Name: In Vesiculo Synthese von Peptid Membran Vorläufer für autonomeve Vesikelwachstum (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Lernen Sie die Herstellung von Peptid-basierten kleinen unilamellären Vesikeln mittels Film-Rehydratation von Glasperlen. Diese Methode ermöglicht die Einbindung empfindlicher Proben wie Rohzellextrakte für biochemische Forschung.

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Wir danken der finanziellen Unterstützung durch die DFG TRR 235 (Emergence of Life, Projekt P15), den European Research Council (Fördervertrag Nr. 694410 AEDNA) und die TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (Projekt Nr. 9.05) . Wir danken E. Falgenhauer für ihre Hilfe bei der Probenvorbereitung. Wir danken A. Dupin und M. Schwarz-Schilling für ihre Hilfe beim TX-TL System und nützliche Diskussionen. Wir danken N. B. Holland für die nützlichen Diskussionen.

1. Expression von Elastin-ähnlichen Polypeptiden
<ol><li>Tag 1: Vorbereitung einer Starterkultur und Vorräte für Peptidexpression
	<ol>
<li>Vorbereiten und Autoklavausdruckskulturkolben (4 x 2,5 l) und 3 L LB-Medium. Für 1 L LB Medium 25 g LB-Pulver zu 1 L Reinstwasser hinzufügen.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Starterkultur mit 100 ml LB-Medium, 50 l sterilgefilterter (0,22-m-Filter)-Chloramphenicol-Lösung (25 mg/ml in EtOH) und 50 l sterilgefiltertem (0,22-mm-Filter) Carbenicillin-Lösung (100 mg/ml in 50 % EtOH und 50 % Reinstwasser) vor.</li>
		<li>Fügen Sie einen kleinen Streifen aus einem vorgefertigten Bakterienbestand hinzu, der den E. coli-Stamm BL21(DE3)pLysS mit dem pET20b(+)-Expressionsvektor kodiert, der die Polypeptidsequenz MGHGVGVP((GEGVP)4(GVGVP))4((GFGVP)4(GVGVP))3 (GFGVP)4GWP (abgekürzt EF) zu einer vorgewärmten 100 ml Starterkultur und inkubieren bei 37 °C für 16 h mit 250 U/min in einem Schüttelinkubator (E. coli-Stämme und Vektoren sind auf Anfrage erhältlich).</li>
		<li>Die Ausdruckskulturkolben und die LB-Medien über Nacht bei 37 °C vorwärmen, so dass sie für den nächsten Tag vorbereitet werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Tag 2: Proteinexpression
	<ol>
<li>Fügen Sie 750 ml LB-Medium zu jedem Expressionskulturkolben, 375 l sterilgefilterten (0,22 m Filter) Chloramphenicol-Bestand (25 mg/ml in EtOH) und 375 l sterilgefilterten (0,22 -m-Filter) Carbenicillin-Bestand (100 mg/ml in 50% EtOH und 50% Ultrareinstwasser) hinzu.</li>
		<li>Nach dem Rühren, um die Antibiotika zu verteilen, nehmen Sie 2 ml des Mediums als Referenzprobe für die optische Dichtemessung bei 600 nm (OD600).</li>
		<li>7,5 ml der Startkultur zum Ausdruckskolben hinzufügen und 1 h bei 37 °C mit 250 U/min brüten.</li>
		<li>Nach diesem Schritt wird die OD600 jedes Kolbens alle 20 min überprüft.</li>
		<li>Wenn die optische Dichte etwa 0,8 erreicht, reduzieren Sie die Temperatur auf 16 °C und induzieren Sie die Peptidexpression, indem Sie 750 l von 1 M steril-gefiltertem Isopropylthiogalactosid (IPTG) in reinem Wasser in jeden Expressionskolben einbauen.</li>
		<li>Inkubieren Sie den Expressionskolben mit den induzierten Bakterien bei 16 °C für 16 h mit 250 U/min.</li>
	</ol></li>
	<li>Tag 3: Extraktion des exprimierten Polypeptids
	<ol>
<li>Den Zentrifugationskolben vorwiegen, um die Bestimmung der Masse des Zellpellets nach der Ernte zu ermöglichen.</li>
		<li>Ernten Sie alle Bakterien aus den Expressionskolben durch Zentrifugation für 20 min mit einer vorgekühlten Zentrifuge bei 4.000 x g und 4 °C.</li>
		<li>Gießen Sie den Überstand aus und blots die Zentrifugenflaschen auf ein steriles Papiertuch.</li>
		<li>Wiegen Sie die Zentrifugationskolben und berechnen Sie die Zellpelletmasse.</li>
		<li>Setzen Sie die Zellen, die von 750 ml der ursprünglichen Zellkultur nach unten pelletiert werden, in 15 ml phosphatgepufferter Saline (PBS, pH 7,4) durch Pipettieren und Zentrifuge bei 4.000 x g für 20 min bei 4 °C. Gießen Sie den Überstand aus und blots die Zentrifugenflaschen auf ein steriles Papiertuch.</li>
		<li>Das Zellpellet für den Lyseschritt in 2 ml Puffer pro 1 Gramm Zellpellet mit PBS (pH 7.4) mit Lysozym (1 mg/ml), 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 1 mM Benzamidin und 0,5 U DNase I, aufsetzen.</li>
		<li>Beschallen Sie die Zellen für die weitere Lyse auf Eis mit einem Beschallungsgerät bei 8 W für 9 min mit abwechselnd10 s Beschallung und 20 s Pausenschritten, gefolgt von einer 9-min Pause, in der die Probe auf Eis gekühlt werden sollte. Wiederholen Sie den 9 min Beschallungsschritt noch einmal.</li>
		<li>Fügen Sie 2 ml 10% (w/v) Polyethyleneimin (PEI) pro 1 L der ursprünglichen Zellkultur für Nukleinsäurefällung hinzu.</li>
		<li>Die Probe in 2 ml Zentrifugenröhrchen verteilen und bei 60 °C 10 min inkubieren, gefolgt von einer Inkubation für 10 min bei 4 °C.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Lösung bei 16.000 x g für 10 min bei 4 °C und sammeln Sie den Überstand, der das ELP enthält.</li>
	</ol></li>
	<li>Proteinreinigung durch inverses Temperaturradfahren:
	<ol>
<li>Stellen Sie den Überstand auf einen pH-Wert von 2 ein, um den hydrophilen Teil des Peptids auf hydrophobe zu schalten und eine Aggregation zu induzieren. Zur Einstellung des pH-Wertes werden Phosphorsäure und Natriumhydroxid verwendet. pH-Streifen reichen aus, um den pH-Wert zu bestimmen.</li>
		<li>Um die Ausbeute der Reinigung der Probe zu verbessern, erhitzen Sie die Probe auf 60 °C und fügen Sie Natriumchlorid bis zu 2 M hinzu.</li>
		<li>Anschließend zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur (RT).</li>
		<li>Entsorgen Sie den Überstand und lösen Sie das Pellet in PBS wieder auf (aber nur die Hälfte des Anfangsvolumens wird im Vergleich zum vorherigen Schritt verwendet).</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert mit Phosphorsäure und Natriumhydroxid auf 7 ein. pH-Streifen sind ausreichend genau, um den pH-Wert zu bestimmen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Probe anschließend bei 16.000 x g für 10 min bei 4 °C.</li>
		<li>Sammeln Sie den Überstand und wiederholen Sie die Schritte 1.4.1–1.4.6 bis 3x insgesamt, mit der Ausnahme, dass in der letzten Wiederholung von Schritt 1.4.4 nur Wasser anstelle von PBS hinzugefügt wird.</li>
		<li>Messen Sie die Konzentration der Peptide mit einem Absorptionsspektrometer. Verwenden Sie einen Aussterbekoeffizienten von 5500/M/cm bei 280 nm.</li>
		<li>Stellen Sie die Konzentration des ELP auf 700 m ein.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Vesikelproduktion mit der Glasperlen-Methode
<ol><li>Konzentrieren Sie die ELP-Lösung mit einem Zentrifugalvakuumkonzentrator auf 1,1 mM.</li>
	<li>Mischen Sie 200 l der konzentrierten ELP-Lösung mit 1.250 l eines 2:1 Chloroform/Methanol-Gemischs, gefolgt von Wirbeln.</li>
	<li>1,5 g kugelförmige Glasperlen (212–300 m groß) zu einem runden Bodenkolben von 10 ml hinzufügen.</li>
	<li>Fügen Sie die Lösung mit ELP und dem Chloroform/Methanol-Gemisch in den runden Bodenkolben und mischen Sie sie durch sanftes Schütteln.</li>
	<li>Schließen Sie den Kolben an einen Rotationsverdampfer an. Stellen Sie die Drehzahl auf 150 Umdrehungen pro Minute ein und regulieren Sie den Druck auf -0,2 x 105 Pa (-200 mbar) ca. 4 min, bis die Flüssigkeit bei Raumtemperatur verdampft ist.</li>
	<li>Legen Sie den runden Bodenkolben mindestens 1 h in einen Trockenrestor, um sicherzustellen, dass die verbleibenden Chloroformen und Methanolverdampfen verdampfen. Um den Verlust der Glasperlen zu vermeiden, sollte lose befestigte Aluminiumfolie um die runde Bodenkolbenöffnung gewickelt werden.</li>
	<li>Für ein einzelnes Experiment 100 mg der Peptid bedeckten Glasperlen mit 60 l der Quelllösung, wie PBS, mischen. Inkubieren Sie diese Probe bei 25 °C für 5 min.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Probe schnell mit einer Tischzentrifuge, um die Glasperlen zu sedimentieren.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu sammeln, der die Vesikel enthält.</li>
</ol>3. Transkription von RNA Aptamer dBroccoli In den Vesikeln
<ol><li>Reinigen Sie den Labortisch mit Tüchern, die die RNase-Dekontaminationslösung enthalten, um eine RNase-freie Arbeitsumgebung zu schaffen.</li>
	<li>Mischen Sie die ssDNA (5 M) bestehend aus der T7-Promotor- und dBroccoli-Sequenz (GAGACGGTCGGGTCCTCTCTGAGACGGTCGGGTCCAGATATTCGTGTCTCTCTCGAGTAGAGTGTGTGGGGGCTC) sowie dem nicht kodierenden Strang (5 RNAPol-Reaktionspuffer [40 mM Tris-HCl (pH = 7,9), 6 mM MgCl2, 1 mM Dithiothreitol (DTT) und 2 mM Spermidin], um die DNA-Vorlage für die Transkriptionsreaktion vorzubereiten.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Lösung bei 90 °C für 5 min, gefolgt von einem langsamen Temperaturabfall auf 20 °C für 30 min.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 1 mM (5Z)-5-(3,5-Difluor-4-hydroxybenzyliden)-2,3-dimethyl-3,5-dihydro-4H-imidazol-4-on (DFHBI) Lösung vor, indem Sie 1,26 mg DFHBI in 5 ml DMSO auflösen.</li>
	<li>Vorbereitung der Transkriptionsreaktion durch Mischen des RNAPol-Reaktionspuffers [40 mM Tris-HCl (pH = 7,9), 6 mM MgCl2, 1 mM Dithiothreitol (DTT) und 2 mM Spermidin] mit 125 mM KCl, 15 mM MgCl2, 4 mM rNTP, 10 mM DFHBI, 200 nM DNA-Vorlage, 0,5 U/L Inhibitor murin und Wasser.</li>
	<li>Unmittelbar vor Beginn der Reaktion 4 U/L T7-Polymerase hinzufügen.</li>
	<li>Verwenden Sie diesen Reaktionsmix als Quelllösung in Schritt 2.7 und inkubieren Sie bei 37 °C für die Dauer des Experiments, die in der Regel 1 h beträgt.</li>
</ol>4. Transkriptions-Übersetzung (TX-TL) Reaktion
HINWEIS: Für die Transkriptions-Translation-Reaktion wird ein roher Zellextrakt sowie Reaktionspuffer und DNA benötigt. Der Rohzellextrakt wird wie in Sun et al.18beschrieben hergestellt. Für eine TX-TL-Reaktion verwenden Sie Folgendes: 33% (v/v) des Rohextrakts E. coli, 42% (v/v) Reaktionspuffer und 25% (v/v) phenol-chloroform gereinigte DNA plus Additive. Die Endkonzentrationen betragen ca. 9 mg/ml Protein, 50 mM HEPES (pH = 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/ml tRNA, 26 mM Coenzym A, 0,33 mM NAD, 0,75 mM cAMP, 68 mM Folinsäure, 1 mM , 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000, 13,3 mM Maltose, 1 U T7 RNA Polymerase und 50 nM Plasmid-DNA in Reinstwasser.
<ol><li>
Phenol-Chlorform-Reinigung der DNA-Schablone
	<ol>
<li>Bereiten Sie sechs Nachtkulturen mit 5 ml Medium und 5 l steril-gefilterter (0,22 m Filter) Carbenicillin-Lösung (100 mg/ml in 50% EtOH und 50% Reinstwasser) vor.</li>
		<li>Fügen Sie einen kleinen Streifen aus einem vorgefertigten Bakterienbestand, der DH5-E. coli mit dem pET20b(+)-Expressionsvektor enthält, zu jeder vorgewärmten 5 ml Nachtkultur hinzu und brüten bei 37 °C für 16 h mit 250 U/min. Je nachdem, welches Peptid (EF) oder Protein (YPet oder mVenus) exprimiert werden soll, wird ein spezifisches Kodierungsplasmid verwendet.</li>
		<li>Extrahieren Sie das Plasmid mit einem Mini-Prep-Kit, wie in der Bedienungsanleitung beschrieben oder durch Befolgung des Protokolls von Zhang et al.24.</li>
		<li>Bereiten Sie 100 l der vorgereinigten Plasmid-DNA vor (die Konzentration kann zwischen 200–600 ng/l liegen) und mischen Sie sie mit 100 l Roti-Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (pH = 7,5–8,0) in einem Mikrozentrifugenrohr, um eine bessere Phasentrennung zu ermöglichen.</li>
		<li>Umkehren Sie das Rohr vorsichtig bis zu 6x und Zentrifuge für 5 min bei 16.000 x g bei RT.</li>
		<li>Fügen Sie der oberen Phase des Rohres 200 l Chloroform hinzu und invertieren Sie das Rohr bis zu 6x.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 x g für 5 min bei RT.</li>
		<li>Pfeifen Sie den Überstand auf ein separates Rohr und fügen Sie 10 l von 3 M Natriumacetat für die Ethanolfällung hinzu.</li>
		<li>1 ml -80 °C kaltes Ethanol hinzufügen und die Probe bei -80 °C für 1 h lagern.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 x g für 15 min bei 4 °C.</li>
		<li>Den Überstand dekantieren und 1 ml -20 °C kaltes 70% (v/v) Ethanol hinzufügen.</li>
		<li>Zentrifuge bei 16.000 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
		<li>Entfernen Sie die Flüssigkeit durch Pipettieren. Achten Sie darauf, das DNA-Pellet nicht zu stören.</li>
		<li>Lagern Sie die Probe ca. 15 min bei RT, um das verbleibende Ethanol zu verdampfen.</li>
		<li>Fügen Sie der Probe Reinstwasser hinzu, um die Probenkonzentration auf ca. 300 nM einzustellen, die durch Absorption bei 260 nm gemessen wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der TX-TL-Reaktion
	<ol>
<li>Den vorbereiteten Rohzellextrakt und den Reaktionspuffer auf Eis auftauen.</li>
		<li>Für einen 60-L-Reaktionsmix die Plasmid-DNA (phenol-chloroform gereinigt) auf 37,5 l des Reaktionspuffers [50 mM HEPES (pH = 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/ml tRNA, 26 mM Coenzym A, 0,33 mM NAD , 0,75 mM cAMP, 68 mM Folinsäure, 1 mM Spermidin, 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000 und 13,3 mM Maltose), gefolgt von der Zugabe von 28,7 l Rohzellextrakt. Auf ein endreines Volumen mit Reinstwasser auf 58,8 l füllen.</li>
		<li>Unmittelbar vor Beginn der Reaktion 1,2 l der T7-RNA-Polymerase-Lösung hinzufügen und die Probe durch Pipettieren nach oben und unten mischen.</li>
		<li>Verwenden Sie diesen Reaktionsmix als Quelllösung in Schritt 2.7 und inkubieren Sie bei 29 °C für die Dauer des Experiments, die in der Regel 4–8 h beträgt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Konjugation von Elastin-ähnlichen Polypeptiden mit Fluorophoren über Kupfer katalysierteS Aszid-Alkyn-Huisgen-Cycloaddition
<ol><li>Bereiten Sie eine 20 mM NHS-Azid-Linker -Lösung (Azidobutylsäure N-Hydroxysuccinimid-Ester) in DMSO vor.</li>
	<li>Mischen Sie 250 l der ELP-Lösung (600 m) mit PBS (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,42 g/L Na2HPO4, 0,27 g/L K2HPO4, pH = 7,2) und NHS-Azid (1,2 mM) und inkubieren sie für 12 h bei RT.</li>
	<li>Die Probe in eine 10 kDa Dialysekassette legen und bei 4 °C für 12 h in 1 L Reinstwasser lagern, um die Salze und das Rest-NHS-Azid zu entfernen.</li>
	<li>Mischen Sie das aktivierte ELP (500 m) mit dem alkynkonjugierten Farbstoff (500 m), Cy5-Alkyn oder Cy3-Alkyn.</li>
	<li>Mischen Sie diese Probe mit 1 mM TBTA (tris(benzyltriazolylylmethyl)amin), 10 mM TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphinhydrochlorid) und 10 mM CuSO4 und inkubieren bei 4 °C für 12 h.</li>
	<li>Die Probe in eine 10 kDa Dialysekassette geben und bei 4 °C für 12 h in 1 L Reinstwasser lagern, um die Salze und Restfarbstoffe zu entfernen.</li>
	<li>Diese farbmodifizierten ELPs werden in einer 1:1-Mischung aus den Cy3-gekennzeichneten ELPs und den Cy5-gekennzeichneten ELPs analog zu den Peptiden im zweiten Teil verwendet.</li>
</ol>

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<li>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+All+E.+coli+TX-TL+Toolbox+2.0%3A+A+Platform+for+Cell-Free+Synthetic+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).</li>
<li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+and+polymersomes%3A+a+comparative+review+towards+cell+mimicking%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Filmrehydratation ist ein gängiges Verfahren zur Herstellung von kleinen unilamellalaren Vesikeln. Die Hauptursache des Versagens ist die falsche Handhabung der im Verfahren verwendeten Materialien.

Zunächst werden die ELPs von E. coli-Zellen produziert. Die Ausbeute nach der ELP-Reinigung kann je nachdem, wie sorgfältig das Protokoll während seiner entscheidenden Schritte durchgeführt wird, erheblich variieren. Dies ...

Die Schaffung von synthetischen lebenden zellulären Systemen wird in der Regel aus zwei verschiedenen Richtungen angegangen. Bei der Top-Down-Methode wird das Genom eines Bakteriums auf seine wesentlichen Bestandteile reduziert, was letztlich zu einer minimalen Zelle führt. Im Bottom-up-Ansatz werden künstliche Zellen de novo aus molekularen Komponenten oder zellulären Subsystemen zusammengesetzt, die funktional in ein konsistentes zellähnliches System integriert werden müssen.
Im de novo-Ansatz wird die Kompartimentierung der notwendigen biochemischen Komponenten in der Regel mit Membranen aus Phospholipiden oder Fettsäuren1,2,3,4erreicht. Denn "moderne" Zellmembranen bestehen hauptsächlich aus Phospholipiden, während Fettsäuren als plausible Kandidaten präbiotischer Membrangehäuse5,6gelten. Zur Bildung neuer Membranen oder zur Erleichterung des Membranwachstums müssen amphiphile Bausteine von außen7 oder idealerweise durch die Produktion innerhalb eines membranösen Fachs mit den entsprechenden anabolen Verfahren 4 ,8.
Während die Lipidsynthese ein relativ komplexer Stoffwechselprozess ist, können Peptide recht leicht mit zellfreien Genexpressionsreaktionen9,10produziert werden. Daher stellen Peptidmembranen, die durch amphiphile Peptide gebildet werden, eine interessante Alternative zu Lipidmembranen als Gehäuse für künstliche Zellmimiks dar, die11wachsen können.
Amphiphile Elastin-ähnliche Diblock-Copolymere (ELPs) sind eine attraktive Klasse von Peptiden, die als Baustein für solche Membranen dienen können12. Das grundlegende Aminosäuresequenzmotiv von ELPs ist (GaGVP)n, wobei "a" eine beliebige Aminosäure außer Prolin und "n" die Anzahl der Motivwiederholungen13,14,15,16,17 . ELPs wurden mit einem hydrophoben Block erstellt, der hauptsächlich Phenylalanin für a enthält, und einem hydrophilen Block, der hauptsächlich aus Glutaminsäurebesteht 11. Je nach A- und Lösungsparametern wie pH- und Salzkonzentration weisen ELPs einen sogenannten inversen Temperaturübergang bei Temperatur Ttauf, bei dem die Peptide einen vollständig reversiblen Phasenübergang von einem hydrophilen zu hydroben zustand. Die Synthese der Peptide kann einfach in Vesikelmit dem Bakterienzellextrakt "TX-TL" implementiert werden11,18,19,20,21, alle notwendigen Komponenten für gekoppelte Transkriptions- und Übersetzungsreaktionen.
Das TX-TL-System wurde zusammengekapselt, wobei die DNA-Vorlage die ELPs in ELP-Vesikel kodiert, wobei die Dehydrierung-Rehydratation von Glasperlen als feste Stütze verwendet wird. Die Bildung von Vesikel n.A. erfolgt durch Rehydrierung der getrockneten Peptide von der Perlenoberfläche11. Es können andere Methoden22 zur Vesikelbildung eingesetzt werden, die möglicherweise eine geringere Polydispersität und größere Vesikelgrößen aufweisen (z. B. Elektrobildung, Emulsionsphasentransfer oder mikrofluidische Verfahren). Zur Prüfung der Lebensfähigkeit der Verkapselungsmethode kann alternativ die Transkription des fluorogenen Aptamers dBroccoli23 verwendet werden11, was weniger komplex ist als die Genexpression mit dem TX-TL-System.
Durch die Expression der Membranbausteine in vesiculo und deren anschließende Einbindungin die Membran beginnen die Vesikel 11 zu wachsen. Die Membranintegration der ELPs kann durch einen FRET-Assay nachgewiesen werden. Zu diesem Zweck werden die ELPs, die für die Bildung der ursprünglichen Vesikelpopulation verwendet werden, mit fluoreszierenden Farbstoffen in gleichen Teilen konjugiert, die ein FRET-Paar bilden. Bei Expression von nicht gekennzeichneten ELPs in vesiculo und deren Einbau in die Membran werden die beschrifteten ELPs in der Membran verdünnt und damit das FRET-Signal um11abgenommen. Als vielseitige und gängige Methode zur Konjugation wird kupferkatalysierte Azid-Alkyn-Zyklusverwendet verwendet. Mit der Verwendung eines stabilisierenden Liganden wie Tris (Benzyltriazolylmethyl)-amin kann die Reaktion in einer wässrigen Lösung bei einem physiologischen pH-Wert ohne Hydrolyse von Reaktanten11durchgeführt werden, die für Konjugationsreaktionen geeignet ist. Peptide.
Das folgende Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung der Vorbereitung für wachsende ELP-basierte Peptidosomen. Die Expression der Peptide und vesikelbildung mit der Glasperlenmethode werden beschrieben. Darüber hinaus wird beschrieben, wie die Transkription des fluorogenen dBroccoli Aptamers und die Transkriptions-Translation-Reaktion für die Proteinexpression innerhalb der ELP-Vesikel implementiert werden kann. Schließlich ist ein Verfahren für die Konjugation von Elp mit Fluorophoren vorgesehen, das verwendet werden kann, um das Vesikelwachstum durch einen FRET-Assay11nachzuweisen.

<table><tbody><tr><td>2xYT</td><td>MP biomedicals</td><td>3012-032</td><td></td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>5PRIME Phase Lock GelTM Tube</td><td>VWR</td><td>733-2478</td><td></td></tr><tr><td>Alkin-konjugiert Cy3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>777331</td><td></td></tr><tr><td>Alkin-konjugiert Cy5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>777358</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidin</td><td>Carl Roth</td><td>CN38.2</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta 2 E. coli Stamm</td><td>Novagen</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td><td>Bio-rad</td><td>500-0201</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Carl Roth</td><td>6344.2</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Carl Roth</td><td>3886.3</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Carl Roth</td><td>4432.1</td><td></td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>USB</td><td>14121</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Carl Roth</td><td>P024.1</td><td></td></tr><tr><td>DFHBI</td><td>Lucerna Technologies</td><td>410</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth</td><td>A994.1</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Carl Roth</td><td>9065.2</td><td></td></tr><tr><td>Folinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>Glasperlen, säuregewaschen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1277</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>USB</td><td>16800</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6147</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (&beta;-Isopropylthiogalactosid</td>) <td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth</td><td>P017.1</td><td></td></tr><tr><td>K-Glutamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>Carl Roth</td><td>X968.2</td><td></td></tr><tr><td>Lysozym</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carl Roth</td><td>82,2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.3</td><td></td></tr><tr><td>Mg-Glutamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Bio-Spin-Chromatographie-Säulen</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Azid-Linker (y-Azidobuttersäureoxysuccinimidester)</td><td>Baseclick</td><td>BCL-033-5</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Carl Roth</td><td>263,2</td><td></td></tr><tr><td>pH-Streifen</td><td>Carl Roth</td><td>549,2</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonylfluorid</td><td>Carl Roth</td><td>6367,2</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>VWR</td><td>76180-684</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W290017</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat zweibasische Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8584</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasische Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8709</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>RNAPol-Reaktionspuffer</td><td>NEB</td><td>B9012</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Inhibitor murine</td><td>NEB</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Tücher</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9788</td><td></td></tr><tr><td>rNTP</td><td>NEB</td><td>N0466S</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol</td><td>Carlroth</td><td>A156.1</td><td></td></tr><tr><td>RTS Aminosäure-Probenehmer</td><td>5 Prime</td><td>2401530</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Dialysekassetten, 10k MWCO (Kit)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>66382</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Carl Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Carl Roth</td><td>8655.1</td><td></td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>Sterilfiltriert (0,22 &μ; m filter)</td><td>Carl Roth</td><td>XH76.1</td><td></td></tr><tr><td>T7 Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>TBTA (Tris(benzyltriazolylmethyl)amin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>TCEP (Tris(2-carboxyethyl)-phosphinhydrochlorid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Trisbase</td><td>Fischer</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (aus E. coli)</td><td>Roche angewendet Wissenschaft</td><td>MRE600</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>USB</td><td>23160</td><td></td></tr></tbody></table>

in vesiculo synthese von peptid membran vorläufer für autonomeve vesikelwachstum

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Die Abteilisierung biochemischer Reaktionen ist ein zentraler Aspekt synthetischer Zellen. Zu diesem Zweck dienen Peptid-basierte Reaktionsfächer als attraktive Alternative zu Liposomen oder fettsäurebasierten Vesikeln. Äußerlich oder innerhalb der Vesikel können Peptide leicht exprimiert werden und vereinfachen die Synthese von Membranvorläufern. Hier ist ein Protokoll zur Herstellung von Vesikeln mit Durchmessern von 200 nm auf Basis der amphiphilen Elastin-ähnlichen Polypeptide (ELP) unter Verwendung von Dehydrierung-Rehydratation aus Glasperlen vorgesehen. Ebenfalls vorgestellt werden Protokolle zur bakteriellen ELP-Expression und -Reinigung über inverseS Temperaturzyklierung sowie deren kovalente Funktionalisierung mit Fluoreszenzfarbstoffen. Darüber hinaus beschreibt dieser Bericht ein Protokoll, das die Transkription von RNA-Aptamer dBroccoli in ELP-Vesikeln als weniger komplexes Beispiel für eine biochemische Reaktion ermöglicht. Schließlich wird ein Protokoll zur Verfügung gestellt, das die Vesiculo-Expression von fluoreszierenden Proteinen und dem Membranpeptid ermöglicht, während die Synthese des letzteren zu einem Vesikelwachstum führt.

Vesikelproduktion Abbildung 1 zeigt Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) Bilder von Vesikeln, die mit verschiedenen Schwellungslösungen hergestellt wurden, und die Glasperlenmethode (siehe auch Vogele et al.11). Für die Probe in Abbildung 1Awurde nur PBS als Quelllösung verwendet, um die Bildung von Vesikeln zu beweisen und ihre Größe zu bestimmen. Wenn TX-TL als Quelllösung verwendet wurde (Ab...

Hier werden Protokolle zur Herstellung von peptidbasierten kleinen unilamellalaren Vesikeln vorgestellt, die wachstumsfähig sind. Um die Vesiculo-Produktion des Membranpeptids zu erleichtern, sind diese Vesikel mit einem Transkriptions-Translation-System und dem Peptid-kodierenden Plasmid ausgestattet.

In Vesiculo Synthese von Peptid Membran Vorläufer für autonomeve Vesikelwachstum

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

In unserem Protokoll verwenden wir die Filmrehydratation aus kleinen Glasperlen, um Reaktionsfächer aus Peptiden zu bilden. In Experimenten profitieren wir von der Einfachheit und Robustheit des Protokolls. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, auch empfindliche Proben, wie den verwendeten Rohzellextrakt, zu integrieren.Der Kontakt mit organischen Lösungsmitteln wird die Probe erheblich beeinflussen. Um dieses Verfahren zu beginnen, verwenden Sie einen Zentrifugalvakuumkonzentrator, um die ELP-Lösung auf 1,1 Millimolar zu konzentrieren. Mischen Sie 200 Mikroliter dieser konzentrierten Lösung mit 1, 250 Mikrolitern eines Zwei-zu-Eins-Chlor-Und-Methanol-Gemischs.Wirbel die Lösung gründlich zu mischen. Als nächstes fügen Sie 1,5 Gramm kugelförmige Glasperlen zu einem zehn Milliliter runden Bodenkolben hinzu. Fügen Sie die ELP- und Chloroform-Methanol-Lösung in den runden Bodenkolben und schütteln Sie sie vorsichtig.Schließen Sie den Kolben an einen Rotationsverdampfer an. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf 150 Umdrehungen pro Minute ein und regulieren Sie den Druck für etwa vier Minuten auf 20.000 Pascal, bis die Flüssigkeit bei Raumtemperatur verdampft ist. Es ist wicht

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Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Protokoll Details eine Methode zur quantitativen Messung von Peptid-Translokation in große unilamellare Lipidvesikel. Diese Methode liefert auch Informationen über die Geschwindigkeit der Membran-Translokation und kann verwendet werden, um Peptide, die effizient und spontan Kreuz Lipid-Doppelschichten zu identifizieren.

Mess-Peptide Translokation in große unilamellare Vesikel

Wir präsentieren eine Technik zur kontaktlosen Mikromanipulation von Vesikeln, mit lokalisierten Kalzium Ionen Steigungen. Mikroinjektion einer Kalzium-Ionen-Lösung, in der Nähe einer riesigen Lipid-Bläschen, wird genutzt, um die Lipidmembran, wodurch die Produktion der Membran röhrenförmige Ausstülpungen umzugestalten.

Membran Umbau des riesigen Vesikel in Reaktion auf lokalisierte Kalzium Ionen-Gradienten

Wir stellen ein Protokoll zur Rekonstitution von Membranproteinen und zur Verkapselung von Enzymen und anderen wasserlöslichen Komponenten in Lipidvesikeln von Submikrometer- und Mikrometergröße vor.

Aufbau von Stoffwechselnetzwerken außerhalb des Gleichgewichts in nano- und mikrometergroßen Vesikeln

Wir synthetisierten sternförmigen Gold nanostars mit einem silbernen Saat vermitteltes Wachstum Methode. Der Durchmesser der nanostars reicht von 200 bis 300 nm und die Anzahl der Spitzen variieren von 7 bis 10. Die Nanopartikel haben eine große Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Modus im nahen Infrarot zentriert.

Gold Nanostar Synthesis mit einem Silver Seed vermitteltes Wachstum Methode

Hier beschreiben wir die Verwendung eines sich selbst organisierenden 3-dimensionalen Gerüst zur Kultur humaner neuraler Vorläuferzellen. Wir präsentieren ein Protokoll, um die Zellen aus dem Gerüste Freisetzung analysiert anschließend zB mittels Durchflusszytometrie werden. Dieses Protokoll kann zu anderen Zelltypen angepasst werden, um detaillierte mechanistisch Studien durchzuführen.

Kultivierung humaner neuronaler Vorläuferzellen in einer 3-dimensionalen Self-Montage Peptide Hydrogel

Das folgende Protokoll stellt Techniken zur Verkapselung Pankreas β-Zellen in Schritt-Wachstum PEG-Peptid-Hydrogele durch Thiol-En-Foto-Klick-Reaktionen gebildet. Dieses Material-Plattform bietet nicht nur eine cytocompatible Mikroumgebung für Zellverkapselung, sondern erlaubt auch benutzergesteuerten rasche Erholung von Zellstrukturen innerhalb der Hydrogele gebildet.

Erzeugung und Verwertung von β-Zellen Spheroids Von Step-Wachstum PEG-Peptid-Hydrogele

Mikrofluidik-Strahl gegen eine Tröpfchen Schnittstelle Lipid-Doppelschicht bietet eine zuverlässige Möglichkeit, die Kontrolle über Vesikel mit Membran-Asymmetrie, die Aufnahme von Transmembranproteinen und Kapselung von Material zu erzeugen. Diese Technik kann angewandt werden, um eine Vielzahl von biologischen Systemen, in denen unterteilte Biomolekülen gewünscht studieren.

Lipiddoppelschicht Vesicle Erzeugung anhand Mikrofluidik Jetting

Wir beschreiben hier eine verbesserte Lumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (LRET) Verfahren, wo wir eine Protease-Schnittstelle zwischen dem Spender und Akzeptor-Fluorophor Stellen einzuführen. Diese Modifikation erlaubt es uns, spezifische LRET Signale aus Membranproteinen von Interesse, so dass für die Untersuchung von Membranproteinen ohne Proteinreinigung erhalten.

Lumineszenz-Resonanzenergietransfer zu Konformationsänderungen in Membranproteinen in Säugerzellen exprimiert Studieren

Elektronanofasern weisen eine hohe Oberflächenverhältnis, ausgezeichnete mechanische Integrität zu gewichten, und das Zellwachstum und Proliferation unterstützen. Diese Nanofasern haben eine breite Palette von biomedizinischen Anwendungen. Hier fertigen wir Keratin / PCL-Nanofasern, die Elektrospinntechnik, und zu charakterisieren, die Fasern für mögliche Anwendungen im Tissue Engineering.

Synthese von Keratin-basierten Nanofaser für Biomedizinische Technik

Selbstorganisierte Polyelektrolytkomplexe (PEC), die aus Heparin und Protamin hergestellt wurden, wurden auf Alginatkügelchen abgelagert, um die Freisetzung von osteogenen Wachstumsfaktoren einzufangen und zu regulieren. Diese Verabreichungsstrategie ermöglicht eine 20-fache Reduzierung der BMP-2-Dosis bei Wirbelsäulenfusionsanwendungen. Dieser Artikel veranschaulicht die Vorteile und die Herstellung von PECs.

Polyelektrolytkomplex für Heparin-Bindungsdomäne Osteogenisches Growth Factor Lieferung

Lernen Sie die Herstellung von Peptid-basierten kleinen unilamellären Vesikeln mittels Film-Rehydratation von Glasperlen. Diese Methode ermöglicht die Einbindung empfindlicher Proben wie Rohzellextrakte für biochemische Forschung.

In Vesiculo Synthese von Peptid Membran Vorläufer für autonomeve Vesikelwachstum

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