Name: Probenvorbereitung für Probe Elektrospray-Ionen-Massenspektrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Erfahren Sie die Probenvorbereitung für PESI-MS zur Analyse biologischer Gewebe in vivo und in vitro. Diese Methode ermöglicht schnelle Analysen ohne aufwändige Vorbehandlung und minimiert den Verlust biologischer Komponenten.

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Wir danken Ayumi Iizuka für den Betrieb der PESI-MS und Kazuko Sawa-nobori für ihre Sekretariatsunterstützung. Wir danken Bronwen Gardner, Ph.D., von der Edanz Group (www.edanzediting.com/ac) für die Bearbeitung eines Entwurfs dieses Manuskripts.

Der institutionelle Ausschuss für Tierpflege an der Universität Yamanashi genehmigte alle hier genannten Protokolle und die Verwendung von Versuchstieren. Die Verwendung menschlicher Proben wurde von der institutionellen Ethikkommission der Universität Yamanashi genehmigt.
1. Feststoffpräparation
HINWEIS: Proben müssen nach ihrer Entfernung aus dem tierischen oder menschlichen Körper auf Eis gehalten werden, um die Frische des Gewebes zu erhalten. Wenn die Messungen nicht sofort der Zerlegung folgen, wird empfohlen, Gewebe bei -80 °C zu lagern. Es ist nicht ratsam, das Gewebe in irgendeiner Art von Puffer oder Saline zu platzieren, weil sie bestimmte Inhalte aus dem Gewebe extrahieren können. Gewebe, das mit Aldehyden fixiert oder in Paraffin/Wachs oder Kryogel eingebettet wurde, ist für MS-Messungen nicht geeignet.
<ol><li>Schneiden Sie die Gewebeprobe mit einem Skalpell oder Messer auf ca. 2 x 2 x 2 mm. Alternativ können Sie die Probe mit einem Trepan (ein Einweg-Biopsie-Punch, Bohrungsgröße 3 mm) für die Hautuntersuchung ausstechen. Trimmen Sie in diesem Fall die Länge der Säule auf 2 mm. HINWEIS: Jedes Gewebe kann mit dieser Methode analysiert werden. In diesem Experiment wurden Leber15 und Niere19erfolgreich analysiert, um Massenspektren zu erhalten. Im Allgemeinen geben parenchymale Organe gute Massenspektren, während solche, die faserige Komponenten haben, dies nicht tun.</li>
	<li>Wenn das Gewebe mit Blut kontaminiert ist, kurz mit eiskalter Phosphat-gepufferter Saline waschen. HINWEIS: Um die postmortalen Gewebeschäden zu minimieren, führen Sie diesen Schritt so schnell wie möglich bei Raumtemperatur durch. Wenn die Messungen nicht sofort durchgeführt werden, fangen Sie das Gewebe in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie es bei -80 °C.</li>
	<li>Die geschnittene oder ausgestanzte Probe (ca. 10 mg) in ein Kunststoff-Mikrorohr geben und 100 l 50% Ethanol hinzufügen. HINWEIS: Das genaue Gewicht der Proben wird nicht bestimmt, da die in diesem System verwendete Massenspektrometrie keine quantitativen Daten liefert. Ungefähr 10 mg ist optimal für das parenchymale Gewebe.</li>
	<li>Homogenisieren Sie die Probe mit einem Mikroschädling.</li>
	<li>Legen Sie 10 l des Homogenats in den Brunnen der Patrone(Abbildung 2).</li>
	<li>Legen Sie die Patrone in die Ionisationskammer des Massenspektrometers und installieren Sie die Nadelsonde aus Edelstahl, die für die Probenionisierung verwendet wird (Abbildung 2). HINWEIS: Sondennadeln werden vom Hersteller geliefert. Sie sind aus Edelstahl gefertigt und haben einen Krümmungsradius von ca. 400 nm.</li>
	<li>Schließen Sie den Kammerdeckel fest, um die Sicherheitsvorrichtung automatisch zu aktivieren.</li>
	<li>Starten Sie den Bordcomputer, indem Sie auf das Symbol Start klicken, um dies zu analysieren. Wenden Sie mit hilfe der Bildschirmpanels eine Spannung von 2,3 kV auf die Nadel an, um das Elektrospray zu erzeugen und sicherzustellen, dass die Nadelfrequenz 3 Hz beträgt.</li>
	<li>Warten Sie 30 s, bis die Messung abgeschlossen ist. HINWEIS: Die Sitzung wird automatisch beendet, wenn die Datenerfassung abgeschlossen ist. Die Qualität der Analyse wird durch ein Gesamtionenchromatogramm (TIC) überwacht. Die Messzeit wird definiert, um die repräsentativen Massenspektren zu erhalten und kann verkürzt oder verlängert werden.</li>
	<li>Entsorgen Sie die Patrone und die Nadel nach der Messung jeder Probe in einem Biogefährdungs-Entsorger. HINWEIS: Es kann jeweils nur eine Probe gemessen werden. Es ist nicht notwendig, die Maschine vor jeder Messung zu kalibrieren; Die Kalibrierung hängt von der regelmäßigen Kontrolle durch den Lieferanten einmal alle sechs Monate ab.</li>
	<li>Analysieren Sie die Massenspektren und exportieren Sie die Massenspektraltextdaten mithilfe der Software, die dem Massenspektrometer zugeordnet ist (siehe Materialtabelle), wie in den schritten unten angegeben (Abbildung 3).<ol>
<li>Klicken Sie auf die LCD-Datei im Browserfenster der Datendatei der Software.</li>
		<li>Wählen und klicken Sie auf eine einzelne Spitze im Massenspektrumfenster und stellen Sie automatisch ein extrahiertes Ionenchromatogramm (EIC) dar.</li>
		<li>Überprüfen Sie das TIC und EIC und klicken Sie auf das Symbol für das durchschnittliche Spektrum, um das Bereichsfenster für die Erzeugung des Massenspektrums auszuwählen. ANMERKUNG: In dieser Analyse erscheinen die Zielmoleküle im Massen-Zu-Lade-Verhältnis (m/z)(Abbildung 3). Da die Dauer der Ionisation pro einzelnen Nadelstich sehr kurz ist, sind alle erhaltenen Massenspektren im Wesentlichen gemittelte Spektren über 10 s (300 Scans).</li>
		<li>Generieren Sie eine Textdatei mit m/z- und Ionenintensität, indem Sie zur weiteren Analyse auf die Registerkarte Exportieren klicken. Diese Textdatei kann in jedem Ordner gespeichert werden. HINWEIS: Alle RNA-Konservierungsstoffe wirken sich auf das native Spektralmuster von Proben aus. Darüber hinaus ist es ratsam, Gewebe ohne Flüssigkeit (z. B. phosphatgepufferte Kochsaline) zu handhaben und zu lagern, um die Ausscheidung molekularer Komponenten aus dem Gewebe in die Flüssigkeit während der Lagerung zu verhindern. Im Idealfall werden frische oder frisch gefrorene Proben ohne Jegliche Behandlung verwendet.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Körperflüssigkeiten (Serum) Vorbereitung
HINWEIS: Dieses ganze Verfahren ist fast identisch mit dem, das für Festgewebe verwendet wird. Die Patrone für die Flüssigkeitsprobe ist beim Hersteller erhältlich. Da die Kontamination durch rote Blutkörperchen (RBCs) die Effizienz der spektralen Erfassung der beabsichtigten Komponente (Plasma oder Serum) stark verringern kann, sollten Sie alle RBCs durch Zentrifugieren vor Messungen eliminieren.
<ol><li>Nehmen Sie 10 l der Serumprobe und geben Sie sie in ein 1,5 ml Mikrorohr. HINWEIS: Sowohl frisches als auch gespeichertes Serum kann verwendet werden.</li>
	<li>Fügen Sie dem 1,5 ml-Rohr 190 l 50 % Ethanol hinzu, dann wirbeln Sie 2 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Flüssigkeit bei 15.000 x g für 1-5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Übertragen Sie 10 L Überstand in den Brunnen der Patrone.</li>
	<li>Legen Sie die Patrone in die Ionisationskammer der Maschine und installieren Sie die Edelstahl-Nadelsonde, die für die Probenionisierung verwendet wird (Abbildung 2).</li>
	<li>Schließen Sie den Kammerdeckel fest, um die Sicherheitsvorrichtung automatisch zu aktivieren.</li>
	<li>Starten Sie den Bordcomputer, indem Sie auf das Startsymbol klicken, um zu ionisieren.</li>
	<li>Entsorgen Sie die Probenpatrone und die Nadel, wie in 1.10 beschrieben, sobald die Messungen durchgeführt wurden.</li>
	<li>Analysieren Sie die erhaltenen EIC-Sätze, wie unten angegeben (Abbildung 3).<ol>
<li>Öffnen Sie die LCD-Datei im Datenbrowser.</li>
		<li>Klicken Sie auf eine einzelne Spitze, um das TIC und EIC anzuzeigen.</li>
		<li>Wählen Sie das Bereichsfenster zum Generieren von Massenspektren mithilfe des Symbols für das mittlere Spektrum aus.</li>
		<li>Exportieren Sie die generierte Datei, die sowohl die m/z- als auch die Ionenintensität eines entsprechenden Peaks enthält, indem Sie auf die Registerkarte Export auf dem Monitor klicken. HINWEIS: Dieses Verfahren kann auch auf Speichel, Urin und andere Körperflüssigkeiten angewendet werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Vorbereitung auf in vivo PESI-MS in lebenden Organismen
HINWEIS: In diesem Abschnitt wird eine Anwendung zur Überwachung des metabolischen Profils von 5-Fluor-2'-Deoxyuridin (5-FdU) in einem lebenden Mausmodell eingeführt. Verwenden Sie aseptische Bedingungen durchgängig.
<ol><li>100 l von 100 mM 5-FdU-Lösung in die Schwanzvene einer 2 Monate alten Maus (ca. 20 g Gewicht) einfließen. HINWEIS: Es gibt keine Präferenz für Geschlecht, Alter oder Maus-Stamm. Während dieses Protokoll zum Zeitpunkt der Durchführung des Experiments5genehmigt wurde, hängt die Durchführbarkeit dieses Experiments von den ethischen Beschränkungen des Landes ab, in dem es durchgeführt wird.</li>
	<li>Anästhesisieren Sie die Maus nach Ihrem genehmigten Tierpflegeprotokoll. Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie durch die fehlende Reaktion auf Schwanzkneifen. HINWEIS: Wenn die Verwendung von Natriumpentobarbital von der Ethikkommission für Tierversuche nicht gestattet ist, können alternative Methoden wie Ketaminhydrochlorid verwendet werden.</li>
	<li>Rasieren Sie die Bauchhöhle mit einem elektrischen Rasiermesser und wenden Sie Tierarzt Salbe auf die Augen.</li>
	<li>Setzen Sie die anästhesierte Maus in eine Supine-Position und fixieren Sie die Pfoten auf der Kunststoffplatte mit Mending Tape. Schrubben Sie die chirurgische Stelle mit Peelings von 70% Alkohol dreimal.</li>
	<li>Die Bauchhöhle mit einer Schere aufschneiden. Schneiden Sie zunächst die Haut seitlich (10 mm) von knapp über der Membran. Seitlich schneiden Sie den Muskel der Bauchkörperwand und Peritoneum (ca. 7 mm) und halten Sie die Wunde mit Edelstahldraht offen, um die Leberoberfläche freizulegen. HINWEIS: Es besteht keine Notwendigkeit, die Oberfläche der Leber zu durchdringen.</li>
	<li>Tragen Sie die Spitze der Sondennadel auf die Leberoberfläche auf. Stellen Sie die Nadeltiefe auf ca. 0,5 mm tiefe Position ein, um die Ionisierungseffizienz zu optimieren und das TIC- und Spektralmuster gleichzeitig zu überprüfen. Stellen Sie die Hochspannung auf 2,3 kV und die Frequenz auf 3 Hz auf dem Bildschirm des Bedienfelds ein.</li>
	<li>Entfernen Sie das Tier von der Kunststoffplatte.</li>
	<li>Besinnen Sie die Wunde mit einer chirurgischen Darmnaht und bringen Sie die Maus in den Käfig zurück. Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt, bis sie das Bewusstsein wiedererlangt hat, um die Brustbesinnung aufrechtzuerhalten. Geben Sie die Maus nicht an die Gesellschaft anderer Tiere zurück, bis sie vollständig erholt ist.</li>
	<li>Führen Sie den Zeitlichen Kurs der Ionenintensität in EIC und das Verfahren der EIC-Darstellung wie in 1.11.1 bis 1.11.4 durch.</li>
</ol>

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</ol>

Der entsprechende Autor wurde von Shimadzu, einem Hersteller und Lieferanten von PESI-MS-Instrumenten, finanziert.

Obwohl PESI ein Derivat von ESI für die Massenspektrometrie4ist, ist es am vorteilhaftesten für die Überwachung von Echtzeit-Metabolomik, sowie für die Analyse biochemischer Reaktionen, ohne komplexe oder zeitaufwändige Vorbehandlungendurchzuführen 5,14,15,17. Es ist eine einfache und sofortige Massenspektrometrie-Technik, die auf den integrierten Zustand lebender Organi...

Massenspektrometrie (MS) ist eine technologische Erkenntnis des Reduktionismus; es reduziert das Analyseobjekt auf eine Einheit, die auf der Grundlage molekularer Arten oder Kaskaden interpretiert werden kann. Daher ist es eine repräsentative Methode der analytischen Chemie. Es besteht aus vier Prozessen: Ionisierung, Analyse, Detektion und spektrale Erfassung. Da die Ionisierung des Moleküls der erste Prozess in der Massenspektrometrie ist, schränkt es in der Regel die Form der zu verarbeitenden Analyten ein. Die meisten Ionisationsverfahren erfordern die Zerstörung der Struktur, Morphologie und echtzeitbiologischen Prozesse von organischen Proben. Beispielsweise erfordert die Elektrospray-Ionisation (ESI) MS, dass sich die Proben für eine effiziente Ionisierung in einem flüssigen Zustand befinden1. Proben müssen daher eine komplexe biochemische Zubereitung durchlaufen, die die Zusammensetzung von Molekülen verändert. Während die matrixgestützte Laserdesorptionsionisierung (MALDI) MS molekulare Karten von dünnem Schnittgeweberekonstruieren kann,istdieIonisationseffizienz zu gering, um alle Moleküle in den Proben zu erkennen, und es ist besonders schlecht bei der Analyse von Fettsäuren. Unter Berücksichtigung dieser Einschränkungen kann die Sondenelektrospray-Ionisation (PESI)4 verwendet werden, um die Echtzeit-Änderungen in biologischen Systemen in situ zu beobachten, ohne die strukturelle Integrität zu zerstören5, während sich der beobachtete biologische Organismus technisch in einem lebendigen Zustand befindet. In diesem Fall wird eine sehr feine Nadel verwendet, die gleichzeitig als Probenpflücker und Ionenemitter dient. Dies bedeutet, dass die komplexen Probenvorbehandlungssequenzen umgangen werden können, um Massenspektren zu erhalten, die die molekularen Komponenten des lebenden Systems in situ widerspiegeln.
Es gibt mehrere andere Ionisationsmethoden, die PESI-MS Konkurrenz machen. Eine davon ist die schnelle Verdunstungsionisationsmassenspektrometrie (REIMS)6. Diese Technik funktioniert gut während der Operation, weil sie mit einem elektrischen Messer montiert wird und die Ionenfahne sammelt, die während des Schnittes erzeugt wird. Während REIMS sehr nützlich für die Operation ist, ist es im Wesentlichen eine destruktive Methode, die die elektrische Ablation des Gewebes erfordert. Daher ist es nicht nützlich für die detaillierte Analyse von Zellen und Geweben in einer präparativen Probe oder in Laboranalysen. Darüber hinaus, weil es eine große Menge an Pflaumen sammelt, die Gewebeablagerungen enthalten, erfordert es eine lange Wartung der Geräte nach jedem Gebrauch, wodurch die Verwendung dieser Maschine auf spezielle chirurgische Verfahren beschränkt wird. Eine ähnliche Methode, die laserdesorptionionistionionization mass spectrometry (LDI-MS)7genannt wird, ist eine andere Technik, die nicht invasiv und nützlich für die Oberflächenanalyse ist. Da diese Technik gut beim Scannen der Oberfläche einer Probe ist, erreicht sie eine umfassende zweidimensionale Analyse wie die MALDI-Bildmassenspektrometrie8,9. Da LDI-MS jedoch nur auf die Oberflächenanalyse anwendbar ist, ist PESI-MS vorteilhaft für die Analyse der Proben z.B. innerhalb des Gewebes. Eine andere Technik, der MasSpec Pen10, wurde berichtet, um eine hohe Spezifität und Empfindlichkeit bei der Diagnose von Schilddrüsenkrebs zu erreichen, aber der Durchmesser der Sonde ist in der Größenordnung von mm und es ist spezifisch für die Oberflächenanalyse, was bedeutet, dass es nicht erkennen kann, kleine Knötchen von Krebs oder tief lokalisierte Läsionen. Da bei dieser Methode ein im Sondenstift eingebetteter Mikrokapillar-Durchflusskanal verwendet wird, muss die Kreuzkontamination, ähnlich wie Beil-MS, berücksichtigt werden. Es gibt andere Techniken, die auf klinische Umgebungen angewendet wurden, wie die Durchflusssonde und die Ionisationsform Tupfer11, aber sie sind nicht weit verbreitet.
PESI ist die extreme Miniaturisierung von ESI, wobei die Kapillare des Nanoelektrosprays auf einer festen Nadel mit einem Spitzenkrümmungsradius von mehreren hundert nm konvergiert. Die Ionisation erfolgt im extrem eingeschränkten Bereich der Nadelspitze durch Bildung eines Taylor-Kegels, auf dem Proben verbleiben, bis die Ionisierung der gesamten Flüssigkeit auf der Spitze abgeschlossen ist12. Bleibt der Analyt an der Spitze der Metallnadel, wird an der Schnittstelle zwischen metallener Nadel und den Analyten kontinuierlich eine Überladung erzeugt. Daher erfolgt die sequentielle Ionisierung von Molekülen in Abhängigkeit von ihrer Oberflächenaktivität. Diese Eigenschaft macht die Nadelspitze zu einer Art Chromatogramm, das die Analyten je nach Oberflächenaktivität trennt. Technisch gesehen kommen Moleküle mit der stärkeren Oberflächenaktivität an die Oberfläche des Taylor-Kegels und werden früher ionisiert als Moleküle mit schwächerer Oberflächenaktivität, die bis zum Ende des Ionisationsprozesses an der Oberfläche der Nadel haften. So wird eine vollständige Ionisierung aller Moleküle erreicht, die von der Nadel aufgenommen werden13. Da diese Technik nicht die Zugabe von überflüssigem Lösungsmittel in die Probe beinhaltet, reichen mehrere hundert Femtoliter aus, um Massenspektren stark genug für weitere Analysen zu erhalten14. Diese Eigenschaften sind vorteilhaft für die Analyse intakter biologischer Proben. Ein großer Nachteil von PESI-MS liegt jedoch in der Diskontinuität bei der Ionisierung aufgrund der Hubbewegung der Nadel entlang der vertikalen Achse, ähnlich einer Sägemaschine. Die Ionisierung findet nur statt, wenn die Spitze der Sonde den höchsten Punkt erreicht, wenn die Höhe der Ionenöffnung an der horizontalen Achse ausgerichtet ist. Die Ionisierung hört auf, während die Nadel Proben aufnimmt, und so ist die Stabilität der Ionisierung nicht gleich der des konventionellen ESI. Daher ist PESI-MS keine ideale Methode für Proteomik.
Bislang wurde PESI-MS hauptsächlich auf die Analyse biologischer Systeme angewandt, die ein breites Spektrum von Bereichen von der Grundlagenforschung bis hin zu klinischen Umgebungen abdecken. Zum Beispiel konnte die direkte Analyse des menschlichen Gewebes, das während der Operation vorbereitet wurde, die Ansammlung von Triacylglycerol sowohl bei Nierenzellkarzinom15 als auch bei Pharyngeal-Plattenkarzinom16aufdecken. Diese Methode kann auch flüssige Proben messen, wie Blut, um sich auf das Lipidprofil zu konzentrieren. Zum Beispiel wurden einige Moleküle während der Ernährungsumstellung bei Kaninchen abgegrenzt; Es wurde berichtet, dass einige dieser Moleküle in sehr frühen Stadien der Experimente abnahmen, was auf die hohe Empfindlichkeit und Nützlichkeit dieses Systems für die klinische Diagnose17hindeutet. Darüber hinaus ermöglichte die direkte Anwendung auf ein lebendes Tier den Nachweis biochemischer Veränderungen der Leber nach nur einer Fastennacht5. Zaitsu et al.18 besuchten dieses Experiment5 und analysierten die Stoffwechselprofile der Leber fast auf die gleiche Weise, mit Ergebnissen, die die Stabilität und Reproduzierbarkeit unserer ursprünglichen Methode verstärkten. Darüber hinaus konnten wir das Krebsgewebe aus der umgebenden nicht-kanzerösen Leber bei Mäusen mit dieser Technik unterscheiden19. Daher ist dies eine vielseitige Massenspektrometrie-Technik, die in verschiedenen Umgebungen nützlich ist, sowohl in vivo als auch in vitro. Aus einem anderen Blickwinkel kann das PESI-Modul durch Einstellen der Montagebefestigung für verschiedene Massenspektrometer geeignet werden. In diesem kurzen Artikel stellen wir die Grundlagen und Beispiele von Anwendungen vor (Abbildung 1), einschließlich Anwendungen mit lebenden Tieren5.
Gemäß den Vorschriften und Gesetzen in jedem Land müssen Teile dieses Protokolls überarbeitet werden, um die Kriterien der einzelnen Institutionen zu erfüllen. Die Anwendung auf den lebenden Organismus ist die interessanteste und herausforderndste, weil es biochemische oder metabolische Veränderungen in Geweben oder Organen bei lebenden Tieren in situ liefern kann. Während dieser Antrag vom institutionellen Ausschuss für Tierpflege an der Universität Yamanashi genehmigt wurde, wird 20135eine weitere Genehmigungsrunde notwendig sein, da die Vorschriften für die Tierversuche kürzlich geändert wurden. Daher sind mehrere Änderungen des Versuchsschemas ratsam. In Bezug auf die in Experimenten gewonnenen Massenspektren gibt es unter Berücksichtigung der Schwankungen der Massenspektren zwischen den einzelnen Messungen kein System für den Austausch spektraler Informationen, das der Nukleotid-Sequenzierungsgemeinschaft gemeinsam ist. Beim Umgang des Bedieners mit der Nadel ist vorsichtshalber, um Nadelstiche zu vermeiden, insbesondere beim Entfernen der Nadel aus dem Nadelhalter. Ein spezielles Gerät zum Lösen der Nadel ist sehr nützlich für diesen Zweck. Da es sich bei dem Fach des PESI-Moduls um eine luftdichte, geschlossene Kammer handelt, kommt es nicht zu Leckagen der Ionenfahne, wenn das Massenspektrometer gemäß den Anweisungen betrieben wird.

<table><tbody><tr><td>5-Fluor-2'-Desoxyuridin (5-FdU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8791-25MG</td><td>25mg</td></tr><tr><td>Einweg-Biposy-Stanze (Trepan)</td><td>kai Europa GmbH</td><td>BP-30F</td><td>Bohrungsgröße 3mm</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>nacalai tesque</td><td>14710-25</td><td>extra reines Reagenz</td></tr><tr><td>LabSolutions</td><td>Shimadzu</td><td></td><td>ver. 5.96, Datenanalysator</td></tr><tr><td>Mikrostößel</td><td>United Scientific Liefert</td><td>S13091</td><td></td></tr><tr><td>Mikroröhrchen</td><td>Treff</td><td>982855</td><td>0,5 mL klares</td></tr><tr><td>PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS)</td><td>Shimadzu</td><td>DPiMS-2020</td><td>Massenspektrometer ausgestattet mit PESI</td></tr><tr><td>PPGT Solition</td><td>Shimadzu</td><td>ND</td><td>Befestigt an DPiMS-2020</td></tr></tbody></table>

probenvorbereitung für probe elektrospray-ionen-massenspektrometrie

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Die Massenspektrometrie (MS) ist ein leistungsfähiges Werkzeug in der analytischen Chemie, da es sehr genaue Informationen über Moleküle liefert, wie Z. B. Massen-Zu-Ladungs-Verhältnisse (m/z), die nützlich sind, um Molekulargewichte und -strukturen abzuleiten. Obwohl es sich im Wesentlichen um eine destruktive Analysemethode handelt, haben uns die jüngsten Fortschritte in der Umgebungsionisationstechnik ermöglicht, Daten zu erfassen, während wir Gewebe in einem relativ intakten Zustand in Bezug auf Integrität zurücklassen. Die Probeelektrospray-Ionisation (PESI) ist eine sogenannte direkte Methode, da sie keine komplexe und zeitaufwändige Vorbehandlung von Proben erfordert. Eine feine Nadel dient als Probenpflücker sowie als Ionisationsemitter. Basierend auf der sehr scharfen und feinen Eigenschaft der Sondenspitze ist die Zerstörung der Proben minimal, so dass wir die molekularen Echtzeitinformationen aus Lebewesen vor Ort erfassen können. Hierin stellen wir drei Anwendungen der PESI-MS-Technik vor, die für die biomedizinische Forschung und Entwicklung nützlich sein werden. Zum einen geht es um die Anwendung auf Festgewebe, die die grundlegende Anwendung dieser Technik für die medizinische Diagnose ist. Da diese Technik erfordert nur 10 mg der Probe, Es kann sehr nützlich in der Routine klinischen Einstellungen sein. Die zweite Anwendung betrifft die in vitro medizinische Diagnostik, bei der menschliches Blutserum gemessen wird. Die Fähigkeit, Flüssigkeitsproben zu messen, ist auch in verschiedenen biologischen Experimenten wertvoll, bei denen ein ausreichendes Probenvolumen für herkömmliche Analysetechniken nicht vorgesehen werden kann. Die dritte Anwendung neigt zur direkten Anwendung von Sondennadeln bei lebenden Tieren, wo wir Echtzeit-Dynamik von Metaboliten oder Medikamenten in bestimmten Organen erhalten können. In jeder Anwendung können wir die Moleküle ableiten, die von MS nachgewiesen wurden, oder künstliche Intelligenz verwenden, um eine medizinische Diagnose zu erhalten.

Wie in Abbildung 3dargestellt, sind die durch PESI-MS-Technik erhaltenen Daten die Massenspektren, deren m/z-Bereich in diesem System zwischen 10 und 1.200 liegt. Während man Moleküle bis zu m/z 2.000 erkennen kann, gab es mit dieser Technik nur wenige Spitzen über den Massenbereich von m/z 1.200. Daher haben wir Spitzen wertet von m/z 10 bis 1.200. Es gab auffällige Spitzengruppen um m/z 800 und 900; Erstere stell...

In diesem Artikel werden Beispielvorbereitungsmethoden für eine einzigartige Echtzeitanalysemethode auf der Grundlage der Umgebungsmassenspektrometrie vorgestellt. Mit dieser Methode können wir die biologischen Moleküle in vivo in echtzeit ohne spezielle Vorbehandlungen analysieren.

Probenvorbereitung für Probe Elektrospray-Ionen-Massenspektrometrie

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Es handelt sich also um eine einzigartige Umgebungsmassenspektrometrie, die sich besonders für die Analyse biologischer Proben sowohl in vitro als auch in vivo eignet. Da dies keine regelmäßige Vorbehandlung von Proben wie Zellsortierung, Fraktionierung und Konzentration erfordert, kann es eine Probe mit minimalem Verlust biologischer Komponenten analysieren, insbesondere solche, die als sehr kleine Menge vorhanden sind. Mit dieser Technik können Sie die Rohgewebematerialien direkt in einer Minute durch Massenspektrometrie analysieren.Schnelligkeit ist unbehindert in der Robustheit des Systems, Hauptvorteile dieser Technik inhärent. Alles, was Sie tun müssen, ist nur Kieselsäure vorzubereiten, 10 Milligramm Gewebe Probe, und 10 Mikroliter von Vermehrung. Und legen Sie sie in Einwegpatrone.Es ist auf den PESI-MS-Computer eingestellt, und Sie erhalten das Ergebnis in wenigen Minuten. Wenn Sie das entsprechende Massenspektrometer auswählen, können Sie die molekulare Identität kommentieren. Um zu beginnen, holen Sie die Leber oder Nierengewebe aus dem Gefrierschrank.Schneiden Sie die Gewebeprobe auf einer Korkplatte mit einem Skalpell oder Messer auf etwa zwei mal zwei mal zwei Millimeter. Alternativ können Sie die Probe mit dem Trepan ausstechen und die Länge der Säule auf zwei Millimeter trimmen. Wenn das Gewebe mit Blut kontaminiert ist, kurz mit eiskalter Phosphat-gepufferter Saline waschen.Etwa 10 Milligramm der geschnittenen oder ausgestanzten Probe in ein Kunststoff-Mikrorohr geben und 100 Mikroliter 50% Ethanol hinzufügen. Verwenden Sie ein Mikroschädling, um die Probe zu homogenisieren. Dann mit dem Pipettenmann 10 Mikroliter des Homogenats in den Brunnen der Patrone des Massenspektrometers legen.Legen Sie die Patrone in die Ionisationskammer des Direct Probe Ionization Mass Spectrometer und installieren Sie die Edelstahl-Steal-Nadelsonde, die für die Probenionisierung verwendet wird. Schließen Sie den Kammerdeckel fest, um die Sicherheitsvorrichtung automatisch zu aktivieren. Starten Sie den Bordcomputer, indem Sie auf das Startsymbol klicken, um mithilfe der Bildschirmpanels eine Spannung von 2,3 Kilovolt auf die Nadel anzuwenden, um das Elektrospray zu erzeugen und sicherzustellen, dass die Frequenz der Nadel drei Hertz beträgt.Warten Sie 30 Sekunden, bis die Messung abgeschlossen ist. Nach der Messung jeder Probe die Patrone und die Nadel in einem Biogefährdungsdeerlader entsorgen. Um die Massenspektren zu analysieren, öffnen Sie die Software, die mit dem Massenspektrometer verknüpft ist.Klicken Sie im Browserfenster der Datendatei der Software auf die Datei L-C-D. Klicken Sie auf eine einzelne Spitze des Massenspektrumfensters und stellen Sie automatisch ein E-I-C dar. Überprüfen Sie die T-I-C und E-I-C, und klicken Sie auf das Symbol des durchschnittlichen Spektrums, um den Bereich des Zeitfensters für die Erzeugung des Massenspektrums auszuwählen.Exportieren Sie die Massenspektraltextdaten. Um Körperflüssigkeiten zu analysieren, ziehen Sie bis zu 10 Mikroliter der Serumprobe und geben Sie sie in ein 1,5 Milliliter Mikrotube. 190 Mikroliter 50% Ethanol in die Röhre geben und dann bei Raumtemperatur zwei Minuten wirbeln.Um alle roten Blutkörperchen zu eliminieren, zentrieren Sie die Flüssigkeit bei 15.000 Mal G für ein bis fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie 10 Mikroliter des Überstandes in den Brunnen der Patrone und messen Sie wie bisher das Massenspektrometer. Dieses Protokoll zeigt die Probenvorbereitung für PESI-MS bei festen Proben, flüssigen Proben und lebenden Tieren.Das karzinom der menschlichen Nierenzell zeigt charakteristische Spitzen neutraler Lipide. Es gab relativ starke Spitzen in den Spektren beim Massen-Zu-Ladungs-Verhältnis von 900 aus dem menschlichen Nierenzellkarzinomgewebe, die im umgebenden nicht-kanzerösen Gewebe nicht identifiziert wurden. Diese Spitzen stellen hauptsächlich Triacylglycerin dar.Beispiel für Daten, die in normalen Lebergeweben erfasst wurden, zeigten die neoplastische Läsion eines Patienten mit chronischer Hepatitis und Leberzirrhose. Humanes Serum von drei Individuen wurde mit PESI-MS analysiert, es gab deutliche Unterschiede in den Spektralmustern zwischen den Individuen. Für die metabolischen Veränderungen in 5-FdU, die intravenely in das Schwanzgefäß einer Maus injiziert wurden, wurde ein sehr schneller und empfindlicher Nachweis von 5-FdU mit Natriumaddukt in der Leber in situ erreicht.Da die Tiefe der Nadelspitze von der Stelle des Gewebes, spielt die wichtigste Rolle bei der Ionisierung, die die erfolgreiche Datenerfassung liest, stellen Sie sicher, die Anweisungen zu befolgen. Sie können die molekularen Arten identifizieren, indem Sie sich die kommerzielle Datenbank ansehen. Dies ist ein Weg, um den molekularen Mechanismus der Krankheit zu qualifizieren.Viele Forscher haben sich für die Anwendung dieser Technik für die Vorhersage des Wohlstands von Krankheiten und es ist Prognose interessiert. Vor allem mit Ricket Biopsie. Achten Sie einfach darauf, nicht von der Sondennadel gestochen zu werden.Dies kann einfach mit einem speziellen Instrument zum Entfernen der Nadel aus der Maschine vermieden werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Digitale Mikrofluidik ist eine Technik, durch die Manipulation von diskreten Tröpfchen (~ nL - mL) charakterisiert auf eine Reihe von Elektroden, die durch die Anwendung von elektrischen Feldern. Es ist für die Durchführung schnelle, sequentielle, miniaturisierte automatische biochemische Assays gut geeignet. Hier berichten wir über eine Plattform, die die Automatisierung von mehreren Proteom Verarbeitungsschritte.

Digitale Mikrofluidik für die automatisierte Verarbeitung Proteomic

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