Name: In Vitro biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Erfahren Sie robuste biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen. Diese effiziente Methode ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse ohne spezielle Ausrüstung.

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Wir danken P. Jeremy Wang (University of Pennsylvania) für hilfreiche Bearbeitungen und Diskussionen. Wir danken auch Sigrid Eckardt für die Sprachbearbeitung. K. Z. wurde von national Key R&D Program of China (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) und national Natural Science Foundation of China (31771653) unterstützt. L. Y. wurde von der National Natural Science Foundation of China (81471502, 31871503) und dem Innovative and Entrepreneurial Program der Provinz Jiangsu unterstützt. J. N. wurde vom Zhejiang Medical Science and Technology Project (2019KY499) unterstützt. M. L. wurde durch Stipendien der National Natural Science Foundation of China (31771588) und des 1000 Youth Talent Plan unterstützt.

1. Proteinzubereitung
<ol><li>MEIOB- und MOV10-Ausdruckskonstrukte<ol><li>Generieren cDNA-Expression konstruktiert Codierungsmaus MEIOB-A, C und E (Abbildung 1A) und MOV10.<ol>
<li>Richten Sie die Polymerase-Kettenreaktionsreaktionen (PCR) für jedes Fragment ein. Mischen Sie 1 l Maus-cDNA (aus C57BL/6-Maus-Testis), 1 l dNTP, 2 l von 10 -M Vorwärtsprimer, 2 l von 10 -M-Reverse-Primer, 1 L DNA-Polymerase, 25 l 2x PCR-Puffer und 18 l doppelt destilliertem H2 O(ddH2O) in einem End- Volumen von 50 l. HINWEIS: Die Primer für die Verstärkung von Meiob- und Mov10-Genfragmenten sind in Tabelle 1 aufgeführt. 
</li>
			<li>PCR-Reaktionen mit folgenden Programmen durchführen: 95 °C für 5 min, 35 Heizzyklen bei 95 °C für 15 s, Glühen bei 64 °C für 15 s, Verlängerung bei 72 °C für 20 s (2 min für verlängerung der gesamten Länge MOV10) und Endverlängerung bei 68 °C für 7 min. HINWEIS: Verwenden Sie das Primerpaar MEIOB-E (F1) und MEIOB-E-mut (R1) und MEIOB-E-mut (F2) und MEIOB-E (R2), um zwei Segmente zu verstärken, die die mutierte Sequenz innerhalb einer überlappenden Sequenz an den Enden 3' bzw. 5' enthalten, um eine mutierte PCR-Vorlage zu generieren.</li>
		</ol></li>
		<li>Analysieren Sie die verstärkte PCR-DNA durch Gelelektrophorese, schneiden Sie das Band der erforderlichen Größe schnell unter einer UV-Lampe aus dem Gel und legen Sie es in ein Zentrifugenrohr. HINWEIS: Die erwarteten Produktgrößen auf dem Agarose-Gel für MEIOB-A sind 536 bp, MEIOB-C ist 296 bp, MEIOB-E sind 312 bp und 229 bp, und MOV10 ist 3015 bp.</li>
		<li>Reinigen Sie die PCR-DNA mit einem Gel-Extraktionskit nach dem Herstellerprotokoll.<ol>
<li>Fügen Sie dem Zentrifugenrohr ab Schritt 1.1.2 ein gleiches Volumen des Auflösenspuffers hinzu und schmelzen Sie Das gel in einem 50-55 °C Wasserbad für 5-10 min, damit die Gelstücke vollständig schmelzen. Zentrifuge kurz, um tröpft alle Tröpfchen von der Wand des Rohres zu sammeln. ANMERKUNG: Die Massen-/Volumenkonzentration des Gels und des Auflösungspuffers beträgt 1 mg/L.</li>
			<li>Legen Sie die Adsorptionsspalte in das Sammelrohr, übertragen Sie die Lösung, die das gelöste Gelfragment enthält, in die Adsorptionsspalte und Zentrifugen bei 12.000 x g für 2 min.</li>
			<li>Entsorgen Sie das Filtrat an der Unterseite der Sammelrohre. Fügen Sie der Säule 600 l des Waschpuffers, Zentrifuge bei 12.000 x g für 1 min, und entsorgen Sie das Filtrat.</li>
			<li>Wiederholen Sie Schritt 1.1.3.3 einmal.</li>
			<li>Legen Sie die Säule wieder in das Sammelrohr und Zentrifugen bei 12.000 x g für 2 min, um den verbleibenden Waschpuffer zu entfernen.</li>
			<li>Legen Sie die Adsorptionssäule in ein 1,5 ml sterilisiertes Zentrifugenrohr, fügen Sie 50 l ddH2O in die Mitte der Adsorptionssäule und Zentrifuge bei 12.000 x g für 1 min. Messen Sie die DNA-Konzentration des Eluats mit Spektralphotometer.</li>
		</ol></li>
		<li>Einschränkung der Verdauung von Plasmiden<ol>
<li>Digest pGEX-4T-1 Vektor mit BamHI und NotI. Mischen Sie dazu 4 g pGEX-4T-1-Vektor, 5 l 10x Digest-Puffer, 1 l BamHI und 1 l NotI und ddH2O auf ein Endreaktionsvolumen von 50 l. Bei 37 °C für 2 h inkubieren.</li>
			<li>Verdauen Sie den pRK5-Vektor mit BamHI und XhoI, indem Sie 4 g pRK5-Vektor, 5 l 10x Digest-Puffer, 1 l BamHI und 1 L XhoI und ddH2O auf ein endliches Reaktionsvolumen von 50 l mischen. Bei 37 °C für 2 h inkubieren.</li>
		</ol></li>
		<li>Analysieren Sie die Vektor-DNA durch Gelelektrophorese, schneiden Sie das gewünschte Größenband schnell mit einem Skalpell unter einer UV-Lampe aus dem Gel und legen Sie es in ein Zentrifugenrohr.</li>
		<li>Reinigen Sie die Vektor-DNA mit einem Gel-Extraktionskit als 1.1.3 nach Anweisung des Herstellers. ANMERKUNG: Die Länge der linearisierten Plasmide: pGEX-4T-1, 4.4 kb; pRK5, 4.7 kb.</li>
		<li>Richten Sie eine standardrekombinante Ligationsreaktion ein, indem Sie 0,03 pmol linearisierten Vektor, 0,06 pmol cDNA-Fragment, 2 l Ligase und 4 l 5x Ligasepuffer und ddH2O in einem Endreaktionsvolumen von 10 l kombinieren. HINWEIS: Klonen Sie MEIOB-A, C und E in einen pGEX-4T-1-Vektor und MOV10 in einen pRK5-Vektor.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Mischung bei 37 °C für 30 min, und kühlen Sie dann die Reaktion sofort für 5 min auf Eis. Transformieren Sie MEIOB-rekombinante Plasmide in BL21-Bakterien und MOV10-rekombinante Plasmide in DH5-Bakterien. HINWEIS: Überprüfen Sie alle rekombinanten Konstrukte durch Sanger-Sequenzierung.</li>
		<li>Bereiten Sie Glyzerinbestände von Bakterienkulturen vor, die verifizierte rekombinante Plasmide enthalten, indem Sie flüssigen Kulturen ein gleiches Volumen von 50 % Glycerin hinzufügen und bei -80 °C lagern. HINWEIS: Streichen Sie für jedes nachfolgende Experiment Bakterien aus Glyzerinbeständen auf eine frische Agarplatte und verwenden Sie eine einzige Kolonie für die Expansion, wie in Schritt 1.2 beschrieben.</li>
	</ol></li>
	<li>MEIOB Proteinextrakte aus Bakterien<ol>
<li>Wählen Sie eine Kolonie jedes BL21-Stamms, der mit dem leeren oder rekombinanten pGEX-4T-1-Plasmid transfiziert ist, das durch Sequenzierung verifiziert wird, und impfen Sie in 3 ml LB, der 100 g/ml Ampicillin enthält. Über Nacht bei 37 °C mit Schütteln bei 220 Rpm wachsen.</li>
		<li>300 ml ulkulieren, mit 100 g/ml Ampicillin ab 3 ml Nachtkultur (ab Schritt 1.2.1). Wachsen Sie die Kulturen mit Schütteln bei 37 °C für 2 h, bis OD600 0,5-1,0 erreicht.</li>
		<li>Induzieren Sie die Proteinexpression durch Zugabe von Isopropyl beta-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) zu einer Endkonzentration von 0,2 mM. Inkubieren Sie die Kulturen für weitere 3 h mit Schütteln bei 180 Rpm und 18 °C.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Bakterienkultur bei 3.500 x g und 4 °C für 20 min.</li>
		<li>Setzen Sie das Pellet in 20 ml eiskalten Dulbecco-Phosphat-Gepufferten Saline-Puffer (DPBS) wieder aus. Sonicate die bakterielle Suspension auf Eis für 25 Zyklen in kurzen 10 s Bursts (Ausgangsleistung 20%) gefolgt von 2-3 s auf Eis ruhen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie das Lysat bei 12.000 x g und 4 °C für 15 min. Übertragen Sie den gesamten Überstand auf ein frisches Rohr.</li>
		<li>Vorwaschen Perlen.<ol>
<li>Fügen Sie 300 L Glutathion-Sepharose-Perlen in ein frisches 15 ml-Rohr und waschen Sie die Perlen mit 10 ml eiskaltem PBS-Puffer.</li>
			<li>Zentrifugieren Sie bei 750 x g und 4 °C für 1 min, um die Perlen zu pellet und die Waschlösung zu entsorgen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Das Lysat in die gewaschenen Perlen geben und bei 4 °C für 2 h brüten. Zentrifugieren bei 750 x g und 4 °C für 1 min, um die Perlen zu pellet. Spülen Sie die Perlen in 10 ml eiskalte PBS 8x.</li>
		<li>Die Perlen mit 1 ml des Elutionspuffers (10 mM Glutathion in 50 mM Tris-HCl bei pH 8,0) 6x, inkubieren bei 4 °C für 10 min vor jedem Elutionsschritt. Zentrifuge bei 750 x g und 4 °C für 1 min, um die Perlen zu pellet. Sammeln und poolen Sie die 6 Fraktionen.</li>
		<li>Übertragen Sie die eluierten Proteine in einen Zentrifugalfilter und konzentrieren Sie sich durch Zentrifugation bei 7.500 x g, um ein Endvolumen von 100-200 l zu erhalten.</li>
	</ol></li>
	<li>MOV10 Proteinextrakte aus HEK293T Zellen<ol>
<li>Die MOV10-Proteine in kultivierten HEK293T-Zellen exprimieren.<ol>
<li>Bereiten Sie MOV10-pRK5 Plasmid in einer Konzentration von >500 ng/L vor.</li>
			<li>Samen HEK293T Zellen in 15 cm Geschirr. Wenn die Zelldichte 70%-90% erreicht, ersetzen Sie das Zellkulturmedium durch das frische Dulbecco es Modified Eagle Medium (DMEM), das 10% fetales Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin enthält.</li>
			<li>Für eine Transfektion 60 g MOV10-pRK5-Plasmid-DNA in 3 ml des reduzierten Serummediums verdünnen, dann 120 l des Transfection Enhancer Reagenz hinzufügen und gut mischen.</li>
			<li>In einem separaten Rohr 90 l des Transfektionsreagenzes mit 3 ml reduziertem Serummedium (ohne Penicillin-Streptomycin) verdünnen und gut vermischen.</li>
			<li>Fügen Sie die verdünnte DNA zu jeder Tube des verdünnten Transfektionsreagenzhinzuers hinzu. Bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren.</li>
			<li>Fügen Sie die Transfektionsmischung der Zellkultur hinzu, und fügen Sie Kulturzellen für 36-48 h hinzu.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Nach 36-48 h, sammeln Zellen von jeder Platte in einem 50 ml Rohr. Zentrifuge bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Waschen Sie jedes Pellet mit 10 ml eiskaltem PBS und sammeln Sie Zellen durch Zentrifugation bei 500 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
		<li>Setzen Sie das Pellet in 3 ml Zelllysepuffer mit vollständigem Ehylenidemintetraessigsäure (EDTA)-freiem Protease-Inhibitor-Cocktail aus. 30 min auf Eis bebrüten. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 20.000 x g und 4 °C für 20 min.</li>
		<li>Fügen Sie 100 l Anti-FLAG-Magnetperlen pro Schale der Zellen in einem 1,5 ml-Rohr hinzu.</li>
		<li>Waschen Sie die Magnetperlen 2x mit K150 Puffer (50 mM HEPES bei pH 7,5, 150 mM KoAc, 1 mM DTT, 0,1% NP-40).<ol>
<li>Die Magnetperlen in 1 ml eiskaltem K150-Puffer wieder aufhängen.</li>
			<li>Inkubieren Sie die Magnetperlen für 2 min bei 4 °C mit sanfter Rotation und pellet die Magnetperlen mit Hilfe eines Magneten. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Fügen Sie die magnetischen Perlen zum Zelllysatüberstand ab Schritt 1.3.3 hinzu und brüten Sie bei 4 °C für 2 h.</li>
		<li>Waschen Sie die proteingebundenen Magnetperlen 3x mit K150 Puffer, dann 2x mit K150 mit 250 mM NaCl, dann 3x mit K150 Puffer als 1.3.5.</li>
		<li>Die Perlen in 300 l FLAG-Elutionspuffer (100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl bei pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10 % Glycerin) wieder aufhängen, FLAG-Peptid zu einer Endkonzentration von 0,5 g/l hinzufügen und mit Perlen auf einem Rotator bei 4 °C für 1 h brüten , dann Pellet die magnetischen Perlen mit Hilfe eines Magneten.</li>
		<li>Sammeln Sie den Überstand, der die eluierten MOV10-Proteine enthält, bestimmen Sie die Konzentration und lagern Sie bei -80 °C für die zukünftige Verwendung.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Nukleinsäurezubereitung
<ol><li>Kaufen Sie DNA- und RNA-Oligonukleotide (Oligos) mit oder ohne Biotin-Etiketten aus einer geeigneten Quelle. Verdünnen Sie jeden Oligo in RNase-freiem ddH2O bis 20 m und halten Sie ihn bei -80 °C für die zukünftige Verwendung. HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten Oligosequenzen von DNA/RNA-Substraten sind in Tabelle 2aufgeführt.</li>
	<li>Folgende Mischung für die doppelsträngige RNA (dsRNA) Glühreaktion für DEN MOV10 Helicase-Aktivitätstest vorbereiten: Mischen Sie 60 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-Ethan-Sulfonsäure (HEPES) bei pH 7,5, 6 mM KCl, 0,2 mM MgCl2 und RNase-frei ddH2 O in einem Endreaktionsvolumen von 20 l.</li>
	<li>Anneale RNA-Oligos zu RNA-Duplex, indem sie eine Mischung aus dem biotin-markierten OberenStrang (2 M, Endkonzentration) und einem 1,5-fachen seines unbeschrifteten komplementären Bodenstrangs im Glühpuffer (Schritt 2.2) bei 95 °C für 5 min erhitzen und dann langsam in den Raum abkühlen Temperatur (RT).</li>
</ol>3. In vitro biochemische Assays
<ol><li>EMSA und enzymatische Reaktionen<ol>
<li>Für den MEIOB EMSA-Test 50 mM Tris HCl bei pH 7,5, 2 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2 mM Dithiothreitol (DTT), 0,01% NP-40, 0,8 mM (oder andere relevante Konzentrationen wie in Abbildung 2 und Abbildung3) MEIOB-Protein und 10 nM biotin-markierte Oligonukleotide und ddH2 O in einem Endreaktionsvolumen von 20 l. Inkubieren Sie bei RT für 30 min, und fügen Sie 5x Stop-Puffer (125 mM EDTA, 50% Glycerin) hinzu, um die Reaktion zu stoppen.</li>
		<li>Richten Sie MEIOB-Nukleaseaktivitätsreaktionen wie in Schritt 3.1.1 beschrieben ein, jedoch ohne Zugabe von 10 mM EDTA.</li>
		<li>Für den MOV10 Helicase-Aktivitätstest 50 mM Tris-HCl bei pH 7,5 mischen, 20 mM KoAc, 2 mM MgCl2, 0,01% NP-40, 1 mM DTT, 2 U/L RNase-Inhibitor, 10 nM biotin-markiertes RNA-Substrat, 2 mM Adenosintriphosphat (ATP), 100 nM RNA-Falle und 20 ng MOV10-Protein und ddH-C6 >2O in einem Endreaktionsvolumen von 20 l. Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch bei 37 °C für 10 min, 30 min und 60 min. Fügen Sie den 5x Stop-Puffer hinzu, um die Reaktion zu stoppen. HINWEIS: RNA-Falle, ein biotinunbeschriftetes Oligo mit Sequenz, Komplementarität zum markierten Oligo, die verhindert, dass die ungewickelte dsRNA wieder glüht.</li>
	</ol></li>
	<li>Polyacrylamid-Gel<ol>
<li>Waschen Sie die Gelplatten (16 cm x 16 cm) und 1,5 mm Kämme. Montieren Sie die Gelelektrophoreseeinheiten.</li>
		<li>Zur Herstellung eines 10% nativen Polyacrylamidgels 14 ml ddH2O, 1,25 ml 10x Tris-Borsäure-EDTA (TBE), 8,3 ml 30% Acrylamid, 1,25 ml 50% Glycerin, 187,5 l 10% frisch zubereitetes Ammoniumpersulfat (APS) und 12,5 ml Tetramethylethylendiamin (TEMED).</li>
		<li>Zur Herstellung eines 20% nativen Polyacrylamidgels 5,5 ml ddH2O, 1,25 ml 10x TBE, 1,25 ml 50% Glycerin, 16,7 ml 30% Acrylamid, 187,5 l mit 10 % APS und 12,5 l TEMED mischen.</li>
		<li>Die Acrylamidlösung sofort in das Gel geben und den Kamm einlegen. Lassen Sie die Mischung ca. 30 min polymerisieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Gellauf<ol>
<li>Entfernen Sie den Kamm, füllen Sie die Tanks mit dem Elektrophorese-Laufpuffer (0,5x TBE).</li>
		<li>Spülen Sie die Probenbrunnen mit 0,5x TBE-Puffer, dann führen Sie das Gel bei 100 V auf Eis für 30 min vor. Ersetzen Sie den Laufpuffer durch frischen 0,5x TBE.</li>
		<li>Laden Sie 20-25 L Proben in jeden Bohrwert.</li>
		<li>Verwenden Sie ein 10% natives Acrylamid-Gel für den EMSA-Assay und ein 20% natives Acrylamid-Gel für die enzymatischen Assays. Elektrophorese bei 100 V im Eisbad laufen lassen, bis der Bromphenolblaumarker in das untere Viertel des Gels migriert ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Zerlegen Sie die Gelplatten, trimmen Sie das Gel, indem Sie Ladebrunnen und ungenutzte Bahnen entfernen. Legen Sie das Gel in 0,5x TBE-Puffer.</li>
	<li>Schneiden Sie das Filterpapier und die Nylonmembran auf die Größe des Gels. Das saubere Filterpapier und die Nylonmembran vorbefeuchten.</li>
	<li>Montieren Sie den Stapel für die Übertragung.<ol>
<li>Legen Sie die vornasse Membran auf das vornasse Filterpapier.</li>
		<li>Legen Sie das Gel auf die Membran.</li>
		<li>Bedecken Sie das Gel mit einer weiteren Schicht vornassen Filterpapiers.</li>
		<li>Entfernen Sie alle Luftblasen, indem Sie eine saubere Pipette von der Mitte bis zum Rand rollen.</li>
	</ol></li>
	<li>Übertragen Sie die Proben vom Gel in einem halbtrockenen elektrophoretischen Gerät bei 90 mA für 20 min auf die Membran.</li>
	<li>Stoppen Sie den Transfer, und trocknen Sie dann die Membran auf einem neuen Filterpapier für 1 min.</li>
	<li>Vernetzen Sie die Proben, indem Sie die Membran bei 120 mJ/cm2 für 45-60 s in einem UV-Licht-Vernetzenmiten mit 254 nm Glühbirnen (Auto-Crosslink-Funktion) bestrahlen. Die Membran bei RT 30 min an der Luft trocknen.</li>
	<li>Chemilumineszenz-Erkennung<ol>
<li>Protokoll 1: Verwenden Sie ein Standardvolumen des kommerziellen Chemilumineszenz-Nukleinsäuredetektionskits.<ol>
<li>Fügen Sie 20 ml Sperrpuffer in die Membran und inkubieren für 15-30 min mit sanftem Schütteln auf einem Rotator bei 20-25 Rpm.</li>
			<li>Bereiten Sie konjugierende/blockierende Pufferlösung vor, indem Sie 66,7 l stabilisiertes Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat zu 20 ml Blockierpuffer hinzufügen.</li>
			<li>Entfernen Sie den Sperrpuffer vorsichtig und ersetzen Sie ihn durch einen Konjugat-/Blockierungspuffer. 15 min auf einem Rotator bei 20-25 Rpm inkubieren.</li>
			<li>Waschen Sie die Membran 4x mit Schütteln bei 40-45 Rpm für jeweils 5 min.</li>
			<li>Fügen Sie der Membran 30 ml Substratausgleichspuffer hinzu. Inkubieren Sie die Membran für 5 min mit Schütteln bei 20-25 Rpm.</li>
			<li>Bereiten Sie substratverarbeitende Lösung durch Zugabe von 6 ml L L L L L L L L L L L L L stabiler Peroxidlösung vor. Vermeiden Sie Licht.</li>
			<li>Bedecken Sie die gesamte Oberfläche der Membran mit Substratarbeitslösung und brüten Sie für 5 min.</li>
			<li>Scannen Sie die Membran in einem chemilumineszierenden Bildgebungssystem für 1-3 s.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Protokoll 2: Verwenden Sie 2x verdünnte kommerzielle Chemilumineszenz Nukleinsäure-Detektionkit und folgen Sie den Schritten 3.10.1.1-3.10.1.8.</li>
		<li>Protokoll 3: Verwenden Sie selbsthergestellte Reagenzien6.<ol>
<li>Vorbereiten des Sperrpuffers: Mischen Sie 0,1 M Tris-HCl bei pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM MgCl2und 3% Rinderserumalbumin Fraction V. AP 7.5 Puffer: Mix 0.1 M Tris-HCl bei pH 7,5, 0,1 M NaCl und 2 mM MgCl2. AP 9.5 Puffer: Mix 0.1 M Tris-HCl bei pH 9,5, 0,1 M NaCl und 50 mM MgCl2. TE-Puffer: 10 mM Tris-HCl bei pH 8,0, 1 mM EDTA bei pH 8,0 mischen.</li>
			<li>Die Membran im Sperrpuffer bei 30 °C für 1 h einweichen.</li>
			<li>Fügen Sie 8,5 l Streptavidin alkalische Phosphatase zu 10 ml AP 7.5 Puffer hinzu. Schütteln Sie die Membran in dieser Lösung bei RT 10 min. Dann waschen Sie die Membran 2x in 15 ml AP 7.5 Puffer für 10 min.</li>
			<li>Waschen Sie die Membran noch einmal in 20 ml AP 9.5 Puffer für 10 min. Fügen Sie 20 ml TE Puffer hinzu, um die Reaktion zu stoppen.</li>
			<li>Fügen Sie 7,5 ml Entwicklungslösung auf die Membran, und scannen Sie die Membran in einem chemilumineszierenden Bildgebungssystem für 1-3 s.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Es werden keine Interessenkonflikte deklariert.

Die Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen ist entscheidend für unser Verständnis molekularer Mechanismen, die verschiedenen biologischen Prozessen zugrunde liegen. Zum Beispiel ist MEIOB ein Testis-spezifisches Protein, das für Meiose und Fruchtbarkeit bei Säugetieren25,26,27unerlässlich ist. MEIOB enthält eine OB-Domäne, die an einsträngige DNA bindet und eine 3' bis 5' Exonukleaseaktivität26<...

Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen sind an vielen wesentlichen zellulären Prozessen wie DNA-Reparatur, Replikation, Transkription, RNA-Verarbeitung und Translation beteiligt. Protein-Wechselwirkungen mit spezifischen DNA-Sequenzen innerhalb des Chromatins sind für die genaue Kontrolle der Genexpression auf der Transkriptionsebene1erforderlich. Eine präzise posttranskriptionelle Regulation zahlreicher kodierender und nicht kodierender RNAs erfordert umfangreiche und komplizierte Wechselwirkungen zwischen jedem Protein und RNA2. Diese Schichten des Regulierungsmechanismus der Genexpression bestehen aus einer Kaskade dynamischer intermolekularer Ereignisse, die durch Wechselwirkungen von Transkriptions-/epigenetischen Faktoren oder RNA-bindenden Proteinen mit ihren Nukleinsäurezielen koordiniert werden, sowie Protein-Protein-Wechselwirkungen. Um zu sezieren, ob Proteine in vivo direkt oder indirekt mit Nukleinsäuren in Verbindung gebracht werden und wie solche Assoziationen auftreten und kulminieren, werden in vitro biochemische Assays durchgeführt, um die Bindungsaffinität oder enzymatische Aktivität von Proteinen von Interesse auf substrate von DNA und/oder RNA.
Viele Techniken wurden entwickelt, um Nukleinsäure-Protein-Komplexe zu erkennen und zu charakterisieren, einschließlich des elektrophoretischen Mobilitäts-Shift-Assays (EMSA), auch als Gel-Retardierungs-Assay oder Band-Shift-Assay3,4,5 bezeichnet . EMSA ist eine vielseitige und empfindliche biochemische Methode, die weit verbreitet ist, um die direkte Bindung von Proteinen mit Nukleinsäuren zu untersuchen. EMSA setzt auf Gel elektrophoretische Verschiebung in Bändern, die routinemäßig mit Chemilumineszenz visualisiert werden, um Biotin-Etikettenzuerkennen 6,7, die Fluoreszenz der Fluorophor-Etiketten8,9, oder durch Autoradiographie radioaktiver 32P-Etiketten10,11. Andere Zwecke biochemischer Studien sind die Identifizierung und Charakterisierung der Nukleinsäure-Verarbeitungsaktivität von Proteinen, wie nukleasingbasierte Reaktionen zur Bewertung der Spaltungsprodukte aus Nukleinsäuresubstraten12, 13 , 14 und DNA/RNA-Struktur-Abwicklungs-Assays zur Bewertung der Helicase-Aktivitäten15,16,17.
Bei solchen enzymatischen Aktivitätstests werden die radioisotop-markierten oder fluorophor-markierten Nukleinsäuren aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit häufig als Substrate verwendet. Die Analyse von Röntgenaufnahmen enzymatischer Reaktionen mit 32P-markierten Radiotracernwurde als empfindlich und reproduzierbar 18 gefunden. Doch in einer wachsenden Anzahl von Laboratorien in der Welt ist die Verwendung von Radioisotopen aufgrund der gesundheitsrechtlichen Risiken, die mit einer möglichen Exposition verbunden sind, eingeschränkt oder sogar verboten. Neben den Bedenken hinsichtlich der Biosicherheit sind weitere Nachteile die notwendige Ausrüstung für die Durchführung von Arbeiten mit Radioisotopen, die erforderliche Radioaktivitätslizenz, eine kurze Halbwertszeit von 32P (ca. 14 Tage) und eine allmähliche Verschlechterung der Sondenqualität aufgrund von Radiolyse. So wurden alternative nicht-isotopenfreie Methoden entwickelt (d.h. die Kennzeichnung der Sonde mit Fluorophoren ermöglicht die Detektion mittels fluoreszierender Bildgebung19). Bei der Verwendung fluoreszierender Sonden wird jedoch ein hochauflösendes Bildgebungssystem benötigt. Biotin, ein häufig verwendetes Label, bindet leicht an biologische Makromoleküle wie Proteine und Nukleinsäuren. Biotin-streptavidin System arbeitet effizient und verbessert die Erkennungsempfindlichkeit ohne Erhöhung des unspezifischen Hintergrunds20,21. Neben EMSA wird Biotin häufig zur Proteinreinigung und RNA-Pull-down eingesetzt, unter anderem22,23,24.
Dieses Protokoll verwendet erfolgreich biotinmarkierte Nukleinsäuren als Substrate für in vitro biochemische Assays, die EMSA enthalten, zusätzlich zu enzymatischen Reaktionen, bei denen Biotin nicht häufig verwendet wurde. Die MEIOB-OB-Domäne ist aufgebaut und zwei Mutanten (Abschneide und Punktmutation) werden als GST-Fusionsproteine25,26,27, sowie Maus MOV10 rekombinantes FLAG-Fusionsprotein16exprimiert. Dieser Bericht hebt die Wirksamkeit dieses kombinierten Protokolls für die Proteinreinigung und biotinmarkierte Assays für verschiedene experimentelle Zwecke hervor.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf, Deutschland</td><td>5242R</td><td></td></tr><tr><td>Chemilumineszierendes Bildgebungssystem</td><td>Tanon, China</td><td>5200</td><td></td></tr><tr><td>Digital Sonifer</td><td>Branson, USA</td><td>BBV12081048A</td><td>450 Watt; 50/60 HZ</td></tr><tr><td>Halbtrockenes elektrophoretisches Löschblatt</td><td>Hoefer, USA</td><td>TE77XP</td><td></td></tr><tr><td>Rohr-Revolver&nbsp;</td><td>Crystal, USA</td><td>3406051</td><td></td></tr><tr><td>UV-Licht-Vernetzer</td><td>UVP, USA</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Zentrifugalfilter&nbsp;</td><td>Milipore, USA</td><td>UFC801096</td><td>4 ml/10 K</td></tr><tr><td>Nylonmembran</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>TG263940A</td><td></td></tr><tr><td>TC-behandelte Kulturschale</td><td>Corning, USA</td><td>430167</td><td>100 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>TC-behandelte Kulturschale</td><td>Corning, USA</td><td>430597</td><td>150 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroröhrchen</td><td>AXYGEN, USA</td><td>MCT-150-C</td><td>1,5 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Röhrchen</td><td>Corning, USA</td><td>430791</td><td>15 mL</td></tr><tr><td><stark>Reagenzien&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>SunShine Bio, China</td><td>8h288h28</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 magnetische Kügelchen</td><td>Sigma, USA</td><td>M8823</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>591136</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit</td><td>Beyotime, China</td><td>C3206</td><td></td></tr><tr><td>CelLyticTM M Zelllyse Reagenz&nbsp;</td><td>Sigma, USA</td><td>107M4071V</td><td></td></tr><tr><td>ClonExpress II Ein-Schritt-Klonierungskit&nbsp;</td><td>Vazyme, China</td><td>C112</td><td></td></tr><tr><td>Chemilumineszenz-Nukleinsäure-Nachweiskit</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>T1269950</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>DNTP100-1KT</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco, USA</td><td>10569044</td><td></td></tr><tr><td>DPBS Puffer</td><td>Gibco, USA</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM9260G</td><td>0,5 M</td></tr><tr><td>EDTA-freier Proteasehemmer-Cocktail</td><td>Roche, USA</td><td>04693132001</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Maxi Plasmid Kit&nbsp;</td><td>Vazyme, China</td><td>&nbsp; DC202</td><td></td></tr><tr><td>FastPure Gel DNA Extraktion Mini Kit</td><td>Vazyme, China</td><td>DC301-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco, USA</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>FLAG Peptid Sigma</td><td>, USA</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma, USA</td><td>SHBK3676</td><td></td></tr><tr><td>GST Bulk Kit</td><td>GE Healthcare, USA</td><td>27-4570-01</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Puffer</td><td>Sigma, USA</td><td>SLBZ2837</td><td>1 M&nbsp;</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>34060</td><td></td></tr><tr><td>KoAc</td><td>Sangon Biotech, China</td><td>127-08-02</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000 Transfektionsreagenz</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>L3000001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM9530G</td><td>1 M</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM9759 &nbsp;</td><td>5 Mio. M&nbsp;</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Amresco, USA</td><td>M158-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Medium</td><td>Gibco, USA</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco, USA</td><td>10010023</td><td>PH 7.4</td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>Promega, USA</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin alkalische Phosphatase</td><td>Promega, USA</td><td>V5591</td><td></td></tr><tr><td></td><td>TBE Invitrogen, USA</td><td>15581044</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCI Puffer&nbsp;</td><td>Invitrogen, USA</td><td>15567027</td><td>1 M, PH 7,4</td></tr><tr><td>Tris-HCI Puffer&nbsp;</td><td>Invitrogen, USA</td><td>15568025</td><td>1 M, PH 8,0</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech, China</td><td>A600560</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro biochemische assays mit biotin-etiketten zur untersuchung von protein-nukleinsäure-wechselwirkungen

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen spielen eine wichtige Rolle in biologischen Prozessen wie Transkription, Rekombination und RNA-Stoffwechsel. Experimentelle Methoden zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen erfordern die Verwendung von Fluoreszenz-Tags, radioaktiven Isotopen oder anderen Etiketten, um bestimmte Zielmoleküle zu erkennen und zu analysieren. Biotin, ein nicht-radioaktives Nukleinsäurelabel, wird häufig in elektrophoretischen Mobilitätsschicht-Assays (EMSA) verwendet, wurde aber nicht regelmäßig zur Überwachung der Proteinaktivität während Nukleinsäureprozessen eingesetzt. Dieses Protokoll veranschaulicht den Nutzen der Biotinkennzeichnung während in vitro enzymatischer Reaktionen und zeigt, dass dieses Etikett gut mit einer Reihe von verschiedenen biochemischen Assays funktioniert. Insbesondere wird in Übereinstimmung mit früheren Befunden mit Radioisotop 32P-markierten Substraten über biotin-markiertes EMSA bestätigt, dass MEIOB (ein Protein, das speziell an der meiotischen Rekombination beteiligt ist) ein DNA-bindendes Protein ist, RNA-Helicase) löst biotinmarkierte RNA-Duplexstrukturen auf und dass MEIOB biotinmarkierte einsträngige DNA spaltet. Diese Studie zeigt, dass Biotin in der Lage ist, 32P in verschiedenen Nukleinsäure-bezogenen biochemischen Assays in vitro zu ersetzen.

Die Proteinstruktur von MEIOB und die in dieser Studie verwendeten Expressionskonstrukte sind in Abbildung 1Adargestellt. OB-Falten in MEIOB sind kompakte fassartige Strukturen, die einsträngige Nukleinsäuren erkennen und mit ihnen interagieren können. Eine der OB-Domänen (aa 136-307, Konstrukt A) bindet einsträngige DNA (ssDNA), das abgeschnittene Protein (aa 136-178 Schnitte, Konstrukt C) und die punktmutierte Form (R235A Mutation, Konstrukt E) von MEIOB haben keine DNA-bi...

Hier werden Protokolle für biochemische In-vitro-Tests mit Biotin-Etiketten vorgestellt, die für die Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen weit verbreitet sein können.

In Vitro biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

Dieses Protokoll bietet eine biotinmarkierte Plattform für die Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen, die sich als robust, zuverlässig, effizient und erschwinglich erweist. Die gleiche Charge der biotinmarkierten Nukleinsäuren kann über einen langen Zeitraum verwendet werden, wobei die Reproduzierbarkeit von Experimenten erhalten bleibt. Schließlich können alle hier beschriebenen biotingekennzeichneten Assays innerhalb eines Tages durchgeführt werden und erfordern keine spezielle Ausrüstung.Demonstriert wird das Verfahren von Lina Yu, einer Postgraduiertenin aus unserem Labor. Bereiten Sie MEIOB- und MOV10-Konstrukte vor und wandeln Sie sie in die entsprechenden Bakterien um. Um MEIOB zu extrahieren, pellet die Zellen über Zentrifugation und setzt sie in 20 Milliliter eiskalten Dulbecco Phosphat gepufferten Saline, oder DPBS, Puffer.Beschallen Sie die bakterielle Suspension auf Eis. Dann zentrifugieren Sie das Lysat bei 12.000 mal g und vier Grad Celsius für 15 Minuten, und übertragen Sie den Überstand auf ein frisches Rohr. Glutathion-Sepharose-Perlen vorwaschen und zwei Stunden lang mit dem Lysat bei vier Grad Celsius bebrüten.Zentrifugieren Sie die Mischung bei 750 mal g und vier Grad Celsius für eine Minute, um die Perlen zu pellet. Spülen Sie die Perlen achtmal mit 10 Millilitern eiskaltem PBS ab. Dann fügen Sie einen Milliliter Elutionspuffer hinzu, brüten Sie die Perlen bei vier Grad Celsius für 10 Minuten und lüeten die Perlen per Zentrifugation.Wiederholen Sie die Elution sechsmal, und bündeln Sie die sechs Fraktionen zusammen. Die eluierten Proteine in einen Zentrifugalfilter übertragen und durch Zentrifugation bei 7, 500 mal g bei einem Endvolumen von 100 bis 200 Mikrolitern konzentrieren. Um MOV10 zu extrahieren, drücken Sie das Protein in HEK293T-Zellen aus und pelletdien die Zellen gemäß den Manuskriptanweisungen.Das Pellet in drei Milliliterzelllysepuffer mit komplettem EDTA-freiem Protease-Hemmer-Cocktail aussetzen und 30 Minuten auf Eis inkubieren. Dann zentrifugieren Sie das Lysat bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie Anti-FLAG-Magnetperlen vor, indem Sie sie zweimal mit K150-Puffer waschen.Nach dem Waschen die Perlen in einem Milliliter eiskalten K150-Puffer wieder aufhängen und bei vier Grad Celsius mit sanfter Rotation zwei Minuten lang bebrüten. Sammeln Sie die Perlen auf einem Magneten, und entfernen Sie den Überstand. Fügen Sie die Perlen in die Zelle lysiert, und brüten bei vier Grad Celsius für zwei Stunden.Waschen Sie die Perlen mit K150 Puffer nach den Manuskriptrichtungen, und setzen Sie die Perlen in 300 Mikroliter FLAG-Elutionspuffer wieder auf. Legen Sie die Perlen auf einen Magneten, sammeln Sie den Überstand mit den MOV10-Proteinen und bestimmen Sie die Proteinkonzentration. Bereiten Sie die RNA-Oligonukleotide vor, indem Sie jeden Oligo auf 20 Mikromolar verdünnen und sie dazu anglühen, RNA-Duplexe gemäß den Manuskriptanweisungen zu bilden.Für den MEIOB elektrophoretic mobility shift assay,oder EMSA, mischen Sie die Reagenzien nach den Manuskriptrichtungen. Fügen Sie Wasser für ein endgültiges Reaktionsvolumen von 20 Mikroliterhinzuleinen hinzu. Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für 30 Minuten, und fügen Sie dann 5x Stop-Puffer hinzu.Für den MOV10 Helicase-Aktivitätstest die Reagenzien nach den Manuskriptrichtungen mischen und Wasser für ein Endreaktionsvolumen von 20 Mikrolitern hinzufügen. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten, 30 Minuten und 60 Minuten, und fügen Sie dann 5x Stop-Puffer hinzu, um die Reaktion zu stoppen. Dann bereiten Sie ein 20% natives Polyacrylamid-Gel zu und laden 20 bis 25 Mikroliter jeder Probe in jeden Brunnen.Führen Sie das Gel bei 100 Volt auf einem Eisbad, bis der Bromphenol-Blaue Marker in das untere Viertel des Gels migriert ist. Acrylamid ist schädlich und giftig. Es ist wichtig, es mit entsprechender persönlicher Schutzausrüstung zu behandeln.Zerlegen Sie die Gelplatten und trimmen Sie das Gel, indem Sie Ladebrunnen und ungenutzte Bahnen entfernen. Legen Sie das Gel in 0,5x TBE-Puffer. Schneiden Sie Filterpapier und Nylonmembran auf die Größe des Gels, befeuchten Sie das Papier und die Membran vor und montieren Sie den Stapel für die Übertragung.Übertragen Sie die Proben vom Gel in einem halbtrockenen elektrophoretischen Gerät mit 90 Milliampere für 20 Minuten auf die Membran. Vernetzen Sie dann die Proben, indem Sie die Membran 45 bis 60 Sekunden lang mit 120 Millijoule pro Zentimeter quadratisch bestrahlen. Für die Chemilumineszenzerkennung beginnen Sie mit dem Hinzufügen von 20 Millilitern Sperrpuffer in der Membran und inkubieren Sie ihn für 15 bis 30 Minuten, während sie sanft schüttelt.Entfernen Sie den Blockierungspuffer vorsichtig, und ersetzen Sie ihn durch einen Konjugat-/Blockierungspuffer. Inkubieren Sie die Membran erneut für 15 Minuten. Waschen Sie die Membran viermal, während Sie fünf Minuten pro Wäsche schütteln.Dann 30 Milliliter Substrat-Gleichgewichtspuffer in die Membran geben und fünf Minuten lang bebrüten, während sie bei 20 bis 25 Rpm schüttelt. Bedecken Sie die gesamte Oberfläche der Membran mit Substrat-Arbeitslösung, und inkubieren Sie für fünf Minuten. Scannen Sie die Membran nach der Inkubation ein bis drei Sekunden lang in einem chemilumineszierenden Bildgebungssystem.Die Reinigung der MEIOB-Proteine A, C und E kann mit Coomassie-Blaufärbung und Western-Blot-Analyse verifiziert werden. Die roten Pfeile zeigen die Positionen der gereinigten MEIOB-Proteine an. Wechselwirkungen von MEIOB und einsträngiger DNA können mit EMSA visualisiert werden.Konzentrationsabhängige Bindung und Spaltung werden beobachtet. Wie erwartet interagiert nur der Wildtyp MEIOB-A mit der DNA, während die mutierten MEIOB-E und MEIOB-C dies nicht tun. Wechselwirkungen von MEIOB und einsträngiger RNA können ebenfalls beobachtet werden.Wildtyp MEIOB zeigt konzentrationsabhängige Bindungs- und Exonukleaseaktivität auf einsträngiger RNA. Der quantitative Vergleich zeigt jedoch, dass MEIOB DNA mit einer höheren Effizienz als RNA bindet. Die Reinigung von MOV10 wurde mit Coomassie-Blaufärbung überprüft, und die Helicase-Aktivität des Proteins wurde an einem RNA-Duplex mit einem Fünf-Prim-Überhang gemessen.Mit zunehmender Reaktionszeit entlädt MOV10 die doppelsträngige RNA nach und nach. Um die Kosten des Assays zu senken, kann die Chemilumineszenzdetektion entweder mit einer doppelten Verdünnung der Detektionskit-Reagenzien oder mit selbsthergestellten Reagenzien durchgeführt werden. Das hier beschriebene Protokoll verwendete erfolgreich biotinmarkierte Nukleinsäuren als Substrate für in vitro biochemische Assays wie EMSA und für enzymatische Reaktionen, bei denen Biotin nicht häufig verwendet wurde.

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Forschung

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Testen Protein-Protein-Interaktion ist für die Präparation von Protein-Funktionalität unverzichtbar. Hier stellen wir...

Proteinmembran Overlay Assay: Ein Protokoll, die Interaktion zwischen löslichen und unlöslichen Proteinen testen In-vitro-</em

Dieses Video zeigt eine Technik, die biotinylierte zellpenetrierende Peptide verwendet, um intrazelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erkennen. Die zellpenetrierenden Peptide erleichtern es dem konjugierten Peptid, in eine Zelle einzudringen und spezifisch an seine interagierenden Proteine zu binden. Das Biotin ermöglicht nach der Bindung an Avidin die Reinigung des Komplexes der interagierenden Proteine aus einem Zelllysat.

Biotinylierte zellpenetrierende Peptidsonde zum Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen

In diesem Video demonstrieren wir das Verfahren zur Bestimmung der Helikase-Aktivität eines Zielproteins, um das Biotin-markierte dsRNA-Substrat abzuwickeln. Die Aktivität des Enzyms wurde durch die Analyse der elektrophoretischen Mobilitätsverschiebung identifiziert, gefolgt von einem Chemilumineszenz-Assay mit chemilumineszierendem Enzym-konjugiertem Streptavidin.

Messung der Helikase-Aktivität eines Zielproteins mit Hilfe von Biotin-markierten RNA-Duplexen

Wir entwickelten eine quantitative DNA-bindenden, ELISA-basierten Assay Transkriptionsfaktor-Interaktionen mit DNA zu messen. Hohe Spezifität für das RUNX2 Protein wurde mit einer Consensus-DNA-Oligonukleotid und Erkennung spezifischer monoklonaler Antikörper erreicht. Kolorimetrischen Nachweis mit einem Enzym-gekoppelten Antikörper Substrat-Reaktion wurde in Echtzeit überwacht.

Eine quantitative Assay zur Protein Studie: DNA-Wechselwirkungen, Discover Transkriptionsregulatoren der Genexpression, und identifizieren Novel Anti-Tumor-Wirkstoffe

Die Protokolle beschreiben kinetische Untersuchungen von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit Bio-Schicht-Interferometrie. F-ATP-Synthase, die in der zellulären Energiestoffwechsel beteiligt ist, kann durch die ε-Untereinheit in Bakterien gehemmt werden. Wir haben Bio-Schicht Interferometrie geeignet ist, Wechselwirkungen des katalytischen Komplexes mit inhibitorischer C-terminalen Domäne ε zu studieren.

Bio-Schicht-Interferometrie zur Messung der Kinetik der Protein-Protein-Interaktionen und allosterische Ligandeneffekte

Zwei biotinylierungsbasierte Verfahren zur Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen, die an der Plasmamembran exprimiert werden, sind in diesem Bericht dargestellt.

Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen in primären Astrozytenkulturen unter Verwendung von Biotinylierung

Dies ist ein Protokoll zur intrazellulären Proteinprotein Interaktionen basierend auf Biotin-Avidin Pulldown-System mit der Neuheit kombinieren Zelle eindringen Sequenzen zu studieren. Der Hauptvorteil ist, dass die Zielsequenz mit lebenden Zellen statt Zelle Lysates inkubiert wird und daher die Interaktionen im Zusammenhang mit zellulären auftreten werden.

Biotinylierte Zelle eindringen Peptide, intrazelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen zu studieren

In dieser Arbeit stellen wir eine optimierte in vitro Methode vor, um Proteininteraktoren spezifischer RNA-Sequenzen aufzudecken, zu quantifizieren und zu validieren, wobei Gesamtproteinextrakt aus menschlichen Zellen, Streptavidin-Kügelchen, die mit biotinylierter RNA beschichtet sind, und Massenspektrometrie-Analysen verwendet werden.

Eine optimierte quantitative Pull-Down-Analyse von RNA-bindenden Proteinen unter Verwendung kurzer biotinylierter RNA

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Untersuchung von DNA-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung eines Streptavidin-basierten Biolayer-Interferometrie-Systems (BLI). Es werden die wesentlichen Schritte und Überlegungen zur Verwendung grundlegender oder fortgeschrittener Bindungskinetik zur Bestimmung der Gleichgewichtsbindungsaffinität (KD) der Wechselwirkung beschrieben.

Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen mit Streptavidin-basierter Biolayer-Interferometrie

Das Protokoll stellt eine Methode für die kovalente In-vivo-Bindung von Biotin an Proteine vor, die auf ihrer Nähe zu einer Biotin-Ligase basiert, die mit einem Protein von Interesse fusioniert ist. Diese Modifikation ermöglicht eine selektive Anreicherung der Proteine mit Streptavidin-Kügelchen, wie sie in Proteininteraktionsstudien benötigt wird.

Im lebenden Organismus Proximity-Biotinylierung für Proteininteraktionsstudien in Paramecium tetraurelia

Erfahren Sie robuste biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen. Diese effiziente Methode ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse ohne spezielle Ausrüstung.

In Vitro biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen

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