm Innendurchmesser; 54 mm Länge)</td><td>Drummond</td><td>22-326223</td><td></td></tr><tr><td>Glasnadelabzieher</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Spritze</td><td>Hamilton</td><td>80000</td><td></td></tr><tr><td>Humanes Alpha-Synuclein-Monomer zur Erzeugung von vorgeformten Fibrillen</td><td>Proteos</td><td>RP-003</td><td></td></tr><tr><td>Maus-Alpha-Synuclein-Monomer zur Erzeugung von vorgeformten Fibrillen</td><td>Proteos</td><td>RP-009</td><td></td></tr><tr><td>Orange Medical Schrumpfschlauch (0,021" Innendurchmesser)</td><td>Nordson Medical</td><td>103-0152</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7543</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>25530015</td><td></td></tr><tr><td>Qsonica 3,2 mm Spitze</td><td>Qsonica</td><td>4422</td><td></td></tr><tr><td>Qsonica Q125 Ultraschallgerät</td><td>Qsonica</td><td>Q125</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1892</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin T</td><td>EMD Millipore</td><td>596200</td><td></td></tr><tr><td>ToxinSensor Chromogenes LAL Endotoxin Assay Kit</td><td>Genscript</td><td>L00350C</td><td></td></tr><tr><td>Uranylacetat</td><td>Eletron Mikroskopie Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

generation von alpha-synuclein vorgeformten fibrillen aus monomers und einsatz in vivo

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

Die Verwendung des in vivo alpha-synuclein vorgebildeten Fibril-Modells der Synucleinopathie gewinnt an Popularität bei Forschern, die darauf abzielen, die Parkinson-Krankheit Synucleinopathie und nigrostratorische Degeneration zu modellieren. Die Standardisierung der α-syn PFF Generation und in vivo-Anwendung ist entscheidend, um eine konsistente, robuste α-syn Pathologie zu gewährleisten. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung von Fibrillen aus monomerischem α-syn vor, nach der Fibrilisierung Qualitätskontrolle, und schlagen Parameter für eine erfolgreiche neurochirurgische Injektion von α-syn PFFs in Ratten oder Mäuse vor. Beginnend mit der monomeren α-syn erfolgt die Fibrilisierung über eine 7-tägige Inkubationszeit, während sie bei optimalen Pufferbedingungen, Konzentration und Temperatur schüttelt. Die Qualitätskontrolle nach der Fibrilisierung wird durch das Vorhandensein von pelletablen Fibrillen durch Sedimentationsuntersucht, die Bildung von Amyloid-Konformation in den Fibrillen mit einem Thioflavin-T-Test und die elektronenmikroskopische Visualisierung der Fibrillen bewertet. Während eine erfolgreiche Validierung mit diesen Assays für den Erfolg notwendig ist, reichen sie nicht aus, um zu garantieren, dass PFFs α-syn-Einschlüsse in Neuronen abbauen, da eine solche Aggregataktivität jeder PFF-Serie in der Zellkultur oder in Pilottierkohorten getestet werden sollte. Vor der Anwendung müssen PFFs unter exakt standardisierten Bedingungen sonicated werden, gefolgt von einer Untersuchung mittels Elektronenmikroskopie oder dynamischer Lichtstreuung zur Bestätigung von Faserlängen, die sich in einem optimalen Größenbereich mit einer durchschnittlichen Länge von 50 nm befinden. PFFs können dann in Zellkulturmedien aufgenommen oder bei Tieren verwendet werden. Die Pathologie, die durch Immunfärbung für phosphorylierte α-syn (psyn; serine 129) nachweisbar ist, ist Tage oder Wochen später in der Zellkultur bzw. in Nagetiermodellen erkennbar.

Die Generation der Fibrillen aus α-syn-Monomeren beginnt mit der Bestimmung der Konzentration der Monomere. Sowohl der BCA-Test als auch die Messung der Absorbierung mit 280 nm (A280) können zur Messung des Proteingehalts verwendet werden; Die BCA-Untersuchungsergebnisse deuteten jedoch auf eine höhere Konzentration als die A280-Methode hin. PFFs, die von der Maus, dem α-syn Monomer, abgeleitet werden, hatten einen BCA-Wert von 14.05 ± 0,22 und einen A280 von 8,05 ± 0,03 μg/μL (Abbildung 1). Ebenso schienen auch PFFs, die von menschlichen α-syn-Monomern abgeleitet wurden, mit einem BCA-Wert von 12,95 ± 0,38 und einem A280 von 7,83 ± 0,05 μg/μL (Abbildung1) zu sein. Die A280-Messungen sind spezifisch für α-syn, basierend auf der Einbeziehung der Aussterbekoeffizienten, und diese Ergebnisse wurden verwendet, um die Monomere vor der 7-tägigen Inkubation zu verdünnen.
Vor der Brutzeit war die Flüssigkeit, die die α-syn-Monomere enthielt, klar, sollte aber nach der Fibrilbildung trüb erscheinen. Die Untersuchung mit der Transmissionselektronenmikroskopie bestätigte das Vorhandensein von langen Fibrillen, die 10-20 nm breit sind (Abbildung 4). Im Vergleich dazu waren die α-syn-Monomere kaum sichtbar, ohne dass eine erkennbare Form erkennbar war (Abbildung4). Mit der visuellen Bestätigung der fibrillaren Strukturen ist die Amyloid-Konformation der Fibrillen das nächste Merkmal von PFFs, die mit einem Thioflavin T-Assay bestätigt werden sollten. Thioflavin T zeigt eine erhöhte Fluoreszenz, wenn sie an Amyloid gebunden ist; So zeigt ein erhöhtes fluoreszierendes Signal aus den Proben das Vorhandensein von Amyloid. Zum Beispiel erzeugte Thioflavin in dPBS ein Signal von 3,287 ± 580 relativen Leuchtstoffanlagen (RFU), Maus-α-syn Monomer erzeugte ein Signal von 4.174 ± 158 RFU, und Maus-PFFs erzeugten ein Signal von 59,754 ± 6,224 RFU (Abbildung5). Im Vergleich dazu erzeugte der menschliche α-syn Monomer ein ähnliches Signal von 4.158 ± 105 RFU zu Mausmonomer, und menschliche PFFs erzeugten ein höheres Signal von 1.235,967 ± 113,747 RFU im Vergleich zu Maus-PFFs (Abbildung5). Um das Vorhandensein von pelletablen Fibrillen zu beurteilen, wurde ein Sedimentations-Test durchgeführt. Fibrillen werden mit Zentrifugation pflügeln. Sowohl bei der Maus als auch bei den PFF-Proben des Menschen sollte der übernatante Anteil mehr Eiweiß im Pellet haben als der Supernatant(Abbildung6). Im Gegensatz dazu war der größte Teil des Proteins aus Maus und menschlichen Monomeren im Supernatant vorhanden, mit wenig vorhanden im Pellet (Abbildung6). Mit den PFFs, die durch die Elektronenmikroskopie sichtbar sind, die Amyloidstrukturen vorhanden sind und die Fibrillen pelletable sind, haben sie alle In-vitro-Qualitätskontrollschritte durchlaufen.
Sowohl die Maus als auch die menschlichen PFFs wurden für die Herstellung von PFFs in entsprechender Länge für die Aussaat von α-syn-Einschlüssen 4,18hergestellt. Die PFFs wurden auf die gewünschte Konzentration von 4 μg/μL und sonicated ausgedünnt. Unmittelbar vor der Operation wurden 25 repräsentative Fibrillen durch die Elektronenmikroskopie abgebildet und gemessen, um die Fibrilgröße zu überprüfen. Die klangvoll gemessene Maus-PFFs wurden 48,8 ± 3,1 nm gemessen, während die menschlichen PFFs 52,1 ± 4,4 nm Länge gemessen haben; PFFs beider Arten waren daher die entsprechende Länge (50 nm oder weniger), um die Saataktivität zu induzieren. Eine umfassendere Untersuchung von etwa 500 Fibrillen ergab die durchschnittliche Längen-und Längenverteilung der sonicated Mausfibrillen. Die durchschnittliche Länge betrug 44,4 ± 0,6 nm, wobei 86,6% der PFFs 60 nm oder weniger groß waren (Abbildung 4). Im Vergleich dazu lagen die menschlichen PFFs im Schnitt bei 55,9 ± 1,1 nm mit 69,6% der PFFs mit 60 nm oder weniger (Abbildung 4).
Nach intrastriataler Injektion von klangierten Maus-PFFs in Ratten, wie zuvor beschrieben 3, 5, wurde eine Reihe von Gewebeabschnitten bei 2 Monaten nach der Operation verarbeitet, wenn die Zahl der Inklusionsenthaling-Neuronen bekanntermaßen in der Die SNpc, für die Bestätigung der phosphorylierten α-syn Einschlüsse5. Inklusionsstoff-Neuronen, wie durch immunhistochemische Färbung für pSyn (Antikörper in Tabelle der Materialien) angegeben sind in der SNpc (Abbildung7), sowie andere Regionen im gesamten Gehirn, die das Striatum (vor olfaktorischer Kern, Motor, Kingulle, Piriform, Vorläu-Bisch, somatosensorische, entorhinale, und isolierte Kortikel, Amygdala, Striatum)1,3,4, 5,19. Diese Einschlüsse haben ähnliche Eigenschaften mit Lewy-Körpern, wie die Bindung von Thioflavin S und die Resistenz von totalem α-syn gegen ProteinaseK(Abbildung 7), wie die immunhistochemische Färbung (Antikörper und Proteinase K in derMaterialtabelle) zeigt. . Die Bestätigung der Aussaat im Gehirn deutet darauf hin, dass die in vivo Qualitätskontrolle bestanden wurde, und Aliquots von PFFs, die zuvor eingefroren und von der gleichen Charge gerettet wurden, können unter identischen Parametern, mit validierter Länge, in größeren Experimenten beschossen werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig1.jpg"> Bild 1 . Methoden zur Erzeugung von α-syn Fibrillen. Skizzieren Sie die Schritte, die für die Herstellung von Fibrillen aus α-syn-Monomeren erforderlich sind. Monomere sind 10 min zentrifugiert (15.000 x g, bei 4 ° C). Supernatant wird auf ein sauberes Rohr übertragen und die Proteinkonzentration wird entweder durch die Absorbierung bei 280 nm oder durch einen BCA-Test bestimmt. Grafik zeigt Konzentrationen von menschlichen und Maus α-syn Monomere. Spalten zeigen die Gruppenmittel an, Fehlenstangen stellen ± 1 Standardfehler des Mittels dar. Nachdem die Proteinkonzentration bestimmt ist, werden die α-syn-Monomere verdünnt, kurz veredelt und für 37 ° C für 7 Tage inkubiert, während sie auf einem Orbitalmischer bei 1.000 U/min schütteln. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig2.jpg"> Bild 2 . Stapelmethoden für die Transmissionselektronenmikroskopie. Diagramm der negativen Färbung für die Elektronenmikroskopie. A) Bilder, die die Elektronenmikroskopie darstellen. Das Gitter hat eine langweilige oder helle Seite und eine glänzende oder dunkle Seite. Die Schiny/dunkle Seite ist mit einer formvar/Carbon-Stützfolie beschichtet. B) Illustration des Färbeverfahrens. Das Gitter wird auf dem ersten Tropfen von ddH2 O für 1 Minuteschwebt und der Überschuss wird mit Filterpapier weggeschaltet. Der Prozess wird mit dem zweiten Tropfen von ddH2 O,verdünnten PFFs oder Monomeren, zwei Tropfen Uranyl-Acetat und zwei zusätzlichen Tropfen von ddH 2 O.Gitter können in einem Gitterkasten gespeichert werden, bis sie abgebildet sind. Skalierbalken = 3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig2large.jpg" target="_blank"></a> mm.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig3.jpg"> Bild 3 . Montage von eigenen Glasnadelspritzen. Diagramm der Stufen, die für die Montage von Glasnadel mit Spritzen erforderlich sind. Silikonkapillarrohre werden in der Mitte gezogen und geschnitten, um Glasnadeln zu erzeugen. Schrumpffolien werden zur Vorbereitung der Metallnadel und zur Bildung einer inneren Dichtung verwendet, wenn die Glasnadel auf die Metallnadel geschoben wird. Zur Sicherung der Glasnadel werden zwei zusätzliche Schrumpfschläuche hinzugefügt, die den Sockel der Glasnadel und die Metallnadel überlappen und Wärme auftragen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig4.jpg"> Bild 4 . Visualisierung von α-syn Monomeren und α-syn Fibrillen durch Transmissionselektronenmikroskopie. Repräsentative Mikrographen von α-syn Monomeren und Fibrillen. Top-Panels: Maus und Mensch α-syn Monomer. Mittlere Panels: Volle Länge Maus und menschliche α-syn PFFs. Unten Panels: Maus und menschliche α-syn PFFs nach der Sonisierung. Bottom-Grafik: Verteilung der klangierten Maus und der menschlichen α-syn PFF-Längen. Skalierbalken = 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig5.jpg"> Bild 5 . Bestätigung der Amyloidstrukturen durch thioflavin T Assay. Messung des Fluoreszenzsignals von Maus und menschlichen α-syn Monomer und PFF Proben. Links: Ergebnisse von Mäuse-α-syn Monomeren und α-syn PFFs. Rechts: Ergebnisse von menschlichen α-syn Monomeren und α-syn PFFs. In jedem Diagramm wird eine dPBS-Negativsteuerung angezeigt. Alle Messungen werden als relative Leuchtstoffeinheiten (RFU) ausgedrückt. Spalten zeigen die Gruppenmittel an, Fehlenstangen stellen ± 1 Standardfehler des Mittels dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig6.jpg"> Bild 6 . Sedimentations-Test für pelletable α-syn. Bilder von Coomassie gefärbten Gelen. Die gezeigten Bänder liegen bei etwa 14 kDa auf Basis der Proteinleiter. Links: Mausmonomer und PFFs. Rechts: Menschliche Monomere und PFFs. Für alle Monomer und PFF-Proben werden die wiederbelebten Pellets (P) und supernatant (S) angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig7.jpg"> Bild 7 . Merkmale der Einschlüsse im Rattenmodell, das die α-syn Pathologie bestätigt. Repräsentative Mikrographen aus der substantia nigra pars compacta bei 2 Monaten Nachinjektion. Links: Neuronen, die pSyn enthalten und mit Cresylviolett kontrastiert werden. Mitte: Thioflavin S positive Neuronen. Rechts: α-syn-haltige Einschlüsse, die gegen Proteinase K. Scale bar = 50 μm resistent <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig7large.jpg" target="_blank">sind.</a>

Das Ziel dieses Artikels ist es, die Schritte zu skizzieren, die für die Herstellung von Fibrillen aus monomem Alpha-Synuclein, anschließende Qualitätskontrolle und die Verwendung der vorgeformten Fibrillen in vivo erforderlich sind.

Generation von Alpha-Synuclein vorgeformten Fibrillen aus Monomers und Einsatz In Vivo

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

Das Alpha-Synuclein Preformed Fibril Modell wird von Labors weltweit verwendet, um Synukleinopathien zu untersuchen. Obwohl das Modell erfolgreich von vielen Labors verwendet wurde, haben einige Gruppen Inkonsistenzen erlebt, die Fibrillen erzeugen und konsistente Alpha-Synuclein-Pathologie erzeugen. Wir hoffen, dass dieses Protokoll, das die Entstehung von Fibrillen aus Alpha-Synuclein-Monomeren und die Verwendung von vorgeformten Fibrillen in vivo beschreibt, Fragen beantworten kann, die Forscher über die Verwendung des Modells haben.Das Alpha-Synuclein Preformed Fibril Modell rekapituliert Schlüsselmerkmale der Parkinson-Krankheit, wie Alpha-Synuclein Pathologie und Neurodegeneration. Und es hat sich gezeigt, dass es zu bescheidenen motorischen Beeinträchtigungen in einigen Tiermodellen führt. Die Bildung von Einschlüssen, die phosphoryliertes Alpha-Synuclein enthalten, und ein langwieriger Zeitverlauf in Richtung Neurodegeneration bietet Forschern verschiedene Stadien während des fortschreitenden Fortschreitens der Synukelosepathie, um potenzielle therapeutische Interventionen zu untersuchen und zu zielen.Unser Labortechniker Christopher Kemp demonstriert die Herstellung von kundenspezifischen Glasnadeln. Um dieses Verfahren zu beginnen, tauen Alpha-Synuclein-Monomere auf Eis. Die aufgetauten Monomere wurden durch sanftes Streichen auf die Röhre wieder aufgewirflimmert.Und Zentrifuge bei 15 000 g und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Dann übertragen Sie den Überstand auf ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und erfassen Sie die übertragene Menge. Die Monomere mit 1x dPBS auf eine Endkonzentration von 5 mg pro ml verdünnen.Kurz Wirbel zu mischen, und kurz Zentrifuge, um die gesamte Flüssigkeit an der Unterseite des Rohres zu sammeln. Als nächstes verwenden Sie Klebefolie, um den Mikrozentrifugenrohrdeckel geschlossen zu befestigen. Legen Sie das Rohr in einen Orbital-Thermomischer mit deckel für sieben Tage bei 37 Grad Celsius, während bei 1 000 U/min schütteln.Am Ende von sieben Tagen sollte der Inhalt der Röhre trüb erscheinen. Zuerst alle notwendigen persönlichen Schutzausrüstungen einschließlich Handschuhe, einen Labormantel und ein Gesichtsschild. Befestigen Sie dann in einer Zellkulturhaube eine Sonde mit einem Durchmesser von 3,2 mm am Konverter.Stellen Sie die Verstärkeramplitude der Beschallungsgeräte auf 30% und den Puls auf eine Sekunde und eine Sekunde aus und die Zeit auf eine Minute. Die Fibrillen bei Raumtemperatur auftauen und noch in der Kulturhaube verdünnen, die Fibrillen mit sterilen dPBS verdünnen. Als nächstes dämpfen Sie ein Laborgewebe mit 70% Ethanol und verwenden Sie dieses, um die Sonde des Beschallungsators zu wischen, um es zu reinigen.Untertauchen Sie die Spitze der Sonde in doppelt destilliertes Wasser und pulsieren Sie 10 Mal, um die Sonde weiter zu reinigen. Danach die Sonde mit einem Laborgewebe trocknen lassen. Legen Sie die gereinigte Sondenspitze in das Rohr von verdünnten Fibrillen und positionieren Sie die Spitze an der Unterseite des Rohres.Beschallen Sie die verdünnten Fibrillen unter Verwendung der zuvor eingestellten Parameter, während Sie die Sonde während jedes Pulses nach oben und unten bewegen, um sicherzustellen, dass alle Fibrillen in der Flüssigkeit beschallt werden. Nach der Beschallung kurz zentrifugieren für eine Sekunde bei 2.000 g, um die gesamte Flüssigkeit von den Seiten des Rohres zu sammeln. Untertauchen Sie die Sondenspitze in 1%SDS und pulsieren Sie 10 Mal, um die Sonde zu reinigen.Entfernen Sie dann die Spitze aus dem SDS, und tauchen Sie sie in doppelt destilliertes Wasser und pulsieren Sie 10 Mal. Wischen Sie die Sonde mit einem mit 70% Ethanol gedämpften Laborgewebe ab und wischen Sie sie mit einem trockenen Laborgewebe trocken. Lösen Sie die Sonde vom Konverter und speichern Sie sie.Danach alle Oberflächen in der Haube mit 1%SDS gefolgt von 70% Ethanol abwischen. Zunächst legen Sie ein silikonisiertes Glaskapillarrohr in einen Glasnadelzieher. Schalten Sie das Heizelement ein und lassen Sie die angeschlossenen Gewichte das beheizte Glaskapillarrohr dehnen.Als nächstes verwenden Sie eine Schere, um das gezogene Glaskapillarrohr an der dünnsten Stelle in der Mitte zu schneiden und die Glasnadel aus dem Glasnadelzieher zu entfernen. Dann verwenden Sie eine Schere, um eine Länge von Schrumpfwickelschläuchen auf ca. 40 mm zu schneiden. Schieben Sie die Schrumpffolie über die Metallnadel einer 10-Mikroliter-Abgeschrägtenspritze.Verwenden Sie eine offene Flamme, um zu erhitzen und haften Sie die Schrumpffolie an der Nadel, während Sie sicherstellen, dass die Nadel gedreht wird, um die Wärme gleichmäßig aufzutragen. Schieben Sie das größere Ende der gezogenen Glasnadel vorsichtig über die Metallnadel der Spritze. Danach eine Länge von Schrumpfwickelschläuchen auf ca. 40 mm schneiden und vorsichtig über die Glasnadel schieben, um die Basis der Glasnadel und die Metallnadel der Spritze zu überlappen.Verwenden Sie eine offene Flamme, um die Schrumpffolie zu erhitzen, um die Glasnadel an der Metallnadel zu befestigen. Um die Nadel weiter zu sichern und mögliche Leckagen zu vermeiden, schneiden Sie eine zusätzliche Länge von Schrumpfwickelschläuchen auf ca. 40 mm, und schieben Sie sie vorsichtig über die Glasnadel, um die Basis der Glasnadel und die Metallnadel der Spritze zu überlappen. Verwenden Sie eine offene Flamme, um die Schrumpffolie zu erhitzen, um die Glasnadel an der Metallnadel zu befestigen.Dann verwenden Sie eine Schere, um die Glasnadel so zu trimmen, dass die Spitze ca. 8 mm lang ist. Um die Nadel zu testen, füllen Sie eine 1 ml Spritze mit einer angeschlossenen 26-Spur-Nadel mit destilliertem Wasser. Entfernen Sie den Metallkolben aus der benutzerdefinierten Glasnadelspritze und legen Sie die Nadel der mit Wasser gefüllten Spritze in die Basis der benutzerdefinierten Spritze ein.Prüfen Sie die Schnittstelle der Glasnadel und der Metallnadel auf Leckagen und bestätigen Sie einen stetigen Wasserfluss. Dann füllen Sie ein Mikrozentrifugenrohr mit destilliertem Wasser. Verwenden Sie die benutzerdefinierte Glasnadelspritze, um das destillierte Wasser zu zeichnen.Prüfen Sie die Nadel, um zu bestätigen, dass Flüssigkeit in die Spritze aufgenommen wird und keine Blasen vorhanden sind. Wenn es Blasen gibt, oder wenn das Wasser nicht in die Nadel gezogen wird, kann das Trimmen der Nadel helfen, den Druck zu lindern. Danach die Spritze mit den beigefügten Glasnadeln vorsichtig in den Spritzenkästen aufbewahren, bis sie für Operationen benötigt werden.Die Untersuchung mit Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt das Vorhandensein von langen Fibrillen. Im Vergleich dazu sind Alpha-Synuclein-Monomere Gerste sichtbar und haben keine erkennbare Form. Analoide Bestätigung der Fibrillen wird dann mit einem Thioflavin T Assay bestätigt.Ein repräsentativer Test zeigt, dass die dPBS- und Mausmonomere ein geringeres Signal in relativen Mehlesent-Einheiten erzeugen als Maus-PFFs. Menschliches Alpha-Synuclein-Monomer erzeugt ein ähnliches Signal wie Mausmonomer. Während die menschlichen PFFs ebenfalls ein höheres Signal erzeugen als Monomere.Um das Vorhandensein von Pelitiblenfibrillen zu beschwichtigen, wird ein Sedimentationstest durchgeführt. Sowohl in der Maus als auch in menschlichen PFF-Proben sollte die supernate Verletzung mehr Protein im Pellet haben als der Überstand. Im Gegensatz dazu ist der Großteil des Proteins aus der Maus und menschlichen Monomeren im Überstand vorhanden, wobei wenig im Pellet vorhanden ist.Sowohl Maus- als auch menschliche PFFs werden beschallt, um PFFs von geeigneten Längen für die Aussaat von Alpha-Synuclein-Einschlüssen zu erzeugen. Eine umfassende Untersuchung von ca. 500 Fibrillen zeigt, dass die durchschnittliche Länge von Mausfibrillen etwa 44 Nanometer beträgt. Mit 86,6 % der PFFs, die 60 Nanometer oder weniger messen.Humane PFFs haben jedoch eine durchschnittliche Länge von etwa 55,9 Nanometern mit 69,6 % der PFFs, die 60 Nanometer oder weniger messen. Die In-vivo-Untersuchung der PFF-Wirksamkeit wird mit Hilfe der Immunhistochemie bestätigt. Einschlüsse, die in der Substantia nigra gebildet werden, haben ähnliche Eigenschaften wie Lewy-Körper, da sie phosphoryliertes Alpha-Synuclein enthalten, aminloyed Strukturen enthalten und mit Thioflavin S flecken und resistent gegen Proteinase-K-Verdauung sind.Die Beschallung kann die individuelle Beschallung aerosolisierten vorgeformten Fibrillen aussetzen. Daher sollte die richtige Sicherheitskleidung getragen und die Beschallung in einer Kapuze durchgeführt werden, um das Risiko einer Exposition zu minimieren.

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Forschung

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Neurowissenschaften

Dieses Video zeigt die Injektion von Alpha-Synuclein-Fibrillen in eine Maus, um eine Neuroinflammation zu induzieren. Die Fibrillen werden intraperitoneal in eine transgene Maus injiziert, die mutierte Alpha-Synuclein-Proteine exprimiert. Beim Erreichen des Zentralnervensystems dringen die Fibrillen in die Neuronen ein und induzieren die Aggregation der mutierten Proteine. Die Aggregate breiten sich auf benachbarte Neuronen, Mikroglia und Astrozyten aus. Die Erkennung der Aggregate löst bei...

Induktion von Neuroinflammation bei Mäusen durch Injektion von Alpha-Synuclein-Fibrillen

Dieses Video zeigt den Prozess der Quantifizierung der Alpha-Synuclein-Akkumulation in embryonalen Dopamin-Neuronen der Maus, die mit alpha-Synuclein-vorgeformten Fibrillen vorbehandelt wurden. Es werden die Schritte zur Fixierung, Färbung und Quantifizierung der Dopamin-Neuronen, die Alpha-Synuclein-Aggregate enthalten, mittels Immunfluoreszenz beschrieben.

Untersuchung der Alpha-Synuclein-Akkumulation in primären embryonalen Dopamin-Neuronen der Maus

Proteine können entweder eine native Struktur annehmen oder sich in unlösliches Amyloid fehlfalten. Bedingungen, die den Fehlfaltungsweg begünstigen, führen zur Bildung verschiedener Arten von Amyloidfibrillen. Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen eine schnelle Umwandlung von nativen Proteinen in Amyloid in vitro.

Schnelle Generierung von Amyloid aus nativen Proteinen in vitro

Es wird ein ELISA beschrieben, der einen neuartigen quantitativen Ansatz bietet. Er erkennt spezifisch krankheitsassoziiertes α-Synuclein (αSD) in einem transgenen Mausmodell (M83) der Synucleinopathie unter Verwendung mehrerer Antikörper entweder gegen die Serin129-phosphorylierte αS-Form oder den C-terminalen Teil des Proteins.

Nachweis von krankheitsassoziierten α-Synuclein durch verbesserte ELISA im Gehirn von transgenen Mäusen Expression Menschen A53T Mutierte α-Synuclein

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung von zunehmend unlöslichem/aggregiertem alpha-Synuclein (α-syn) aus postmortalem menschlichem Hirngewebe. Durch die Verwendung von Puffern mit zunehmender Detergensfestigkeit und Hochgeschwindigkeits-Ultrazentrifugationstechniken können die variablen Eigenschaften der α-syn-Aggregation in erkranktem und nicht erkranktem Gewebe untersucht werden.

Sequentielle Extraktion von löslichen und unlöslichen Alpha-Synuclein von Parkinson-Brains

Periphere Injektion von alpha-Synuclein - Fibrillen in das Peritoneum oder die Zunge von Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) Mäuse, der humanen alpha-Synuclein mit der familial A53T - Mutation exprimieren und Glühwürmchen - Luciferase kann Neuropathologie, einschließlich neuroinflammation induziert in ihrem Zentralnervensystem.

Biolumineszenz-Bildgebung von Neuroinflammation in transgenen Mäusen nach peripherer Inokulation von Alpha-Synuclein

Das Ziel dieses Protokolls ist, ein Zell-basierte System, das die Bildung von Alpha-Synuclein repliziert in Vivoaggregiert zu bieten. Intrazelluläre Alpha-Synuclein Einschlüsse sind in primären Neuronen durch die Internalisierung ausgesät und Vermehrung von exogenen verabreicht native microsomen-assoziierten Alpha-Synuclein-Aggregaten von erkrankten Alpha-Synuclein transgenen Mäusen isoliert.

Exogene Verabreichung von Alpha-Synuclein Microsomen verbundenen Aggregate zur primären Neuronen als eine mächtige Zellmodell der Fibrillen Bildung

Hier, Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll zur Untersuchung der neuronalen Synuclein-Akkumulation in primären Maus-Dopamin-Neuronen. Phosphorylierte-Synuclein-Aggregate in Neuronen werden mit vorgebildeten ,-Synuclein-Fibrillen induziert. Die automatisierte Bildgebung von immunfluorest markierten Zellen und die unvoreingenommene Bildanalyse machen dieses robuste Protokoll für das Screening von Medikamenten mit mittlerem bis hohem Durchsatz geeignet, die die Akkumulation von Synuclein...

Studium der vorgeformten Fibril-induzierten Synuclein-Akkumulation in primären embryonalen Maus-Midbrain-Neuronen

Ein in vivo physiologisches Modell von α-Synuclein ist erforderlich, um die Pathogenese der Parkinson-Krankheit zu untersuchen und zu verstehen. Wir beschreiben eine Methode zur Überwachung der Zytotoxizität und Aggregatbildung von α-Synuclein unter Verwendung eines humanisierten Hefemodells.

Eine Methode zur Untersuchung der Toxizität und Aggregation von α-Synuclein unter Verwendung eines humanisierten Hefemodells

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur intranasalen Verabreichung von α-Synuclein-Aggregaten. Diese Methode gibt Aufschluss über die α-Synuclein-Ausbreitung von der Riechschleimhaut zum Riechkolben bei der Parkinson-Krankheit.

Technik zur intranasalen Verabreichung von α-Synuclein-Aggregaten

Lernen Sie die standardisierte Generierung von Alpha-Synuclein vorgeformten Fibrillen aus Monomeren für Parkinson-Modellierung in Nagetieren. Dieses Protokoll sichert reproduzierbare Pathologie und validierte Qualitätskontrolle.

Generation von Alpha-Synuclein vorgeformten Fibrillen aus Monomers und Einsatz In Vivo

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