Name: RNA Next-Generation-Sequenzierung und eine Bioinformatik-Pipeline zur Identifizierung von ausgedrückten LINE-1s auf der Locus-spezifischen Ebene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Lernen Sie eine RNA-Sequenzierungsmethode zur lokusspezifischen Identifizierung authentischer LINE-1-Expression in menschlichen Zellen. Diese Bioinformatik-Pipeline eliminiert Transkriptionsrauschen durch manuelle Kuratierung.

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Wir danken Dr. Yan Dong für die DU145 Prostata-Tumorzellen. Wir danken Dr. Nathan Ungerleider für seine Beratung und Beratung bei der Erstellung von Supercomputer-Skripten. Ein Teil dieser Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse R01 GM121812 an PD, R01 AG057597 an VPB und 5TL1TR001418 an TK finanziert. Wir möchten auch die Unterstützung der Cancer Crusaders und des Tulane Cancer Center Bioinformatics Core anerkennen.

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Es hat sich gezeigt, dass die Aktivität von L1 genetische Schäden und Instabilität verursacht, die zu Krankheit27,28,29beitragen. Von den rund 5.000 volllangen L1-Kopien machen nur wenige Dutzend evolutionär junge L1-Exemplare den Großteil der Retrotransposition 2 aus. Es gibt jedoch Hinweise darauf, dass auch einige ältere, retrovertranspositionell-unüberzeugte L1snochin der Lage sind, DNA-schädigende Proteine 30 zu produzieren. Um die Rolle der L1s bei der genomischen Instabilität und Krankheit vollständig zu verstehen, muss der L1-Ausdruck auf der lokalen Ebene verstanden werden. Der hohe Hintergrund von L1-bezogenen Sequenzen, die in anderen RNAs enthalten sind, die nichts mit L1-RetrometverUmsetzung zu tun haben, stellt jedoch eine große Herausforderung bei der Interpretation authentischer L1-Ausdruck dar. Eine weitere Herausforderung bei der Identifizierung und damit dem Verständnis von Ausdrucksmustern einzelner L1-Loki tritt auf ihre sich wiederholende Natur, die nicht zulässt, dass viele kurze Lesesequenzen zu einem einzigen einzigartigen Ort abbilden. Um diese Herausforderungen zu meistern, haben wir den oben beschriebenen Ansatz entwickelt, um den Ausdruck einzelner L1-Lok-Daten anhand von RNA-Seq-Daten zu identifizieren.
Unser Ansatz filtert das hohe Niveau (über 99%) Von transkriptionalem Rauschen, das aus L1-Sequenzen erzeugt wird, die mit der RetroUmsetzung von L1 durch eine Reihe von Schritten nichts zu tun haben. Der erste Schritt ist die Vorbereitung von zytoplasmatischen RNA. Durch die Auswahl für zytoplasmatische RNA werden L1-bezogene Lesungen, die in der ausdrücklichen intronischen mRNA im Kern gefunden werden, deutlich erschöpft. Ein weiterer Schritt, um das Transkriptionsgeräusch, das nichts mit L1s zu tun hat, zu reduzieren, ist die Auswahl von polyadenylierten Transkripten. Dadurch wird L1-bezogenes Transkriptionslärm entfernt, das in nicht-mRNA-Arten gefunden wird. Ein weiterer Schritt beinhaltet eine strand-spezifische Sequenzierung, um Antisense L1-bezogene Transkripte zu identifizieren und zu eliminieren. Die Verwendung einer Anmerkung für L1s in voller Länge mit funktionalen Promoter-Regionen bei der Identifizierung der Anzahl der RNA-Seq-Transkripte, die auf L1s abbilden, beseitigt auch Hintergrundgeräusche, die sonst aus abgeschnittenen L1s stammen. Schließlich ist der letzte kritische Schritt zur Beseitigung von transkriptionalen Rauschen von L1-Sequenzen, die nichts mit L1-Retrostumtransposition zu tun haben, die manuelle Kuration von L1s, die identifiziert wurden, um RNA-Seq-Transkripte abzubilden. Die manuelle Kuration beinhaltet die Visualisierung jedes bioinformatisch identifizierbaren L1-Locus im Kontext seiner umgebenden genomischen Umgebung, um zu bestätigen, dass der Ausdruck vom L1-Promoter stammt. Dieser Ansatz wurde bei DU145, einer Prostata-Tumorzelllinie, angewandt. Selbst bei allen vorbereitungsbezogenen Maßnahmen zur Reduzierung des Hintergrundgeräusches wurden etwa 50% der in DU145 identifizierten L1-Loken als L1-Hintergrundgeräusche aus anderen Transkriptionsquellen abgelehnt (Abbildung4), Die Strenge betonen, die erforderlich ist, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Dieser Ansatz mit manueller Kuration ist arbeitsintensiv, aber bei der Entwicklung dieser Pipeline notwendig, um die genomische Umgebung rund um eine volle L1 zu bewerten und zu verstehen. Die nächsten Schritte beinhalten die Reduzierung der Menge der notwendigen manuellen Kuration durch die Automatisierung einiger der Kurationsregeln, obwohl aufgrund der noch nicht ganz bekannten Natur des genomischen Ausdrucks, unkommentierte Ausdrucksquellen im Referenzgenom, Regionen von niedrigem Die Ableitungsfähigkeit und sogar die Komplikationsfaktoren, die mit der Konstruktion eines Referenzgenoms verbunden sind, ist es zu diesem Zeitpunkt nicht möglich, die L1-Curation vollständig zu automatisieren.
Die zweite Herausforderung bei der Identifizierung des Ausdrucks einzelner L1-Lci mit Sequenzierung betrifft die Kartierung von wiederholten L1-Transkripten. In dieser Ausrichtungsstrategie ist es erforderlich, dass sich ein Transkript eindeutig und mitreiflich an das Referenzgenom ausrichten muss, um abgebildet zu werden. Durch die Auswahl für gepolsterte Sequenzen, die konkordant abbilden, steigt die Anzahl der Transkripte, die sich eindeutig an L1-Loki des Referenzgenoms angleichen. Diese uniquésie-mapping-Strategie gibt Vertrauen in die Anrufung von Lesekarten speziell an einen einzigen L1-Locus, obwohl sie möglicherweise die Ausdrucksmenge jedes identifizierten, authentisch zum Ausdruck gebrachten, wiederholten L1 unterschätzt. Um diese Unterschätzung annähernd zu korrigieren, wurde für jeden L1-Locus eine "Mappability"-Score entwickelt und auf die Anzahl der eindeutig kartografierten Transkriptionslesungen angewendet (Abbildung 6). Es ist zu beachten, dass im Idealfall die Mappability auf die volle Abdeckung der L1 nach dem passenden WGS-Muster gepunktet werden sollte. Hier verwenden wir WGS von HeLa-Zellen, um die Mappabilitätswerte jedes L1-Lokis zu bestimmen, um die Mapping-Ergebnisse in den DU145-Prostatatumorzelllinien zu entblößen oder zu deflate. Diese Mappabilitätsberechnung ist eine grobe Korrekturpunktzahl, aber die gewählte "vollständige Deckungsmappbarkeit" von 400 Lesezeichen wurde unter Berücksichtigung der Dynamik der Tumorzelllinien ermittelt. In der ergänzenden Abbildung 1ist zu beobachten, dass es ein paar L1-Loki mit HeLa WGS mit extrem hoher Anzahl von gemappten Lesevorgängen gibt. Diese stammen wahrscheinlich von duplizierten Chromosomensequenzen innerhalb von HeLa, die sich nicht innerhalb des Referenzgenoms befinden, weshalb diese Loci nicht ausgewählt wurden, um die vollständige Mappabilitätsabdeckung zu repräsentieren. Stattdessen wurde festgestellt, dass der Durchschnitt der 100-prozentigen Leselaabdeckung nach der ergänzenden Abbildung 1 rund 400 Lesezahlen ergibt und dann davon ausgegangen wurde, dass dieser Durchschnitt auch für die Tumorprostata-Linie DU145 gilt.
Diese Ausrichtungsstrategie mit 100-200 bp liest aus der RNA-Seq-Technologie auch bevorzugt für evolutionär ältere L1s innerhalb des Referenzgenoms, da ältere L1s im Laufe der Zeit einzigartige Mutationen angehäuft haben, die sie mehr mappbar machen. Dieser Ansatz hat daher eine begrenzte Empfindlichkeit, wenn es darum geht, die jüngste der L1s zu identifizieren, sowie nicht-referenzierende, polymorphe L1s. Um die jüngste von L1s zu identifizieren, schlagen wir vor, 5 ' RACE-Auswahl an L1-Transkripten und Sequenzierungstechnologie wie PacBio zu verwenden, die von längeren Lesezeichen 21 Gebrauch machen. Dies ermöglicht eine einmaligere Kartierung und damit eine sichere Identifizierung der ausgedrückten, jungen L1s. Durch die gemeinsame Nutzung von RNA-Seq und PacBio-Ansätzen kann dies zu einer umfassenderen Liste authentischer Ausgedrücker L1s führen. Um authentisch ausgesprochene polymorphe L1s zu identifizieren, sind die ersten nächsten Schritte die Konstruktion und das Einfügen polymorphischer Sequenzen in das Referenzgenom.
Die biologischen und technischen Herausforderungen bei der Untersuchung von Wiederholungssequenzen sind groß, obwohl wir mit dem oben genannten rigorosen Verfahren zur Beseitigung von Transkriptionsgeräuschen von L1-Sequenzen, die nicht mit der Retrotransposition in Verbindung stehen, mit der RFA-Sequenzierungstechnologie beginnen, durchzusickern. Die großen Ebenen des transkriptionalen Hintergrundrauschen und das Zumaß an selbstbewusstem und strenger Identifizierung von L1-Expressionsmustern und-Quantität auf der individuellen Locus Ebene.

Retrotransposons sind wiederholte DNA-Elemente, die in einem Copy-and-Paste-Mechanismus über RNA-Zwischenprodukte im Genom "springen" können. Ein Teil der Retrotransposons ist als Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) bekannt und bildet mit über 500.0000 Exemplaren1ein Sechstel des menschlichen Genoms aus. Trotz ihres Überflusses sind die meisten dieser Exemplare defekt und mit nur geschätzten 80-120 L1-Elementen abgeschnitten, die als aktiv angesehen werden. Ein L1 in voller Länge ist etwa 6 kb lang mit 5 ' und 3 ' unübersetzten Regionen, einem internen Promoter und dem dazugehörigen Anti-Sinse-Promoter, zwei nicht überlappenden offenen Lesefahmen (ORFs) und einem Signal-und PolyA-Schwanz3,4,5 . Beim Menschen bestehen L1s aus Unterfamilien, die sich durch evolutionäre Zeitalter auszeichnen, wobei die älteren Familien im Laufe der Zeit im Vergleich zur jüngsten Unterfamilie, L1HS 6,7,einzigartigeSequenzmutationen angehäuft haben. L1s sind die einzigen autonomen, menschlichen Retrotransposons und ihre ORFs kodieren eine umgekehrte Transkriptase, Endomuclease und RNPs mit RNA-Bindungs-und Chaperone-Aktivitäten, die erforderlich sind, um das Nachsetzen und Einfügen im Genom in einem Prozess, der als zielgrundiert bezeichnet wird. Rückschrift8,9, 10,11,12.
Es wurde berichtet, dass die RetroUmsetzung von L1s durch eine Vielzahl von Mechanismen, darunter die Einfügung von Mutagenese, die Streichung von Zielvorgaben und die Neuordnungvon13, 14, 15, die durch eine Vielzahl von Mechanismen,darunterdie Einfügung von Mutagenese, die Streichung von Zielvorgaben und die Neuordnung 13,14,15 , 16. In jüngster Zeit wurde vermutet, dass L1s eine Rolle bei der Onkogenese und/oder Tumorfortschritt spielen können, da in einer Vielzahl von epithelialen Krebserkrankungen 17, 18 eineerhöhte Ausdrucks-und Einfügeungsereignisse dieses mutagenischen Elements beobachtet wurden. . Es wird geschätzt, dass es eine neue L1-Einlage in jeder 200 Geburten 19 gibt. Daher ist es unerlässlich, die Biologie des aktiven Ausdrucks L1s besser zu verstehen. Die sich wiederholende Natur und die Fülle an defekten Kopien, die in Transkripten anderer Gene gefunden wurden, haben diese Analyse herausfordernd gemacht.
Glücklicherweise wurden mit dem Aufkommen von Technologien für die Sequenzierung hoher Durchsatzsequenzierungstechnologien Schritte unternommen, um die L1s auf der lokalen Ebene authentisch auszudrücken und zu identifizieren. Es gibt unterschiedliche Philosophien darüber, wie man ausgedrückte L1s am besten identifizieren kann, indem man die Sequenzierung der nächsten Generation der RNA verwendet. Es wurden nur zwei vernünftige Ansätze für die Kartierung von L1-Transkripten auf der locus-spezifischen Ebene vorgeschlagen. Man konzentriert sich nur auf die mögliche Transkription, die sich durch das L1-Polyadenylierungssignalundin Flankierungssequenzen 20 liest. Unser Ansatz nutzt kleine Sequenzunterschiede zwischen den L1-Elementen und bildet nur jene RNA-Seq-Lesungen ab, die eineeinzigartige Karte zu einem Ort 21 führen. Beide Methoden haben Einschränkungen in Bezug auf die Quantifizierung der Transkriptionsstufen. Die Quantitation kann potenziell verbessert werden, indem eine Korrektur für die "einzigartige Abbildung" jedes L1-Locus21 hinzugefügt wird, oder durch die Verwendung komplexerer Algorithmen, die die mehrfach abgebildete Lesezeichen, die nicht eindeutig auf einen bestimmten Locus 22 abgebildet werden konnten, umverteilen. Hier werden wir Schritt für Schritt das RNA-Extraktions-und Sequenzierungs-und Bioinformatikprotokoll detailliert erläutern, um die ausgesprochenen L1-Elemente auf der lokalen Ebene zu identifizieren. Unser Ansatz nutzt unser Wissen über die Biologie funktionaler L1-Elemente. Dazu gehört auch, zu wissen, dass funktionale L1-Elemente aus dem L1-Promoter generiert werden müssen, der zu Beginn des L1-Elements initiiert wurde, in das Zytoplasma übersetzt werden müssen und dass ihre Transkripte mit dem Genom nebeneinander erfolgen sollten. Kurz gesagt, wir sammeln frische, zytoplasmatische RNA, wählen für polyadenylierte Transkripte aus und nutzen stationsspezifische RNA-Seq-Analysen, um die Leselesungen im menschlichen Referenzgenom auf einzigartige Karte zu stellen. Diese ausgerichteten Lesevorgänge erfordern dann noch eine umfangreiche manuelle Kuration, um festzustellen, ob die Transkriptionslesungen vom L1-Promoter stammen, bevor sie einen Locus als authentisch ausdrückte L1 bezeichnen. Wir verwenden diesen Ansatz auf der Prostata-Tumorzellen-Stichprobe von DU145, um zu zeigen, wie sie relativ wenige aktiv transkribierte L1-Mitglieder aus der Masse inaktiver Kopien identifiziert.

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES</td><td>Affymetrix</td><td>AAJ16924AE</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Invitrogen</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Bioanalysator 2100</td><td>Agilent technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>bedtools.26.0</td><td></td><td></td><td>https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/content/installation.html</td></tr><tr><td>bowtie-0.12.8</td><td></td><td></td><td>https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/0.12.8/</td></tr> <tr><td>Zellenschaber</td><td>Olympus plastics</td><td>25-270</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Research Products International Corp</td><td>50-488-644</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>Gibco (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)</td><td>Invitrogen</td><td>10-010-049</td><td></td></tr><tr><td>Homogenisator</td><td>Thomas Scientific</td><td>BBI-8541906</td><td></td></tr><tr><td>IGV 2.4</td><td></td><td></td><td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/download</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher</td><td>A416-500</td><td></td></tr><tr><td>mac2unix</td><td></td><td></td><td>https://sourceforge.net/projects/cs-cmdtools/files/mac2unix/</td></tr> <tr><td>Q-tips</td><td>Fisher</td><td>23-400-122</td><td></td></tr><tr><td>RNAse spätere Lösung</td><td>Invitrogen</td><td>AM7022</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase Dekontaminationslösung</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>samtools-1.3</td><td></td><td></td><td>https://sourceforge.net/projects/samtools/files/</td></tr> <tr><td>sratoolkit.2.9.2</td><td></td><td></td><td>https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/Downloads</td></tr><tr><td>SUPERase&middot; In RNase Inhibitor</td><td>Invitrogen</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15-596-018</td><td></td></tr><tr><td>Wasser (DNASE, RNASE frei)</td><td>Fisher</td><td>BP2484100</td><td></td></tr></tbody></table>

rna next-generation-sequenzierung und eine bioinformatik-pipeline zur identifizierung von ausgedrückten line-1s auf der locus-spezifischen ebene

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

Long INtersed Elements-1 (LINEs/L1s) sind wiederholte Elemente, die sich kopieren und zufällig in das Genom einfügen können, was zu genomischer Instabilität und Mutagenese führt. Das Verständnis der Ausdrucksmuster von L1 loci auf der individuellen Ebene wird das Verständnis der Biologie dieses mutagenischen Elements ermöglichen. Dieses autonome Element macht mit über 500.000 Exemplaren einen erheblichen Teil des menschlichen Genoms aus, obwohl 99% abgeschnitten und defekt sind. Ihre Fülle und die dominante Anzahl an defekten Kopien machen es jedoch schwierig, authentisch ausgesprochene L1s aus L1-bezogenen Sequenzen zu identifizieren, die als Teil anderer Gene ausgedrückt werden. Es ist auch eine Herausforderung, zu erkennen, welcher spezifische L1-Locus aufgrund der sich wiederholenden Natur der Elemente ausgedrückt wird. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, stellen wir einen bioinformatischen Ansatz RNA-Seq vor, um den L1-Ausdruck auf der lokalen Ebene zu identifizieren. Zusammenfassend können wir zytoplasmatische RNA sammeln, für polyadenylierte Transkripte auswählen und strand-spezifische RNA-Seq-Analysen nutzen, um die Leselesungen auf L1 loci im menschlichen Referenzgenom eindeutig zu kartieren. Wir kuratieren jeden L1-Locus visuell mit einzigartig abgebilteten Lesezeichen, um die Transkription von seinem eigenen Promoter zu bestätigen und die Abschrift der Transkriptionslesungen anzupassen, um die Abbildung jedes einzelnen L1-Locus zu berücksichtigen. Dieser Ansatz wurde auf eine Prostata-Tumorzelllinie, DU145, angewendet, um die Fähigkeit dieses Protokolls zu demonstrieren, den Ausdruck aus einer kleinen Anzahl von L1-Elementen in voller Länge zu erkennen.

Die oben beschriebenen und grafisch beschriebenen Schritte wurden auf eine menschliche Prostata-Tumorzelllinie DU145 angewendet. Die RNA-Probe wurde zytoplasmisch vorgepresst und in einem mehr-A ausgewählten, strand-spezifischen, paired-End-Protokoll sequenziert. Mit Bowtie wurden die Paired-End-Sequenzierungsdateien ausgerichtet, so dass nur einzigartige Übereinstimmungen möglich waren, in denen das gepolsterte Ende besser auf einen genomischen Ort im Vergleich zu jedem anderen genomischen Ort passte. Die DU145-Sequenzdateien wurden auf das menschliche Nachschlagewerk ausgerichtet, das eine bam-Datei erstellt, die auf Wunsch des Autors verfügbar ist. Mit Hilfe von Bettwerkzeugen wurden Daten aus den DU145 strand-getrennten Bam-Dateien auf die Anzahl der auf L1s in voller Länge abgebildeten Lesezeichen extrahiert. Diese Lesevorgänge wurden in einer Tabelle von der größten bis zur kleinsten sortiert und manuell kuratiert, indem die genomische Umgebung um jeden L1-Locus in IGV untersucht wurde, um seine Authentizität zu bestätigen (Supplemental Table 1). Wenn eine Probe kuratiert wurde, um authentisch ausgedrückt zu werden, war sie farblich grün mit einer Erklärung für ihre Akzeptanz in der rechten Spalte. Beispiele von L1 loci, die nach den in der Methodensektion beschriebenen Richtlinien authentisch ausgedrückt werden, sind in Abbildung2a-b dargestellt. Wurde eine Probe abgelehnt, um authentisch ausgedrückt zu werden, so wurde sie farblich rot mit dem Grund für die Ablehnung auf der rechten Spalte. Beispiele von L1 loci, die aufgrund des Ausdrucks eines Promoters abgelehnt wurden, die nicht die eigenen folgenden Richtlinien, die im Methodenbereich beschrieben sind, sind in Abbildung2c-e detailliert.
Hier wurden nur abendfüllende L1s mit einer intakten Förderregion untersucht. Wenn diese Unterscheidung nicht gemacht wird, wird eine große Quelle von transkriptionalem Rauschen aus abgeschnittenen L1s eingeführt. Beispiele für abgeschnittene L1s in DU145 sind in Abbildung 3a-b zu sehen, wo sie als eindeutig abgebildete RNA-Seq-Lesungen identifiziert wurden. In der IGV zeigt sich jedoch, dass diese Transkripte nicht aus dem abgeschnittenen L1, sondern aus der Aufnahme der L1-Sequenz in ein Gen oder stromabwärts eines ausgedrückten Gens initiiert wurden.
Insgesamt beträgt der Anteil der L1-Level und der L1-Lesungen, die nach der manuellen Kuration als authentisch ausgedrückt werden, in DU145 etwa 50% (Ergänzungstabelle 2), die den hohen Anteil der L1-Abschrift auslösten, die den hohen Grad der L1-Abschrift aufzeigen, die Ansonsten werden sie ohne manuelle Kuration als falsches Positives aufgezeichnet. Konkret gab es in DU145 114 L1-Levo-Klassen in voller Länge, die mit insgesamt 3.152 Lesungen einzigartig in der Sinnesrichtung abgebildet waren, aber es wurden nur 60 Loci identifiziert, die nach manueller Kuration mit 1.879 Lesezeichen von ihrem eigenen Promoter ausgedrückt werden ( Ergänzende Tabelle 1). Dies ist auch der Fall, wenn Schritte unternommen wurden, um den Ausdruck zu reduzieren, der für die L1-Biologie irrelevant ist, indem sie für zytoplasmatische mRNA ausgewählt wurde. Beachten Sie, dass der Locus mit der höchsten Stufe der gemappten Transkripte in DU145 abgelehnt wurde, weil es sich nicht um eine authentisch ausgedrückte L1 handelte (Abbildung4). Insgesamt liegt die Anzahl der gemappten Transkripte auf bestimmte L1-Lok-Bereiche ähnlich zwischen dem akzeptierten und abgelehnten L1-Lci, wiesie nach der manuellen Kuration authentisch ausgedrückt werden (Abbildung 4).
Nach der manuellen Kuration reicht die Anzahl der Lesezeichen, die eine einzigartige bis authentisch ausgedrückte spezifische L1-Loka in DU145 darstellen, von 175 Lesezeichen bis hin zu einem willkürlich gewählten minimalen Ausschnitt von 10 Lesezeichen (Abbildung 5). Dieser Ansatz, eindeutig abgebildeter Transkriptionslesung auf L1s zu identifizieren, schränkt die Fähigkeit ein, den Ausdruck genau zu quantifizieren. Um dies zu berücksichtigen, wurde für jeden Locus ein Korrekturfaktor erstellt, der auf seiner Anordnbarkeit basiert. Um diesen Korrekturfaktor zu erzeugen, wurden erste Bettwerkzeuge verwendet, um die Anzahl der einzigartig gemappten Lesezeichen aus der HeLa genomic bam-Datei zu extrahieren, die sich an alle L1-Loki in voller Länge ausrichteten und diese Loci von den höchsten bis zu den niedrigsten abgebildeten Transkriptionslesungen (Supplemental) (Supplemental ) Abbildung 1). Es wurde willkürlich festgestellt, dass L1s mit 400 Lesungen die volle Deckungsmappbarkeit hatten. Die Anzahl der reads, die in der Lage sind, auf einen L1-Locus in HeLa genomischer Sequenzierprobe abzubilden, wurde im Vergleich zu 400 Leseproben skaliert, und diese skalierte Zahl wurde dann mit der Anzahl der Lesezeichen multipliziert, die auf jeden authentisch ausgedrückten L1-Loki in DU145 (Supplemental Table 2) abgebildet wurden. . Erwartungsgemäß stammten die L1-Elemente, die größere Korrekturwerte für die Machbarkeit hatten, von jüngeren Unterfamilien wie L1PA2 (Ergänzende Tabelle 2). Sobald die Lesewerte für die Mappabilitätswerte in jedem Ort angepasst wurden, erhöhte sich die Quantitation für den Ausdruck für die meisten Loci (Abbildung6). Die Anzahl der reads, die in einzigartiger Weise bis authentisch zum Ausdruck gebracht wurden, bestimmte L1-Loki mit Mappabilitätskorrekturen in DU145 reichten von 612 bis 4 Lesungen und es gab eine Neuordnung von höchster auf die niedrigste Ausdruckloci (Abbildung6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig01v2.jpg"> Abbildung 1: Workflow schematisch. Grafisch beschrieben sind die Schritte zur Identifizierung der ausgesprochenen L1s in einer menschlichen Probe. Beachten Sie, dass die Schritte 1 und 2 nicht wiederholt werden müssen, wenn die entsprechenden Dateien bereits verfügbar sind. Diese entsprechenden Dateien können von Supplement File 1a-b und Supplement File 2heruntergeladen werden. Die Boxen in rot zeigen die Schritte an, in denen das Coverage-Programm für bedtools verwendet wird, um die Anzahl der Lesezeichen, die in der gleichen Sinnesrichtung auf L1 abgebildet sind, zu zählen. Diese Loci mit sinnorientierten Mappinglesungen sind die L1s, die manuell kuratiert werden sollten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig02v2.jpg"> Abbildung 2: Beispiele für kuratierte L1 Loci in DU145. In IGV eingeladen sind das Referenzgenom, die Volllänge der L1 gff-Annotationsdatei, die der Referenzgenomversion entspricht (Supplement File 1), die DU145 bam-Datei und schließlich die genomische Heal-Bam-Datei zur Beurteilung der Mappability, die alle auf Autor verfügbar sind. bitte. Es wurden Pfeile hinzugefügt, die bei der Visualisierung der Richtung des kommentierten L1 helfen. Pfeile und Lesungen in rot sind in der Reihenfolge von rechts nach links ausgerichtet. Pfeile und Lesungen in Blau sind in der Reihenfolge von links nach rechts ausgerichtet. A) In IGV scheint dieser L1-Locus von seinem eigenen Promoter ausgedrückt zu werden, da es keine Lesungen vor der L1 in der Sinnesorientierung für über 5 kb gibt. Diese L1 hat eine geringe Mappbarkeit, sie befindet sich nicht in einem Gen und hat Hinweise auf eine erwartete Antisense-Promoter-Aktivität26. B) In IGV scheint dieser L1-Locus von seinem eigenen Promoter ausgedrückt zu werden, da es keine Lesungen vorwärts der L1 in der Sinnesorientierung für über 5 kb gibt. Diese L1 hat eine geringe Mappbarkeit und befindet sich in einem Gen der entgegengesetzten Richtung. C) In IGV wurde dieser L1-Locus als ausgedrückter L1 abgelehnt, da es vorgelagerte Lesezeichen in der gleichen Ausrichtung innerhalb von 5 kb gibt. Diese L1 befindet sich in einem Gen der gleichen Richtung, so dass die Abschrift liest, die höchstwahrscheinlich vom Promoter des ausgedrückten Gens stammen. d) In IGV wurde dieser L1-Locus als ausgedrückter L1 abgelehnt, da es vorgelagerte Lesungen in der gleichen Ausrichtung innerhalb von 5 kb gibt. Diese L1 ist stromabwärts eines stark ausgedrückten Gens in die gleiche Richtung, so dass die Abschrift liest, die höchstwahrscheinlich vom Promoter des ausgedrückten Gens stammt und über den normalen Gen-Terminator hinausgeht. E) In IGV wurde dieser L1-Locus als ausgedrückter L1 abgelehnt, da es vorgelagerte Lesezeichen in der gleichen Ausrichtung innerhalb von 5 kb gibt. Diese L1 befindet sich nicht innerhalb oder in der Nähe eines kommentierten Gens im Referenzgen, so dass der Ursprung dieser Transkripte innerhalb und vor dem L1-Element auf einen nicht kommentierten Promoter hindeutet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig03v2.jpg"> Abbildung 3: Hintergrundgeräusche entstehen auch von abgeschnittenen L1s. Unsere L1-Anmerkung enthält keine abgeschnittenen L1s, da sie eine wichtige Quelle für Hintergrundgeräusche sind. Es wurden Pfeile hinzugefügt, die bei der Visualisierung der Richtung des kommentierten L1 helfen. Pfeile und Lesungen in Blau sind in der Reihenfolge von links nach rechts ausgerichtet. A) Demonstriert wird ein Beispiel für eine abgeschnittene L1 in der L1MB5-SuFamilie, die 2706 bps beträgt. In der IGV zeigt sich, dass die Lesungen aus der nachgelagerten Verlängerung eines ausgedrückten Gens stammen. B) Schein ist ein weiteres Beispiel für eine abgeschnittene L1. Dieser L1 ist ein L1PA11, der 4767 bps lang ist. In der IGV zeigt sich, dass die Lesezeichen, die auf die L1 einmalig sind, aus dem ausdrücklichen Exon stammen, in dem sich die L1 befindet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig04v2.jpg"> Abbildung 4: Die Transkription liest, dass die Karte in einzigartiger Weise auf alle in voller Länge intakten L1s im menschlichen Genom, die in der DU145 Prostatatumorzelllinie ausgedrückt wird, ist. In Schwarz sind die spezifischen Loci, die nach der manuellen Kuration als authentisch ausgedrückt identifiziert werden sollen, und in Rot sind die spezifischen Loci, die nach der manuellen Kuration als authentisch ausgedrückt werden sollen. In grau sind loci mit weniger als zehn Lesezeichen, die zu jedem abgebildet werden. Da diese Loci einen kleinen Bruchteil der Transkriptionslesungen repräsentieren, wurden sie nicht manuell kuratiert. Die x-Achsen-Zeckenmarkierungen bezeichnen alle 100 volllangen, intakten L1s. Etwa 4.500 Loci werden nicht grafisch dargestellt, da sie null abgebildete Lesezeichen hatten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig05v2.jpg"> Abbildung 5: Das Transkript liest, dass die Karte in der DU145-Prostata-Tumorzelllinie einzigartig bis authentisch ausgedrückt wird. Gezeigt werden die Zahlen der Transkriptionslesungen, die nach der manuellen Curation zu bestimmten Loci in DU145-Zellen führen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59771/59771fig06v2.jpg"> Abbildung 6: Liest Mapping to authentily ausdrückte L1, wenn sie durch die Mappability angepasst wird. Gezeigt werden die Zahlen der Transkriptionslesungen, die durch die Anzahl der loci-spezifischen Mappability-Werte angepasst wurden, die in den DU145-Zellen auf manuell kuratierte L1-Lci abbilden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/59771fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
Ergänzende Datei 1: Anmerkungen für die volle Länge, intakte menschliche L1s nach Orientierung.a) FL-L1-BLAST _ RM _ minus.gff. B) FL-L1-BLAST _ RM _ plus.gff. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/SupplementalFile1.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 2: Supercomputer-Skripte, die zur Automatisierung der Bioinformatik-Pipeline verwendet werden, die in Abschnitt 4 beschrieben ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/SupplementalFile_2.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 1: Genomische DNA-Probe, die zur Bestimmung der L1-Mappability verwendet wird. Gezeigt werden die Anzahl der genomischen Transkriptrie-Lesungen aus der HeLa-Zell-Linien-Probe, die eindeutig auf alle 5.000 L1-Losi im Genom abbilden. Es wurde angegeben, dass eine L1 die volle Deckungsmappbarkeit hat, wenn 400 Karte auf die L1 liest. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/SupplementalFigure_1.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Zahl herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 1: Manuelle Auskuration von L1s in DU145. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 2: Kuratierte L1s in DU145 mit der Anpassung der Mappfähigkeit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59771/Supplemental_Table_2.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Hier stellen wir einen bioinformatischen Ansatz und Analysen vor, um LINE-1-Ausdruck auf der ortsspezifischen Ebene zu identifizieren.

RNA Next-Generation-Sequenzierung und eine Bioinformatik-Pipeline zur Identifizierung von ausgedrückten LINE-1s auf der Locus-spezifischen Ebene

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...

Mobile Elemente sind eine der Hauptquellen der menschlichen genetischen Instabilität. Das Verständnis ihrer Expression in verschiedenen Geweben und Bedingungen ist entscheidend, um ihre Auswirkungen auf das Genom zu verstehen. Die vielzahl von L1-Transkripten sind das Ergebnis der passiven Aufnahme von L1-bezogenen Sequenzen in andere Transkripte, die keine Rolle im L1-Lebenszyklus spielen.Unser Ansatz beseitigt diesen irrelevanten Hintergrund. Dieses Protokoll kann an Studien von jedem mobilen Element oder sogar Viren in jeder Sequenz Genom angepasst werden. Es muss zumindest eine gewisse Sequenzvariation geben, um eine Diskriminierung zwischen loci zu ermöglichen.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend für die Veranschaulichung der Stringenz und Sorgfalt, die erforderlich ist, um ausgedrückte L1-Wiederholungselemente auf der locus-spezifischen Ebene sicher zu identifizieren. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der zytoplasmatischen RNA-Extraktion und der Sequenzierung der nächsten Generation, wie im Textprotokoll beschrieben. Durch die Auswahl der zytoplasmatischen RNA werden L1-bezogene Lesevorgänge, die innerhalb der introtronischen mRNA im Kern gefunden wurden, signifikant erschöpft.In der Sequenzierungsbibliotheksvorbereitung umfasst ein weiterer Schritt zur Reduzierung von Transkriptionsgeräuschen, die nichts mit L1s zu tun haben, die Auswahl polyadenylierter Transkripte. Dadurch werden L1-bezogene Transkriptgeräusche entfernt, die bei Nicht-mRNA-Arten gefunden werden. Führen Sie die Ausrichtungsparadigmensequenzierung von FASTQ-Dateien mit der RNA-Seq-Probe von Interesse mit bowtie1 aus, indem Sie die Befehlszeile in das Linux-Terminal eingeben.Diese Ausrichtungsstrategie erfordert, dass die Transkripte eindeutig und kollidierend mit einer umfassenden genomischen Suche abgestimmt werden. Diese Strategie bietet Vertrauen in das Aufrufen von Lesezuordnungen speziell für einen einzelnen L1-Standort. Strang trennen die Ausgabe-BAM-Dateien mit SAMtools und Linux-Befehle für den oberen Strang und den unteren Strang zu wählen.Beachten Sie, dass die tatsächlichen Flagwerte variieren können, wenn sie keine Standardmäßigen Sequenzierungsprotokolle der nächsten Generation verwenden. Dieser Strangtrennschritt arbeitet, um das Transkriptionsrauschen herauszufiltern, das in L1-Sequenzen erzeugt wird, die nichts mit der L1-Retrotransposition zu tun haben, indem potenzielle Antisense-L1-bezogene zugeordnete Lesevorgänge eliminiert werden. Generieren Sie Lesezählungen anhand von Anmerkungen für L1-Loci mithilfe von Betthockern.Geben Sie zuerst die Befehlszeile ein, um Lesezähler für L1s in der Sinnesrichtung auf dem oberen Strang zu generieren, und geben Sie dann die Befehlszeile ein, um Leseanzahl für L1s in der Sinnesrichtung am unteren Strang zu generieren. Die Zur Identifizierung von L1s verwendeten Anmerkungen bezeichnen L1s in voller Länge mit funktionalen Promotorregionen, die hintergrundgeräusche beseitigen, die sonst von abgeschnittenen L1s stammen. Erstellen Sie eine Tabelle für Lesevorgänge, die jedem annotierten L1-Lokus zugeordnet sind.Kopieren Sie über die generierte Lesezähler-Textdatei, die für den unteren Strang erstellt wurde, und beschriften Sie die Seite als minus_bottom. Sortieren Sie alle Spalten basierend auf der höchsten bis niedrigsten Anzahl von Lesevorgängen in Spalte J.Copy über die generierte Textdatei für Lesezahlen, die für den oberen Strang erstellt wurde. Sortieren Sie alle Spalten basierend auf der höchsten bis niedrigsten Anzahl von Lesevorgängen in Spalte J.Und beschriften Sie die Seite als top_plus.Erstellen Sie eine dritte Seite mit der Bezeichnung "kombiniert" und fügen Sie alle Loci mit 10 oder mehr Lesevorgängen aus minus_bottom und plus_top Seiten hinzu. Sortieren Sie alle Spalten basierend auf der höchsten bis niedrigsten Anzahl von Lesevorgängen in Spalte J.To die Mappbarkeit von Genomregionen unterstützen, insbesondere in oder in der Nähe von L1 loci, ganze Genom-gekoppelte und Sequenzierungsdateien der arten von Interesse wurden von NCBI heruntergeladen und in FASTQ-Dateien konvertiert, wie im Textprotokoll beschrieben. Indizieren Sie nun die BAM-Dateien, um sie im Integrativen Genomics Viewer, abgekürzt IGV, sichtbar zu machen, bevor Sie die Dateien laden.In IGV laden Sie das Referenzgenom von Interesse, um annotierte Gene zu visualisieren. Laden Sie auch die Anmerkungsdatei für L1-Elemente in voller Länge, um die L1-Anmerkung, die BAM-Datei für die menschliche RNA-Expression, zu visualisieren, um zugeordnete Transkripte aus der Stichprobe von Interesse und die BAM-Datei für die Genom-Mappbarkeit des menschlichen Genoms zu visualisieren, um die Mappbarkeit genomischer Regionen zu bewerten. Entfernen Sie Abdeckungs- und Knotenzeilen, die jeder BAM-Datei zugeordnet sind.Komprimieren Sie die BAM-Dateien für die menschliche RNA-Expression und für die Menschliche Genom-Mappbarkeit, so dass alle IGV-Spuren auf einem Bildschirm passen. Der letzte kritische Schritt bei der Beseitigung von Transkriptionsrauschen von L1-Sequenzen, die nichts mit l1-Retrotransposition zu tun haben, ist die manuelle Erstellung von L1-Dateien in voller Länge, die rna-Suchtranskripte zugeordnet haben. Die manuelle Kuration beinhaltet die Visualisierung jedes exprimierbaren L1-Lokus im Kontext seiner umgebenden genomischen Umgebung, um zu bestätigen, dass der Ausdruck vom L1-Promotor stammt.Mithilfe von Koordinaten aus L1-Loci, die auf der kombinierten Tabellenseite aufgeführt sind, kuratieren Sie jeden L1-Lokus manuell mit eindeutig zugeordneten Transkripten, indem Sie ihre umgebende genomische Umgebung in IGV untersuchen. Kuratieren Sie einen Ort, der authentisch von sich aus ausgedrückt wird, wenn es keine Lesevorgänge stromaufwärts in L1-Richtung bis zu fünf Kilobasen gibt. Beschriften Sie die Zeile grün in Farbe und beachten Sie, warum es sich um ein authentisch ausgedrücktes L1 handelt. Eine Ausnahme von dieser Regel ist vorhanden, wenn die Region vor der L1 nicht zugeordnet werden kann.Wenn dies der Fall ist, beschriften Sie die Zeile rot in Farbe, und beachten Sie, dass der Ausdruck des Bereichs vor dem L1-Promoter nicht ausgewertet werden kann und daher der Ausdruck des L1 nicht sicher bestimmt werden kann. Kuratieren Sie einen Ort, der nicht authentisch von seinem eigenen Promoter ausgedrückt wird, wenn es Lesungen vorgelagert bis zu fünf Kilobasen gibt. Beschriften Sie die Zeile rot in Farbe und beachten Sie, warum es sich nicht um ein authentisch ausgedrücktes L1 handelt. Kuratieren Sie einen Ort als falsch, wenn er in einem Intron eines exprimierten Gens in die gleiche Richtung exprimiert wird, mit Lesevorgängen vor dem L1, wenn er einem exprimierten Gen in die gleiche Richtung mit Lesevorgängen vor dem L1 nachgelagert ist, oder für unannotierte Expressionsmuster mit Lesevorgängen vor dem L1. Eine Ausnahme von dieser Regel gilt, wenn minimale Lesevorgänge direkt überlappen die L1-Promoter-Startsite, aber etwas vor der L1. Wenn es keine anderen Lesevorgänge vor einem L1-Fall wie diesem gibt, betrachten Sie diese L1 als authentisch ausgedrückt.Beschriften Sie die Zeile grün und beachten Sie, warum es sich um ein authentisch ausgedrücktes L1 handelt. Kuratieren Sie einen L1-Lokus als wahrscheinlich falsch, wenn das Muster der zugeordneten Lesevorgänge zum Ort nicht mit den spezifischen L1-Regionen der Mappbarkeit korreliert. Wenn ein L1 sehr mappbar ist, aber nur einen Haufen Lesevorgänge in einem verdichteten Bereich innerhalb des L1 hat, ist es weniger wahrscheinlich, dass er mit dem L1-Ausdruck von seinem eigenen Promotor verwandt ist und eher aus nicht kommentierten Quellen wie Exons oder LTRs stammt. In Fällen wie diesem, kuratieren Sie die loci als orange und beachten Sie, warum der Ort verdächtig ist.Überprüfen Sie die Quellen verdächtiger Anhäufungen, indem Sie den L1-Standort im UCSC Genome Browser überprüfen. Kuratieren Sie einen Ort, der nicht authentisch ausgedrückt wird, wenn er sich in einer genomischen Umgebung sporadisch ausgedrückter nicht annotierter Regionen befindet. Lesevorgänge können 10 Kilobasen vor dem L1 ausgedrückt werden. Aber alle 10 Kilobasen oder so, gibt es zugeordnete Lesungen und einige dieser Lesungen mit dem L1 ausgerichtet. Diese L1s haben wahrscheinlich Lesevorgänge aufgrund nicht annotierter Muster genomischer Expression zugeordnet.In Fällen wie diesem, kuratieren Sie die loci als rot und beachten Sie, warum der Ort verdächtig ist. Um die Zuordnungsfähigkeit jedes L1-Loci zu unterstützen, bestimmen Sie die Anzahl der eindeutig zugeordneten Lesevorgänge zu L1 loci mit dem Bettwerkzeug-Programm, der FL-L1-Anmerkung und den ausgerichteten genomischen Sequenzdaten. Legen Sie einen L1-Standort für die vollständige Abdeckungs-Mappbarkeit fest, wenn 400 eindeutige Lesevorgänge darauf ausgerichtet sind.Bestimmen Sie den Faktor, der erforderlich ist, um genomische DNA-ausgerichtete Lesevorgänge auf 400 für jedes einzelne L1 zu skalieren. Um ein skaliertes Maß der Expression nach der individuellen L1-Locus-Mappability zu erhalten, multiplizieren Sie den Faktor mit der Anzahl der RNA-Transkript-Lesevorgänge, die an einzelnen authentisch ausgedrückten L1s ausgerichtet sind. Jeder Schritt wird verwendet, um Unterschiede zwischen L1-Elementen hervorzuheben, die von ihrem eigenen Promotor ausgedrückt werden, und allen Möglichkeiten, wie L1-Elemente in andere Transkripte aufgenommen werden können, die nichts mit dem L1-Lebenszyklus zu tun haben. Hier sind Transkriptsliest zu sehen, die alle intakten L1s in voller Länge im menschlichen Genom in der DU145 Prostatatumor-Zelllinie exprimiert haben.In Schwarz sind die spezifischen Loci, die nach der manuellen Kuration als authentisch ausgedrückt identifiziert werden. Und in rot sind die spezifischen loci abgelehnt als authentisch ausgedrückt liest nach manueller Kuration. In Grau sind loci mit weniger als 10 Lesevorgängen, die jedem zugeordnet sind.Da diese Loci einen kleinen Bruchteil der Transkriptlesungen darstellen, wurden sie nicht manuell kuratiert. Ungefähr 4500 Loci werden nicht grafisch dargestellt, da sie null zugeordnete Lesevorgänge hatten. Nach der manuellen Kuration reicht die Anzahl der Lesevorgänge, die eindeutig zu authentisch ausgedrückten spezifischen L1-Loci in DU145 stammen, von 175 Lesevorgängen bis zu einem willkürlich gewählten Mindestschnitt von 10 Lesevorgängen.Nachdem die Lesevorgänge für die Mappbarkeitswerte in jedem Ort angepasst wurden, nahm die Quantifizierung für die Expression für die meisten Loci zu. Die Anzahl der Lesevorgänge, die eindeutig auf authentisch ausgedrückte spezifische L1-Loci mit Mappbarkeitskorrekturen in DU145 abgebildet wurden, reichte von 612 bis vier Lesevorgängen, und es gab eine Neuordnung der höchsten bis niedrigsten ausdrückenden Loci. Jeder Schritt spielt eine entscheidende Rolle bei der Reduzierung des hohen Transkriptionshintergrundrauschens.Der kritischste Schritt ist jedoch die manuelle Kuration jedes L1-Lokus, um die Transkription des eigenen Promotors zu bestätigen. Ungefähr 50 % der in DU145-Zellen bioinformatisch identifizierten L1-Loci wurden als L1-Hintergrundgeräusche aus anderen Transkriptionsquellen zurückgewiesen, wobei die strenge Strenge hervorgehoben wurde, die erforderlich ist, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Um den jüngsten L1s zu identifizieren, empfehlen wir die Verwendung von 5-Prime RACE-Auswahl von L1-Transkripten und Sequenzierungstechnologie wie PacBio, die längere Lesevorgänge nutzen und eine einzigartigere Zuordnung ermöglichen.Mit diesem Ansatz können wir L1-Expressionsmuster streng und zuverlässig identifizieren und quantifizieren. Dies ebnet den Weg zu einem besseren Verständnis der Regulierung der einzelnen L1-Loci und der möglichen Auswirkungen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

RNA-Sequenzierung und Bioinformatik-Analysen wurden verwendet, um deutlich und differentiell exprimiert Transkriptionsfaktoren in Lin-CD34 + und Lin-CD34- Subpopulationen von Maus EMLcells identifizieren. Diese Transkriptionsfaktoren könnten eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Wechsel zwischen Selbsterneuerung Lin-CD34 + und teilweise differenziert Lin-CD34- Zellen spielen.

Identifizierung von Schlüsselfaktoren Regelselbsterneuerung und Differenzierung in EML hämatopoetischen Vorläuferzellen durch RNA-Sequenzierungsanalyse

Bisulfit-Amplikon-Sequenzierung (BSAS) ist eine Methode zur Quantifizierung der Cytosin-Methylierung in bestimmten genomischen Regionen von Interesse. Bei dieser Methode wird die Bisulfit-Umwandlung in Kombination mit der PCR-Amplifikation von Zielregionen vor der Next-Generation-Sequenzierung verwendet, um eine absolute Quantifizierung der DNA-Methylierung auf basenspezifischer Ebene zu erzielen.

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Wir beschreiben eine zielgerichtete RNA-Sequenzierungsmethode, die die Vorbereitung indizierter cDNA-Bibliotheken, Hybridisierung und Erfassung mit benutzerdefinierten Sonden und Datenanalyse umfasst, um ausgewählte Transkripte auf Genexpression, Mutationen und Genfusionen zu untersuchen. Targeted RNAseq ermöglicht die kostengünstige und schnelle Auswertung ausgewählter Transkripte auf einem Desktop-Sequenzierer.

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Hier haben wir ein Protokoll beschreiben bei der Untersuchung der Auswirkungen von anomalen Spleißen auf Medikamentenresistenz bei soliden Tumoren und hämatologischen Malignitäten ausgerichtet. Zu diesem Ziel haben wir analysiert , die transkriptomischen Profile der elterlichen und beständig in - vitro - Modellen durch RNA-seq und gründete eine qRT-PCR - basierte Methode Kandidatengene zu validieren.

Mit RNA-Sequenzierung Neuartige Splice-Varianten zu Arzneimittelresistenz mit Bezug zu erkennen in<em&gt; In Vitro</em&gt; Cancer Models

Dieses Protokoll beschreibt die kombinatorische Verwendung von ChIP-Seq, 4sU-Seq, total RNA-Seq und Ribosom profiling für Zelllinien und Primärzellen. Nachverfolgen von Änderungen im Transkriptionsfaktor verbindlich, de Novo Transkription, RNS-Verarbeitung, Umsatz und Übersetzung im Laufe der Zeit und zeigt den gesamten Verlauf der Ereignisse in aktivierten und/oder sich rasch verändernden Zellen ermöglicht.

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Gezielte Sequenzierung der nächsten Generation ist eine Zeit- und kosteneffiziente Ansatz, der in der Erforschung von Krankheiten und der klinischen Diagnostik immer beliebter wird. Das hier beschriebene Protokoll stellt die komplexen Workflow für die Sequenzierung erforderlich und der Bioinformatik-Prozess verwendet, um Genvarianten identifizieren, die zur Krankheit beitragen.

Gezielte Sequenzierung der nächsten Generation und Bioinformatik-Pipeline, um genetische Determinanten der konstitutionelle Krankheit zu bewerten

Hier beschreiben wir einen in Situ Hybridisierung Test sensitiver und spezifischer Nachweis von Sequenzen so kurz wie 50 Nukleotide mit Einzel-Nukleotid-Auflösung auf die einzelne Zelle Ebene ermöglicht. Assays, die manuell oder automatisch ausgeführt werden kann, kann Visualisierung von Splice-Varianten, kurze Sequenzen und Mutationen im Zusammenhang mit Gewebe ermöglichen.

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RNA Next-Generation-Sequenzierung und eine Bioinformatik-Pipeline zur Identifizierung von ausgedrückten LINE-1s auf der Locus-spezifischen Ebene (Video) | JoVE Journal

RNA Next-Generation-Sequenzierung und eine Bioinformatik-Pipeline zur Identifizierung von ausgedrückten LINE-1s auf der Locus-spezifischen Ebene

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