Name: Ex Vivo Okulomotor Slice Culture von embryonalen GFP-ausdrückenden Mäusen für Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Erfahren Sie die ex vivo Okulomotor-Schnittkulturmethode zur Echtzeitbildgebung von Axonwachstum in embryonalen GFP-Mäusen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Axonleitungsmechanismen im okulomotorischen System.

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Finanzierung durch das National Eye Institute [5K08EY027850], National Institute of Child Health and Development [U54HD090255], Harvard-Vision Clinical Scientist Development Program [5K12EY016335], die Knights Templar Eye Foundation [Career Starter Stipendium] und die Children es Hospital Ophthalmology Foundation [Faculty Discovery Award]. ECE ist ein Forscher des Howard Hughes Medical Institute.

Alle hier beschriebenen Tierarbeiten wurden in Übereinstimmung mit den Protokollen des Boston Children es Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt und durchgeführt.
1. Zeitzeitliche Paarungen
<ol><li>Platz ISLMN:GFP (Islet Motor Neuron Green Fluorescent Protein; MGI: J:132726; Jax Tg(Isl-EGFP*)1Slp/J Stock Nr.: 017952) männliche und weibliche Mäuse über Nacht zusammen. Wiegen Sie die Weibchen und zeichnen Sie Gewichte vor der Paarung auf. HINWEIS: ISLMN:GFP kenniert speziell motorische Neuronen mit einem farnesylierten GFP, das nicht zytotoxisch ist, lokalisiert sich auf die Zellmembran von motorischen Neuronen und ihren Axonen und ermöglicht es, die Nerven während der Entwicklung zu visualisieren25. Andere fluoreszierend markierte Linien könnten ebenfalls verwendet werden.</li>
	<li>Überprüfen Sie, ob vaginale Stecker am frühen Morgen. Das Datum, an dem ein Stecker identifiziert wird, wird als E0.5 bezeichnet.</li>
	<li>Bestätigen Sie die Schwangerschaft mit Gewichtszunahme und/oder Ultraschall bei E10.5. Schwangere Muttern sollten mindestens 1 g gewonnen haben. Embryonen sind auf Ultraschall bei E10.5 zu sehen.</li>
</ol>2. Herstellung von Reagenzien und Vibratom für die Scheibenkultur
<ol><li>500 ml Schneidpuffer vorbereiten: 5 ml HEPES und 5 ml Penicillin/Streptomycin auf 500 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Ca2+ und Mg2+hinzufügen.  Auf 4 °C abkühlen lassen. HINWEIS: Der zusätzliche Schneidpuffer sollte bei 4 °C gespeichert werden und kann für zukünftige Slice-Kulturexperimente verwendet werden.</li>
	<li>50 ml Kulturmedien vorbereiten: In einer sterilen Haube 12,5 ml HBSS, 12,5 ml Fetales Rinderserum, 250 l Glukose, 250 l L L L-Glutamin, 125 l HEPES zu 24,4 ml Fluorobright DMEM hinzufügen. (Endkonzentrationen: FlouroBright DMEM mit 25% HBSS, 25% FBS, 0,5% Glukose, 1 mM Glutamin und 2,5 mM HEPES.).  Erwärmen Sie die Kulturmedien in einem sterilen Wasserbad auf 37 °C. HINWEIS: Kulturmedien können bis zu 3 Wochen bei 4 °C gelagert werden.<ol>
<li>In einer sterilen Kapuze, fügen Sie 1,5 ml Kulturmedien zu jedem Brunnen einer 6-Well-Platte.  Fügen Sie jedem Brunnen eine Zellkultureinlage (Materialtabelle) hinzu.  In einen sterilen 37 °C und 5% CO2-Inkubator geben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4% Niedrigschmelztemperatur-Agarose vorbereiten: 2 g Niedrigschmelztemperatur-Agarose in 50 ml sterilem PBS auflösen. Mikrowelle in 30-60 s Intervallen bis vollständig gelöst. In ein 40 °C-Wasserbad geben, um Flüssigkeit aufzubewahren. HINWEIS: Extra-Agarose kann bei Raumtemperatur (RT) gelagert und für zukünftige Scheibenkulturexperimente geschmolzen werden.</li>
	<li>Vibratom einrichten: Legen Sie eine neue Klinge auf Vibratom. Prüfeinstellungen: Dicke 400-450 m. Vorchillen der Vibratome-Stufe. Legen Sie etwas Eis in die äußere Kammer. Verwenden Sie eine Kammer und Bühne, die Live-Slices gewidmet sind. Verwenden Sie nicht die gleiche Vibramkammer für festes Gewebe als Restfixativ könnte für Scheiben schädlich sein.</li>
	<li>Bereiten Sie den Mikroskop-Bühnen-Inkubator auf 37 °C und 5%CO2vor.</li>
	<li>Vorbereiten der Zerlegung: Chirurgische Instrumente reinigen und mit 70% Ethanol besprühen. Füllen Sie zwei Petrischalen mit HBSS, auf Eis legen. Öffnen Sie eine 12 Brunnengewebe-Kulturplatte und legen Sie den Deckel auf Eis mit der Unterseite nach oben. Öffnen Sie eine 6 Well-Gewebe-Kulturplatte und platzieren Sie Zellkultur-Membraneinsätze und 1,5 ml Zellkulturmedien in jedem Brunnen. Die Platte in einem 37 °C und 5% CO2-Inkubator vorwärmen.</li>
</ol>3. Ernte von E10.5-Embryonen und Scheibenaufbereitung
HINWEIS: Alle Schritte von diesem Punkt sollten so schnell wie möglich durchgeführt werden. Halten Sie die Embryonen jederzeit auf Eis.
<ol><li>Euthanisieren Sie die schwangere Mutter (E10.5) in einer CO2-Kammer. Führen Sie zervikale Dislokation durch.</li>
	<li>Den Bauch mit 70% Ethanol besprühen. Den Bauch mit einer Schere aufschneiden, die Gebärmutter entfernen und in eine Petrischale mit eiskaltem HBSS legen, um blutschnell wegzuwaschen. Bewegen Sie die gewaschene Gebärmutter zu einem zweiten Petri gefüllt mit Teller eiskalt HBSS.</li>
	<li>Entfernen Sie im Rahmen eines Sezierens die Embryonen aus dem Gebärmutterhorn und einzelnen Fruchtwassersäcken. Legen Sie die Embryonen auf die Unterseite des Deckels einer 12 Brunnenplatte. Auf Eis bleiben.</li>
	<li>Verwenden Sie unter einem Sezieren den Einzelnen, um alle Flüssigkeiten, die jeden Embryo umgeben, zu entfernen. HINWEIS: Embryonen kleben am Filterpapier, wenn sie berührt werden.</li>
	<li>Einbetten von Embryonen in Agarose. Gießen Sie geschmolzene Agarose über jeden Embryo, um es zu bedecken. Auf Eis bleiben. Sobald die Agarose verhärtet ist, kippen Sie jeden Embryo und gießen Sie zusätzliche Agarose auf der anderen Seite. Auf Eis bleiben.</li>
	<li>Mit einem fluoreszierenden Sezieren Bereich, trimmen Sie die Agarose um jeden Embryo, so dass es richtig ausgerichtet werden, wenn auf das Vibram-Stadium geklebt. Der okulomotorische Kern und das frühe Axonwachstum sind fluoreszierend. Richten Sie den Embryo so aus, dass der Kern, die auswachsenden Axone und das Auge eine Linie bilden, und trimmen Sie die Agarose mit einer Rasierklinge, die parallel zu dieser Linie geschnitten ist (dorsal zum Embryo, siehe Abbildung 1A). HINWEIS: Dies wird die Seite sein, die an das Vibratomstadium geklebt wird (der Embryo wird auf seinem Rücken positioniert, der Kopf am nächsten an der Vibratomklinge). Eine Linie zwischen dem okulomotorischen Kern und dem Auge sollte parallel zur Vibratomklinge sein.</li>
	<li>Füllen Sie die Vibratomekammer mit eiskaltem Scheibenpuffer. Den Embryo an das Vibratomstadium überlagern, so dass die Klinge parallel zum okulomotorischen Kern und den Augen ist. Sobald der Superkleber trocken ist, tauchen Sie das Vibratomstadium unter, so dass der Embryo nach weg von der Klinge ausgerichtet ist.</li>
	<li>In scheibenschneiden 400-450 m Scheiben.  Sammeln Sie jede Scheibe mit einer sterilen Transferpipette. In kalten Schneidpuffer geben.</li>
	<li>Wählen Sie unter dem Sezieren die Scheibe aus, die die okulomotorischen Kerne und Augen enthält. Mit einer sterilen Transferpipette auf den Zellkultureinsatz in die 6 Brunnenplatte legen. Geben Sie die Platte auf den 37 °C-Inkubator zurück. Alternativ können Sie eine Person schneiden und eine andere die Scheiben platzieren. Minimieren Sie die Zeit zwischen dem Schneiden und dem Platzieren in den Inkubator. HINWEIS: Scheiben sollten so ausgerichtet sein, dass die maximale Fluoreszenz, die von den Kernen und Axonen emittiert wird, dem objektiven Mikroskop-Objektiv am nächsten kommt. Auf einem invertierten Mikroskop sollten die Scheiben auf die Membran mit den Kernen und Axonen gelegt werden, die dem Objektiv unter der Platte am nächsten sind.</li>
	<li>Entfernen Sie die Rest-Agarose aus dem Vibratomstadium, überlagern Sie den nächsten Embryo auf die Stufe und wiederholen Sie die Schritte 3.7-3.9, bis alle Embryonen in Scheiben geschnitten und plattiert sind.</li>
	<li>Fügen Sie Inhibitor oder rekombinantes Molekül der Wahl zu Medien in jedem Brunnen hinzu, um eine Dosis-Wirkungs-Kurve zu erstellen.  In geeignetem Lösungsmittel verdünnen. HINWEIS: Wenn Sie DMSO verwenden, verwenden Sie nur die Gewebekultur-Klasse DMSO. Alternativ können proteineverdünnende Perlen an bestimmten Stellen auf der Scheibe platziert werden.</li>
	<li>In der 37 °C und 5% CO2-Kammer auf das Mikroskop stellen.  Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass alle 30 min (oder häufiger, falls gewünscht) Phasenkontrast- und Fluoreszenzfotos von jeder Scheibe aufnehmen. Scheiben können für 48-72 h gepflegt werden.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses ex vivo Slice Culture-Protokoll bietet erhebliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Axon-Leitlinien-Assays23. Die Größe jedes Kranialmotorkerns ist kein begrenzender Faktor, und eine schwierige Zerlegung ist nicht erforderlich. Die endogene Mikroumgebung, durch die die Axone wandern, ermöglicht die Änderung eines Signalwegs unter Beibehaltung anderer Signalwege. Darüber hinaus können Effekte an verschiedenen Punkten entlang der Axonbahn bewertet werden. Da axon guidance mehrere Cues und Komb...

Das Augenmotorsystem bietet ein elegantes System zur Untersuchung von Axon-Führungsmechanismen. Es ist relativ unkompliziert, bestehend aus drei Hirnnerven, die sechs extraokulare Muskeln (EOMs) innervieren, die das Auge bewegen, und dem Levator palpebrae superioris (LPS), der das Augenlid hebt. Der okulomotorische Nerv innerviert die LPS und vier EOMs - die unterlegene Schräglage und die mediale, minderwertige und überlegene Rectusmuskulatur. Die anderen beiden Nerven, die Trochlea und abducens, jeder nur innervate einen Muskel, die überlegene schräge und seitliche Rectus-Muskel, jeweils. Augenbewegungen bieten eine einfache Anzeige, zeigt, ob Innervation angemessen, fehlt oder abwegig war. Darüber hinaus gibt es menschliche Augenbewegungsstörungen, die aus Defiziten in der neuronalen Entwicklung oder Axonführung resultieren, kollektiv als die angeborenen Schädel-Disinnervationsstörungen (CCDDs)1bezeichnet.
Trotz dieser Vorteile wird das Augenmotorsystem selten in Axon-Leitstudien 2 ,3,4,5,6,7,8, 9 , 10, aufgrund technischer Nachteile. In-vitro-Axon-Leitlinien-Assays haben viele Nachteile11. Co-Kultur-Assays, bei denen neuronale Explanten zusammen mit Explanten des Zielgewebes12 oder transfizierter Zellen13kultiviert werden, hängen sowohl von der Symmetrie des Explantations- als auch der präzisen Positionierung zwischen Explantation und Zielgewebe ab. Streifenassays14,15, in denen zwei Hinweise in abwechselnden Streifen und Axonen auf bevorzugtes Wachstum auf einem Streifen festgelegt sind, deuten nur darauf hin, dass ein Substrat dem anderen vorzuziehen ist, nicht, dass beide attraktiv sind. abstoßend oder physiologisch relevant. Mikrofluidikkammern können präzise chemische Gradienten bilden, aber wachsende Axone der Scherspannung16,17,18, unterziehen, die ihr Wachstum beeinflussen können. Darüber hinaus erfordert das Sammeln von Explanten oder dissoziierten Zellen bei jedem dieser Ansätze, dass auswachsende Axone axotomisiert werden, und daher untersuchen diese Assays tatsächlich die Axonregeneration und nicht das anfängliche Axonwachstum. Schließlich entfernen diese In-vitro-Ansätze die Mikroumgebung, die Axone und ihre Reaktionen auf Hinweise entlang verschiedener Punkte ihres Kurses beeinflusst, und testen traditionell nur einen Hinweis isoliert. Zusammen mit diesen Nachteilen stellt die geringe Größe jedes Kerns im Augenmotorsystem die Zerlegung für Explanten oder dissoziierte Kulturen technisch eine Herausforderung dar. Darüber hinaus sind Primärkulturen von okularen motorischen Neuronen in der Regel heterogen, haben einen signifikanten Zelltod und sind dichteabhängig, was eine Zusammenlegung von Zellen aus mehreren Embryonen erfordert (Ryosuki Fujiki, persönliche Kommunikation). In-vivo-Methoden, einschließlich Knockout-Maus-Modelle, sind jedoch angesichts der Zeit und des Erforderlichen für das Screening ungeeignet für das Screening.
Methoden, die entwickelt wurden, um ganze Embryonen zu kultivieren19 ermöglichen die Kennzeichnung von wandernden Zellen20 oder die Blockade bestimmter Moleküle21, aber ganze Embryokulturen erfordern eine Inkubation in Rollenflaschen, was eine Echtzeit-Bildgebung von markierten Strukturen. Chirurgische Techniken, die eine Manipulation des Embryos und anschließende Weiterentwicklung entweder in der Gebärmutter oder im Bauch der Mutter (Aufrechterhaltung der Plazentaverbindung)22 ermöglichen, erlauben aber auch keinen Zeitraffer Imaging.
Um die Hindernisse von In-vitro-Assays zu überwinden und ein schnelles Screening von Signalwegen zu ermöglichen, wurde eine ex vivo embryonale Scheibenkulturtechnik entwickelt23, angepasst an ein zuvor veröffentlichtes Protokoll für peripheres Nervenwachstum24. Mit diesem Protokoll kann der sich entwickelnde okulomotorische Nerv im Laufe der Zeit in Gegenwart vieler der umgebenden Strukturen entlang seiner Flugbahn abgebildet werden, einschließlich EOM-Ziele. Durch Hinzufügen kleiner Molekülinhibitoren, Wachstumsfaktoren oder Leitfäden zu den Kulturmedien können wir Die Orientierungsstörungen an mehreren Punkten entlang des Axonverlaufs bewerten und so eine schnellere Bewertung potenzieller Wachstums- und Orientierungsfaktoren ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>24-Well-Gewebekulturplatte</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Gewebekulturplatte</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Pasteurpipette (Flintglas)</td><td>VWR</td><td>14672-200</td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11412-11</td><td></td></tr><tr><td>Fluorobrit</td><td>DMEM Thermo</td><td>Fisher Scientific A1896701</td><td></td></tr><tr><td>Glukose (200 g/L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (1X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550H</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Pufferlösung (1M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin (250 nM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Loctite Sekundenkleber</td><td>Loctite</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Millicell Zellkultureinsatz (30 mm, hydrophiles PTFE, 0,4 μm)</td><td>Millipore Sigma</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Moria Mini Perforierter Löffel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-19</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 15140122&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale (100 x 15mm)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-107G</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1X, pH 7,4)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklingen</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schere - Blunt</td><td>Fine Science Tools</td><td>14000-12</td><td></td></tr><tr><td>Ti Eclipse Perfect Focus mit TIRF</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome (VT 1200S)</td><td>Leica</td><td>1491200S001</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome Klingen (Doppelkante, Edelstahl)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>Nr. 121-6</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo okulomotor slice culture von embryonalen gfp-ausdrückenden mäusen für time-lapse imaging of oculomotor nerve outgrowth

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Genaue Augenbewegungen sind entscheidend für das Sehen, aber die Entwicklung des Okularmotoriksystems, insbesondere der molekularen Bahnen, die die Axonführung steuern, wurde noch nicht vollständig aufgeklärt. Dies ist zum Teil auf die technischen Einschränkungen traditioneller Axon-Leitfaden-Assays zurückzuführen. Um zusätzliche Axon-Leitlinien zu identifizieren, die den okulomotorischen Nerv beeinflussen, wurde ein ex vivo-Slice-Assay entwickelt, um den okulomotorischen Nerv in Echtzeit abzubilden, während er zum Auge heranwächst. E10.5 IslMN-GFP-Embryonen werden verwendet, um ex vivo Scheiben zu erzeugen, indem sie in Agarose eingebettet werden, auf ein Vibratome schneiden und sie dann in einem Mikroskop-Bühnen-Top-Inkubator mit Zeitraffer-Photomikroskopie für 24-72 h anbauen. das in vivo Timing des Auswachsens von Axonen vom Kern in die Umlaufbahn. Kleine Molekülinhibitoren oder rekombinante Proteine können den Kulturmedien hinzugefügt werden, um die Rolle verschiedener Axon-Führungswege zu bewerten. Diese Methode hat die Vorteile, mehr von der lokalen Mikroumgebung zu erhalten, durch die Axone durchqueren, nicht die wachsenden Axone axotomisieren und die Axone an mehreren Punkten entlang ihrer Flugbahn bewerten. Es kann auch Effekte auf bestimmte Teilmengen von Axonen identifizieren. Zum Beispiel führt die Hemmung von CXCR4 dazu, dass Axone, die sich noch innerhalb des Mittelhirns befinden, eher dorsal als ventral wachsen, aber Axone, die bereits ventral ausgetreten sind, sind nicht betroffen.

Normale Ergebnisse: Abbildung 1 enthält einen Schaltplan des Experiments. Bereits ab E9.5 in der Maus beginnen die ersten Axone aus dem okulomotorischen Kern26hervorzugehen. Bei E10.5 ist im Mesenchym ein fascikulierter okulomotorischer Nerv zu sehen, der die frühen Pionierneuronen enthält. Es gibt erhebliche Variabilität zwischen Embryonen bei E10.5 (auch innerhalb desselben Wurfs), wie weit der Nerv in Richtung der Umlaufbahn fortgeschritten ist, wahrscheinlich aufg...

Ein ex vivo Slice-Assay ermöglicht es, das okulomotorische Nervenwachstum in Echtzeit abzubilden. Die Scheiben werden durch Einbetten von E10.5 Isl MN:GFP-Embryonen in Agarose erzeugt, auf einem Vibram geschnitten und in einem Bühnen-Top-Inkubator wachsen. Die Rolle der Axon-Beratungswege wird durch Dieminadien zu den Kulturmedien bewertet.

Ex Vivo Okulomotor Slice Culture von embryonalen GFP-ausdrückenden Mäusen für Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

Dieses Protokoll ermöglicht es uns, Axon-Führungswege zu identifizieren, die im okulomotorischen Nerv aktiv sind, und ihre Rollen an verschiedenen Punkten entlang der Nervenbahn in Echtzeit zu bewerten. Diese Technik bewahrt die lokalen Umgebungen, durch die Axone reisen, und ihre endgültigen Ziele. Die wachsenden Axone werden nicht geschnitten, so dass das anfängliche Axonwachstum statt der Regeneration beurteilt werden kann.Diese Methode bietet Einblicke in die Axonführung im Augenmotorsystem, könnte aber an die Untersuchung der Axonführung anderer Nerven angepasst werden. Diese Technik erfordert Übung zu meistern, und schnelles Arbeiten ist extrem wichtig. Wenn Sie es zum ersten Mal versuchen, verwenden Sie nur ein paar Embryonen, anstatt einen ganzen Wurf.Vor Beginn des Eingriffs bestätigen Sie zunächst die Schwangerschaft durch Ultraschall am embryonalen Tag 10.5 aus einer zeitgesteuerten Paarung. Ernten Sie die Embryonen, sprühen Sie den Bauch der schwangeren Maus mit 70% Ethanol, und verwenden Sie eine Schere, um die Bauchhöhle zu öffnen, um die Gebärmutter zu extrahieren. Waschen Sie die Gebärmutter in einer Petrischale eiskalter HBSS, bevor Sie die Orgel in eine zweite Pet

ex-vivo-oculomotor-slice-culture-from-embryonic-gfp-expressing-mice

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir präsentieren eine Methode zur organotypischen Schnitten der Mitte der Schwangerschaft Maus-Embryonen für die Kultivierung und Zeitraffer-Bildgebung von peripheren Nerven Auswuchs vorzubereiten.

Organotypischen Kultur der GFP-exprimierenden Maus Embryonen für Real-time Imaging der peripheren Nerven Outgrowth

Dieses Protokoll beschreibt eine organotypischen Slice-Assay für die postnatale Gehirn und hochauflösenden Zeitraffer-Bildgebung von Neuroblasten Migration in der rostralen wandernde Stream optimiert.

Ein organotypischen Assay für High-Resolution Time-Lapse Imaging neuronaler Migration in der postnatalen Gehirn

Hier entwickeln wir die notwendigen Werkzeuge...

Ex vivo Live-Imaging von Single Cell Divisionen in Maus Neuroepithel

Das Video zeigt die Isolierung von okulomotorischen, trochleären und spinalen Motoneuronen aus einem transgenen Mausembryo. Der Embryo exprimiert Motoneuronen, die zur einfachen Visualisierung und Identifizierung mit einem grün fluoreszierenden Protein (GFP) markiert sind. Die Motoneuronen werden chirurgisch unter einem Fluoreszenzmikroskop isoliert und in einem Kulturmedium aufbewahrt.

Isolierung und Kultur von okulomotorischen, trochleären und spinalen Motoneuronen aus einem Mausembryo

Dieses Video zeigt die ex vivo Kultur und Bildgebung von okulomotorischen Schnitten aus transgenen Mausembryonen. Die Embryonen werden isoliert und in Agarose eingebettet. Mit Hilfe eines Vibratoms werden Scheiben erhalten, die die okulomotorischen Kerne und Augen enthalten. Die Scheiben werden in Kultur aufbewahrt und mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet.

Ex-vivo-Kultur und Bildgebung von okulomotorischen Schnitten aus transgenen Mausembryonen

Quelle: Wiegreffe, C., et. al.,  Konfokale Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen in der organotypischen Schnittkultur des embryonalen Mausgehirns unter Verwendung von In utero{ Elektroporation. {{}}J. Vis. Exp.{{TAG_ 44}} (2017) Dieses Video zeigt die konfokale Zeitraffermikroskopie, um die radiale Migration kortikaler Neuronen von der subventrikulären Zone zur kortikalen Platte über radiale Gliagerüste in transduzierten embryonalen Hirnschnitten der Maus zu beobachten.

Zeitraffer-Bildgebung der radialen Migration kortikaler Neuronen in transduzierten embryonalen Hirnschnitten von Mäusen

Eine Technik zur Untersuchung von NG2-Zellen und Oligodendrozyten unter Verwendung eines Schnittkultursystems des Vorderhirns und des Kleinhirns wird beschrieben.  Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Dynamik der Proliferation und Differenzierung von Zellen innerhalb der Oligodendrozytenlinie, bei der die extrazelluläre Umgebung leicht manipuliert werden kann, während die Zytoarchitektur des Gewebes erhalten bleibt.

Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

Dieses Protokoll enthält Anweisungen für die direkte Beobachtung von radial migrierenden kortikalen Neuronen. In der utero- Elektroporation werden die organotypische Scheibenkultur und die konjunkturelle Bilddarstellung kombiniert, um die Effekte der Überexpression oder der Abregulation von Genen von Interesse bei der Migration von Neuronen direkt und dynamisch zu untersuchen und ihre Differenzierung während der Entwicklung zu analysieren.

Zeitraffer-konfokale Bildgebung der Migration von Neuronen in der organotypischen Scheibe Kultur der embryonalen Maus Gehirn mit<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation

Hier bieten wir eine kostengünstige und zuverlässige Methode um elektroporiert Gehirn organotypischen Slice Kulturen von mäuseembryonen geeignet für konfokale Mikroskopie und Leben-bildgebende Verfahren zu generieren.

Ex Utero Elektroporation und organotypischen Slice Kulturen der embryonalen Mäusegehirnen für Live-Aufnahmen von Migration Gabaergen Interneuronen

Dieses Protokoll demonstriert eine einfache und robuste Methode zur Untersuchung des In-situ-Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik. Es beschreibt, wie ex vivo physiologisch relevante akute Hirnschnitte hergestellt werden können und stellt eine benutzerfreundliche Analysepipeline zur Verfügung.

In situ Visualisierung des Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik in akuten ex vivo embryonalen Hirnschnittkulturen

Während der Entwicklung der Großhirnrinde stammen Neuronen und Gliazellen aus der ventrikulären Zone, die den Ventrikel auskleidet, und wandern zur Gehirnoberfläche. Viele Gene sind an diesem Prozess beteiligt. Dieses Protokoll stellt die Technik für die Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen vor.

Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen in embryonalen Hirnschnitten von Mäusen

Erfahren Sie die ex vivo Okulomotor-Schnittkulturmethode zur Echtzeitbildgebung von Axonwachstum in embryonalen GFP-Mäusen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Axonleitungsmechanismen im okulomotorischen System.

Ex Vivo Okulomotor Slice Culture von embryonalen GFP-ausdrückenden Mäusen für Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

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