Probenvorbereitung für Probe Elektrospray-Ionen-Massenspektrometrie
19. Februar 2020
In diesem Artikel werden Beispielvorbereitungsmethoden für eine einzigartige Echtzeitanalysemethode auf der Grundlage der Umgebungsmassenspektrometrie vorgestellt. Mit dieser Methode können wir die biologischen Moleküle in vivo in echtzeit ohne spezielle Vorbehandlungen analysieren.
Es handelt sich also um eine einzigartige Umgebungsmassenspektrometrie, die sich besonders für die Analyse biologischer Proben sowohl in vitro als auch in vivo eignet. Da dies keine regelmäßige Vorbehandlung von Proben wie Zellsortierung, Fraktionierung und Konzentration erfordert, kann es eine Probe mit minimalem Verlust biologischer Komponenten analysieren, insbesondere solche, die als sehr kleine Menge vorhanden sind. Mit dieser Technik können Sie die Rohgewebematerialien direkt in einer Minute durch Massenspektrometrie analysieren.
Schnelligkeit ist unbehindert in der Robustheit des Systems, Hauptvorteile dieser Technik inhärent. Alles, was Sie tun müssen, ist nur Kieselsäure vorzubereiten, 10 Milligramm Gewebe Probe, und 10 Mikroliter von Vermehrung. Und legen Sie sie in Einwegpatrone.
Es ist auf den PESI-MS-Computer eingestellt, und Sie erhalten das Ergebnis in wenigen Minuten. Wenn Sie das entsprechende Massenspektrometer auswählen, können Sie die molekulare Identität kommentieren. Um zu beginnen, holen Sie die Leber oder Nierengewebe aus dem Gefrierschrank.
Schneiden Sie die Gewebeprobe auf einer Korkplatte mit einem Skalpell oder Messer auf etwa zwei mal zwei mal zwei Millimeter. Alternativ können Sie die Probe mit dem Trepan ausstechen und die Länge der Säule auf zwei Millimeter trimmen. Wenn das Gewebe mit Blut kontaminiert ist, kurz mit eiskalter Phosphat-gepufferter Saline waschen.
Etwa 10 Milligramm der geschnittenen oder ausgestanzten Probe in ein Kunststoff-Mikrorohr geben und 100 Mikroliter 50% Ethanol hinzufügen. Verwenden Sie ein Mikroschädling, um die Probe zu homogenisieren. Dann mit dem Pipettenmann 10 Mikroliter des Homogenats in den Brunnen der Patrone des Massenspektrometers legen.
Legen Sie die Patrone in die Ionisationskammer des Direct Probe Ionization Mass Spectrometer und installieren Sie die Edelstahl-Steal-Nadelsonde, die für die Probenionisierung verwendet wird. Schließen Sie den Kammerdeckel fest, um die Sicherheitsvorrichtung automatisch zu aktivieren. Starten Sie den Bordcomputer, indem Sie auf das Startsymbol klicken, um mithilfe der Bildschirmpanels eine Spannung von 2,3 Kilovolt auf die Nadel anzuwenden, um das Elektrospray zu erzeugen und sicherzustellen, dass die Frequenz der Nadel drei Hertz beträgt.
Warten Sie 30 Sekunden, bis die Messung abgeschlossen ist. Nach der Messung jeder Probe die Patrone und die Nadel in einem Biogefährdungsdeerlader entsorgen. Um die Massenspektren zu analysieren, öffnen Sie die Software, die mit dem Massenspektrometer verknüpft ist.
Klicken Sie im Browserfenster der Datendatei der Software auf die Datei L-C-D. Klicken Sie auf eine einzelne Spitze des Massenspektrumfensters und stellen Sie automatisch ein E-I-C dar. Überprüfen Sie die T-I-C und E-I-C, und klicken Sie auf das Symbol des durchschnittlichen Spektrums, um den Bereich des Zeitfensters für die Erzeugung des Massenspektrums auszuwählen.
Exportieren Sie die Massenspektraltextdaten. Um Körperflüssigkeiten zu analysieren, ziehen Sie bis zu 10 Mikroliter der Serumprobe und geben Sie sie in ein 1,5 Milliliter Mikrotube. 190 Mikroliter 50% Ethanol in die Röhre geben und dann bei Raumtemperatur zwei Minuten wirbeln.
Um alle roten Blutkörperchen zu eliminieren, zentrieren Sie die Flüssigkeit bei 15.000 Mal G für ein bis fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie 10 Mikroliter des Überstandes in den Brunnen der Patrone und messen Sie wie bisher das Massenspektrometer. Dieses Protokoll zeigt die Probenvorbereitung für PESI-MS bei festen Proben, flüssigen Proben und lebenden Tieren.
Das karzinom der menschlichen Nierenzell zeigt charakteristische Spitzen neutraler Lipide. Es gab relativ starke Spitzen in den Spektren beim Massen-Zu-Ladungs-Verhältnis von 900 aus dem menschlichen Nierenzellkarzinomgewebe, die im umgebenden nicht-kanzerösen Gewebe nicht identifiziert wurden. Diese Spitzen stellen hauptsächlich Triacylglycerin dar.
Beispiel für Daten, die in normalen Lebergeweben erfasst wurden, zeigten die neoplastische Läsion eines Patienten mit chronischer Hepatitis und Leberzirrhose. Humanes Serum von drei Individuen wurde mit PESI-MS analysiert, es gab deutliche Unterschiede in den Spektralmustern zwischen den Individuen. Für die metabolischen Veränderungen in 5-FdU, die intravenely in das Schwanzgefäß einer Maus injiziert wurden, wurde ein sehr schneller und empfindlicher Nachweis von 5-FdU mit Natriumaddukt in der Leber in situ erreicht.
Da die Tiefe der Nadelspitze von der Stelle des Gewebes, spielt die wichtigste Rolle bei der Ionisierung, die die erfolgreiche Datenerfassung liest, stellen Sie sicher, die Anweisungen zu befolgen. Sie können die molekularen Arten identifizieren, indem Sie sich die kommerzielle Datenbank ansehen. Dies ist ein Weg, um den molekularen Mechanismus der Krankheit zu qualifizieren.
Viele Forscher haben sich für die Anwendung dieser Technik für die Vorhersage des Wohlstands von Krankheiten und es ist Prognose interessiert. Vor allem mit Ricket Biopsie. Achten Sie einfach darauf, nicht von der Sondennadel gestochen zu werden.
Dies kann einfach mit einem speziellen Instrument zum Entfernen der Nadel aus der Maschine vermieden werden.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt eine einzigartige Umgebungs-Massenspektrometrie-Methode für die Echtzeitanalyse biologischer Proben in vivo vor. Diese Technik ermöglicht die Analyse von rohen Gewebematerialien ohne besondere Vorbehandlungen und minimiert so den Verlust biologischer Bestandteile.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Massenspektrometrie
- Biologische Analyse
- Analytische Chemie
Hintergrund
- Die Umgebungs-Massenspektrometrie eignet sich sowohl für die Analyse in vitro als auch in vivo.
- Das Verfahren erfordert keine umfangreiche Probenvorbehandlung.
- Es ermöglicht die Analyse von Proben mit minimalem Verlust biologischer Bestandteile.
- Eine schnelle Analyse ist ein entscheidender Vorteil dieser Technik.
Zweck der Studie
- Eine Methode zur Echtzeitanalyse biologischer Moleküle vorstellen.
- Die Effizienz der Analyse roher Gewebematerialien demonstrieren.
- Die Vorteile der Verwendung der Ambient-Ionisation in der Massenspektrometrie hervorheben.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Silica- und Gewebeproben.
- Verwendung von Einweg-Kartuschen für die Probenauswertung.
- Direkte Analyse biologischer Proben mittels Massenspektrometrie.
- Schnelle Probenaufbereitung innerhalb einer Minute.
Hauptergebnisse
- Das Verfahren ermöglicht eine schnelle Analyse ohne nennenswerten Verlust von Bestandteilen.
- Es ist wirksam zur Analyse von Proben mit sehr geringen Mengen biologischen Materials.
- Zeigt Robustheit und Zuverlässigkeit bei der Echtzeitanalyse.
- Erleichtert die Untersuchung biologischer Moleküle in ihrem nativen Zustand.
Schlussfolgerungen
- Die Umgebungs-Massenspektrometrie ist ein wertvolles Werkzeug für die biologische Analyse.
- Die Technik verbessert das Verständnis biologischer Prozesse.
- Sie bietet eine schnelle und effiziente Methode für die Echtzeitanalyse.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Probenelektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (PESI-MS) ermöglicht die Echtzeit-Molekülanalyse biologischer Proben mit minimalem Probenvorlauf und unterstützt so eine schnelle Zielvalidierung sowie die mechanistische Entschärfung von Risiken in der frühen Entdeckung. Das Verfahren benötigt lediglich 10 mg Gewebe oder 10 µL Serum und eignet sich daher für Proben mit geringem Volumen in der präklinischen Phase, wodurch der Verlust biologischer Bestandteile reduziert wird. Diese Fähigkeit erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Identifizierung von Leitstrukturen, indem sie direkte, in-situ-Daten zu Metaboliten und Arzneimitteldynamik aus lebenden Systemen liefert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch den Nachweis neutraler Lipide und Metabolite direkt aus festen Geweben wie dem Nierenzellkarzinom.
- Operationaler Wert: Benötigt eine minimale Probenvorbereitung – lediglich die Gewebehomogenisierung in 50 % Ethanol – und reduziert so die Komplexität und Variabilität des Arbeitsablaufs.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Charakterisierung molekularer Wirkmechanismen durch Abgleich mit kommerziellen Datenbanken und trägt so zur Bewertung der Zielmolekülverlässlichkeit bei.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die direkte Analyse von menschlichem Blutserum nach einfacher Ethanolpräzipitation und Zentrifugation und damit die biomarkerbasierte Untersuchung in flüssigen Proben.
- Operativer Wert: Verwendet Einweg-Kartuschen und Sonden aus rostfreiem Stahl, was eine Standardisierung gewährleistet und das Risiko einer Kreuzkontamination verringert.
- Skalierbarkeit: Erleichtert einen schnellen Probendurchsatz – Ergebnisse innerhalb weniger Minuten – und unterstützt die Bereitschaft für Hochdurchsatz-Screenings.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationaler Kontinuität Ermöglicht die Echtzeitverfolgung der Dynamik von Metaboliten oder Arzneimitteln in spezifischen Organen lebender Tiere, wie beispielsweise der Detektion von 5-FdU in der Mausleber.
- Mechanistische Entwederung Bietet molekulare Daten in situ, ohne das Gewebe zu zerstören, und erhält so den physiologischen Kontext für eine verbesserte Übertragung von präklinischen auf klinische Befunde.
- Risikoadjustierte Fortschrittsbewertung Erkennt krankheitsassoziierte Spektralmuster (z. B. neoplastische Läsionen in der Leberzirrhose), um Entscheidungen über das weitere Vorgehen zu unterstützen.
Pipeline- und Workflow-Integration
PESI-MS ist in den Entdeckungsprozess von der frühen Biologie bis zur Identifizierung von Wirkstoffkandidaten eingebettet und bietet schnelle, quantitative molekulare Messwerte, die die Hypothesenprüfung und die Bereitschaft von Assays unterstützen.
- Entdeckungsbioanalytik: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch Detektion gewebespezifischer molekularer Signaturmuster (z. B. Triacylglycerol in Karzinomen) ohne Fraktionierung.
- Screening: Ermöglicht die analysefertige Untersuchung von Flüssigkeiten und Geweben durch standardisierte, kartenzentrierte Probenaufgabe.
- Analytik: Erzeugt massenspektrometrische Daten (m/z-Peaks, EIC, TIC) für den quantitativen Vergleich unter verschiedenen Bedingungen und zwischen Individuen.
- Translationale Forschung: Ermöglicht die Verbindung zur präklinischen Validierung durch die In-vivo-Überwachung von Arzneimittelmetaboliten, wie beispielsweise intravenös verabreichtes 5-FdU in der Maus-Schwanzvene.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Nutzt wiederverwendbare Hardware (Probenahmekopf, Kammer) zusammen mit Einwegverbrauchsmaterialien und ermöglicht so eine standardisierte Anwendung über verschiedene Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem direkte molekulare Daten aus intakten biologischen Systemen bereitgestellt werden.
- Operativer Wert: Stellt Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Probenvorbereitung (10 mg Gewebe, 10 µL Serum, 50 % Ethanol) und feste Spannungs- und Frequenzeinstellungen (2,3 kV, 3 Hz).
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch durch schnelle Detektion von Metaboliten oder Wirkstoffen in Krankheitsmodellen.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung durch Nachweis krankheitsspezifischer Signale (z. B. m/z 900 beim Karzinom), die in Kontrollproben fehlen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Betrieb von Massenspektrometern, einschließlich der Zubereitung von Lösungsmitteln (50 % Ethanol) und der Verwendung einer Zentrifuge zur Aufbereitung von Serum.
- Benötigt ein Direktproben-Ionisations-Massenspektrometer mit kompatiblem Kassettensystem und einer Nadelsonde aus rostfreiem Stahl.
- Erfordert eine standardisierte Probenvorbereitung über Teamgrenzen hinweg – Gewebeschnitte, Homogenisierung und Übertragung des Überstandes – zur Sicherstellung der Datenkonsistenz.
- Muss die Eintauchtiefe der Nadelspitze als kritischen Einflussfaktor auf die Ionisationseffizienz und Datenqualität bei Anwendungen am lebenden Organismus berücksichtigen.
- Auf Proben beschränkt, die mit der Umgebungsionisation kompatibel sind; Matrixeffekte können eine Optimierung bei komplexen Körperflüssigkeiten erforderlich machen.
