Name: Der Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in neuralen Stammzellen und Gehirnen von Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Lernen Sie den Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in neuronalen Stammzellen und Mäusegehirnen mittels Immunfluoreszenz und DNA-Dot-Blot. Diese Methode erleichtert die Erforschung epigenetischer Regulation in der Neurowissenschaft.

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XL wurde teilweise vom National Key R&D Program of China (2017YFE0196600) und der National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 31771395, 31571518) unterstützt. Q.S. wurde vom National Key Research and Development Program of China (2017YFC1001703) und dem Key Research and Development Program der Provinz Zhejiang (2017C03009) unterstützt. W.X. wurde von der Natural Science Foundation der Provinz Zhejiang (LY18H020002) und der Abteilung für Wissenschaftstechnologie der Provinz Zhejiang (2017C37057) unterstützt.

Alle Tierverfahren wurden von der Tierethikkommission der Universität Zhejiang genehmigt.
1. Die Kultur der adulten neuronalen Stammzellen und Neuronen
<ol><li>Isolieren Sie adulte neuronale Stammzellen aus dem Vorderhirn einer Erwachsenen (8-10 Wochen alt) C57/BL6 männliche Maus wie zuvor beschrieben31,32.</li>
	<li>Kultur adulte neuronale Stammzellen in DMEM/F-12 Medium mit 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% B27-Ergänzung, 1% Antimykotik und 2 mM L-Glutamin in einem 5%CO2-Inkubator bei 37 °C. Induzieren Sie die Differenzierung von adulten neuronalen Stammzellen mit 1 M Retinsäure und 5 M Forskolin für 48 h, wie zuvor beschrieben31,32.</li>
	<li>Isolieren Sie Neuronen aus dem embryonalen Tag 17 (E17) Hippocampi der Maus und Kultur mit neurobasalen Medium mit 0,25% L-Glutamin, 0,125% GlutaMax und 2% B27 Ergänzung in einem 5%CO2-Inkubator bei 37 °C, wie zuvor beschrieben33.</li>
</ol>2. Transkardiale Perfusion der Maus
<ol><li>10% Chlorhydrat, 4% Paraformaldehyd (PFA) und Phosphat gepufferte Salzsäure (PBS) einen Tag vor dem Experiment vorbereiten und bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Anästhetisieren Sie eine erwachsene männliche oder weibliche C57 BL/6J Maus mit 10% Chloralhydrat (50 mg/kg, i.p.), und stellen Sie sicher, dass das Tier durch die Überprüfung der Körperreaktion tief beäscht wird. Befestigen Sie jedes Glied mit Klebeband auf einem Kunststoffbrett (in einer Face-up-Position).</li>
	<li>Schneiden Sie die Haut und dann den Muskel mit einer Operationsschere. Öffnen Sie die Brusthöhle mit einer chirurgischen Schere. Setzen Sie das Herz aus und schneiden Sie einen kleinen Teil des rechten Vorhofs mit einer feinen chirurgischen Schere ab.</li>
	<li>Durchnässen Sie die Maus mit einer 10 ml Einweg-Sterilspritze aus dem linken Ventrikel mit kaltem PBS (ca. 30 ml pro erwachsener Maus).</li>
	<li>Durchdringen Sie die Maus mit 4% PFA (ca. 30 ml in 10 min pro erwachsenen Mäusen), bis sie steif ist.</li>
	<li>Öffnen Sie den Schädel der Maus mit Knochenzange. Entfernen Sie das Gehirn und geben Sie in 5 ml 4% PFA in einem 15 ml Zentrifugenrohr für die Postfixierung bei 4 °C. HINWEIS: Reinigen Sie den Operationsbereich, nachdem die Operation beendet ist.</li>
	<li>Mindestens 24 h später übertragen Sie die Hirnproben in eine 30%ige Saccharoselösung zur vollständigen Dehydrierung bei 4 °C.</li>
</ol>3. Gehirn-Sektion
<ol><li>Die Hirnproben in eine optimale Schnitttemperaturverbindung (OCT) in einen kleinen Behälter einbetten und bei -20 °C mindestens 1 h abkühlen.</li>
	<li>Schnitt Gehirnproben mit einer Dicke von 20-40 m mit einem Kryostat-Mikrotom.</li>
	<li>Teile in PBS sammeln und bei 4 °C lagern.</li>
</ol>4. Immunfluoreszenz Färbung
<ol><li>Nehmen Sie die Abschnitte mit den zielgerichteten Hirnregionen auf und legen Sie sie in eine 24-Well-Platte mit PBS. Wenn Sie kultivierte Zellen auf einem Deckzettel enthalten, fahren Sie direkt zu Schritt 4.2.</li>
	<li>Waschen Sie mit PBS auf dem Shaker bei Raumtemperatur für 10 min. Wiederholen Sie dies zweimal mehr.</li>
	<li>PBS entfernen und mit vorgewärmten 1 M HCl 30 min bei 37 °C behandeln. HINWEIS: Bereiten Sie 1 M HCl vor, indem Sie 1 ml Salzsäure (36-38%) in 10 ml Wasser in einer chemischen Haube. 1 M HCl im Inkubator bei 37 °C vorheizen.</li>
	<li>Waschen Sie die Proben mit PBS für 5 min. Wiederholen Sie dies zweimal mehr.</li>
	<li>Blockproben mit PBS mit 3% normalem Ziegenserum und 0,1% Triton X-100 für 1 h auf dem Shaker bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Inkubieren Sie Abschnitte mit spezifischen Primärantikörpern über Nacht bei 4 °C auf dem Shaker. HINWEIS: Verwenden Sie die folgenden primären Antikörper: polyklonale Kaninchenantikörper Anti-5-Hydroxymethylcytosin (1:5.000), Maus monoklonaler Antikörper-Neun (1:500).</li>
	<li>Nehmen Sie die Proben heraus und brüten Sie bei Raumtemperatur 1 h weiter.</li>
	<li>Waschen Sie die Proben mit PBS für 10 min. Wiederholen Sie dies zweimal mehr.</li>
	<li>Inkubieren Sie mit sekundären Antikörpern, die den primären Antikörpern bei Raumtemperatur für 1 h auf dem Shaker entsprechen. Bedecken Sie die Platte mit Aluminium. HINWEIS: Verwenden Sie die folgenden sekundären Antikörper: Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Kaninchen IgG (1:500), Alexa Fluor 568 Ziege Anti-Maus IgG (1:500). Counterstain-Kerne mit 4-6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI).</li>
	<li>Waschen Sie die Proben mit PBS für 10 min auf dem Shaker. Wiederholen Sie dies noch zweimal.</li>
	<li>Montieren Sie Hirnabschnitte auf die Dias, fügen Sie eine angemessene Menge an Antifade-Montagemedium (ca. 100-150 l) hinzu und decken Sie sie mit Premium-Abdeckungsglas ab. Siegel mit Nagellack.</li>
	<li>Nehmen Sie Bilder mit einem regelmäßigen oder konfokalen Fluoreszenzmikroskop auf.</li>
</ol>5. Genomische DNA-Isolierung
<ol><li>Euthanisieren Sie eine erwachsene C57 BL/6J Maus (männlich oder weiblich) durch Zervixdislokation und entfernen Sie das Gehirn.</li>
	<li>Sezieren Sie das Hippocampus-, Kortex- und Kleinhirngewebe auf einer eisgekühlten Schale. Gewebe mit einem Gewebeschleifer in 1 ml DNA-Lysepuffer mahlen und in saubere Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. Fügen Sie 250 g Proteinase K pro 600 l Lysepuffer hinzu. Bei Zellpellets Lysepuffer, Proteinase K direkt hinzufügen und gründlich mischen. HINWEIS: Herstellung von DNA-Lysepuffer: 5 mM EDTA, 0,2% SDS, 200 mM NaCl in 100 mM Tris-HCl, pH 8,5. Waschen und autoklavieren Sie den Gewebeschleifer vor dem Experiment.</li>
	<li>Am zweiten Tag etwa 50 g RNase A pro Probe für mindestens 12 h bei 37 °C hinzufügen.</li>
	<li>Fügen Sie ein gleiches Volumen phenolisch hinzu:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) und vollständig mischen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 20.817 x g für 15 min, und entfernen Sie den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenrohr.</li>
	<li>Fügen Sie dem Überstand 600 l Chloroform hinzu, um die DNA zu fällen, und mischen Sie sie gründlich.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 20.817 x g für 15 min, und entfernen Sie den Überstand in ein anderes neues Rohr.</li>
	<li>Fügen Sie dem Überstand 500 l Isopropanol hinzu und mischen Sie es gründlich.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 20.817 x g für 15 min, und entfernen Sie den Überstand vollständig.</li>
	<li>Den Niederschlag mit 1 ml 70% Ethanol, Zentrifuge bei 20.817 x g 1 min, waschen und den Überstand vollständig entfernen. Wiederholen Sie dies einmal.</li>
	<li>Trocknen Sie das DNA-Pellet vollständig.</li>
	<li>DNA-Pellet mit Tris-HCl-Puffer (pH 8.5) auflösen auf die richtige Konzentration.</li>
</ol>6. DNA Dot Blot
<ol><li>Bereiten Sie die Lösungen vor: 2 M NaOH, Tris-HCl Puffer (pH 8.5), 6x Saline-Natriumcitrat (SSC).</li>
	<li>Machen Sie die Probenmischung als Tabelle 1.</li>
	<li>DEnaturieren SIE DNA-Proben bei 100 °C für 10 min und kühlen Sie auf Eis ab.</li>
	<li>Schneiden Sie die richtige Größe der Nylonmembran (z.B. Hybond-N+) und spülen Sie mit 6x SSC.</li>
	<li>Setzen Sie die Membran auf Punkt-Blot-Gerät und verbinden Sie sich mit der Vakuumpumpe. Spot 6 l Gemisch pro Punkt auf die Membran.</li>
	<li>30 min bei 80 °C hybridisieren und die Probenmembran mit fettfreier Milch in Tris-gepufferter Salin (TBS) für 1 h blockieren.</li>
	<li>Mit Primärantikörpern bei 4 °C über Nacht inkubieren. ANMERKUNG: der folgende primäre Antikörper: polyklonales Kaninchen-Anti-5-Hydroxymethylcytosin (1:5.000).</li>
	<li>Am zweiten Tag die Probenmembranen bei Raumtemperatur für 1 h inkubieren. 10 min mit TBS waschen. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zweimal.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Membran mit Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:5.000) für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen Sie mit TBS für 10 min. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zweimal.</li>
	<li>Visualisieren Sie die Chemilumineszenzsignale und quantifizieren Sie die Signalintensitäten.</li>
</ol>

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</ol>

Es gibt keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Epigenetische Modifikationen spielen eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung, Reifung und Funktion des Gehirns. Als stabiler Marker für die DNA-Modifikation reagiert dynamisches 5-hmC auf Verhaltensanpassung, neuronale Aktivität und ist positiv mit der Genexpression korreliert; somit ist es an der normalen Funktion des Gehirns und der neurologischen Störungbeteiligt 4. Um seine Funktion in Zellen und Geweben zu erforschen, ist es notwendig, die Existenz von 5-hmC zu erkennen und den Pegel vor u...

Epigenetische Modifikationen, einschließlich DNA-Modifikation, Histonmodifikation und RNA-Modifikation, haben gezeigt, dass sie wesentliche Funktionen in verschiedenen biologischen Prozessen und Krankheiten spielen1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7. Lange Zeit wurde die DNA-Methylierung (d.h. 5-Methylcytosin (5-mC)) als hochstabiler epigenetischer Marker angesehen und kann im Genom nicht weiter modifiziert werden. Kürzlich wurde festgestellt, dass 5-mC durch TET-Proteine (Ten-eleven Translokationen) einschließlich TET1, TET2 und TET38,9zu 5-Hydroxymethylcytosin(5-hmC) oxidiert werden könnten. Weitere Studien zeigen, dass 5-hmC als stabiler Marker dienen und biologische Rollen spielen könnte, indem die Genexpression4,10,11,12reguliert wird.
Die vorliegenden Beweise deuten darauf hin, dass 5-hmC in neuronalen Geweben/Zellen im Vergleich zu anderen Gewebearten bei Säugetieren hoch angereichert ist und dynamische Merkmale während der neuronalen Entwicklung13,14aufweist. Im neuronalen System spielen 5-hmC-vermittelte epigenetische Modifikationen eine wichtige Rolle bei der Regulierung neuronaler Stammzellen, neuronaler Aktivität, Lernen und Gedächtnis und sind an mehreren neurologischen Erkrankungen wie Rett-Syndrom, Autismus, Alzheimer beteiligt. Krankheit, Huntington, etc.2,13,15,16,17,18,19,20.
Es gibt mehrere Ansätze zum Nachweis von 5-hmC in Zellen und Geweben14,21,22,23,24. Hier beschreiben wir zwei Methoden, um die Existenz von 5-hmC zu erkennen und das globale Niveau von 5-hmC zu quantifizieren: Immunfluoreszenzfärbung und DNA-Punktfleck. Diese beiden Methoden sind bequem und empfindlich, und wurden erfolgreich in früheren Studien25,26,27,28,29,30verwendet. Die wichtigsten Schritte dieser beiden Methoden sind die DNA-Denaturierung. Für die Immunfluoreszenzfärbung von 5-hmC ist eine Vorbehandlung von Proben mit 1 M HCl erforderlich. Bei 5-hmC Dot-Blot wird die DNA-Denaturierung mit NaOH-Lösung durchgeführt. Diese beiden Methoden sind zusammen mit der Sequenzierung der nächsten Generation sehr nützliche Werkzeuge zur Untersuchung der Funktion von 5-hmC.

<table><tbody><tr><td>4'-6-diamidino-2-phenylindol (DAPI</td>) <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop Software</td><td>Adobe Inc.</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anti-Kaninchen-IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Anti-Maus-IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-5-Hydroxymethylcytosin</td><td>Active Motif</td><td>39769</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Gibco</td><td>12580-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat Mikrotom</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 medium</td><td>OmegaScientific</td><td>DM25</td><td></td></tr><tr><td>Epidermaler Wachstumsfaktor</td><td>PeproTech</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblasten-Wachstumsfaktor-basic</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Thermo</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Vector Laboratories</td><td>Z0325</td><td></td></tr><tr><td>Nylonmembran (Hybond&trade;-N+ )</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td>RPN303B</tr><tr><td>OCT</td><td>Leica</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25: 24:1 )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516726</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Sigma</td><td>P0899-10</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>VVR</td><td>39450-01-6</td><td></td></tr><tr><td>Retinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio</td><td>T8210</td><td></td></tr></tbody></table>

der nachweis von 5-hydroxymethylcytosin in neuralen stammzellen und gehirnen von mäusen

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Im Säugetiergenom wurden mehrere DNA-Modifikationen identifiziert. Davon wurden 5-Methylcytosin und 5-Hydroxymethylcytosin-vermittelte epigenetische Mechanismen intensiv untersucht. 5-Hydroxymethylcytosin zeigt dynamische Merkmale während der embryonalen und postnatalen Entwicklung des Gehirns, spielt eine regulierende Funktion in der Genexpression und ist an mehreren neurologischen Störungen beteiligt. Hier beschreiben wir die detaillierten Methoden einschließlich Immunfluoreszenzfärbung und DNA-Dot-Blot zum Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in kultivierten Zellen und Gehirngeweben der Maus.

Um die Verteilung von 5-hmC im Hippocampus von erwachsenen Mäusen zu zeigen, führten wir Immunfluoreszenz mit Antikörpern gegen neuronale Zellen (NeuN) und 5-hmC durch. Im Hippocampus, 5-hmC ko-lokalisiert gut mit neuronalen Zellmarker NeuN (Abbildung 1A-H), was auf eine Anreicherung von 5-hmC in Neuronen.
Um die Dynamik von 5-hmC während der neuronalen Entwicklung zu bestimmen, wurde zuerst ein Punktblot mit DNA-Proben durchgeführt, die aus verme...

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in Zellen und Hirngeweben vor, wobei Immunfluoreszenzfärbungundungen und DNA-Dot-Blot-Methoden verwendet werden.

Der Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in neuralen Stammzellen und Gehirnen von Mäusen

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in Zellen und gehirngeweben mithilfe der Immunfluoreszenz, der neuen Methode und des DNA-Dot-Blots vor. 5-Hydroxymethylcytosin, d.h. 5hmC, gemildert epigenetische Veränderung, spielt eine wichtige Funktion bei der Regulierung der Genexpression und ist an mehreren neurologischen Störungen beteiligt.Eigentlich können unsere Methoden verwendet werden, um 5hmC in mehreren Zellen und geweben zu erkennen. Es ist bequem und kann mit gemeinsamen Geräten im Labor durchgeführt werden. Beginnen Sie, indem Sie die Maus nach oben auf einem Kunststoffbrett positionieren und jede Gliedmaße mit Klebeband fixieren.Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um die Haut und den Muskel zu durchschneiden und die Brusthöhle zu öffnen. Setzen Sie das Herz aus und schneiden Sie einen kleinen Teil des rechten Vorhofs mit einer feinen chirurgischen Schere ab. Mit einer 10-Milliliter Einweg-, sterilisierten Spritze, durchdringen Sie die Maus aus dem linken Ventrikel mit kalten PBS.Dann durchdringen Sie die Maus mit 4%PFA, bis sie steif ist. Öffnen Sie dann den Schädel mit Knochenzangen und entfernen Sie das Gehirn. Legen Sie das Gehirn in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr, gefüllt mit fünf Millilitern 4%PFA, und lagern Sie es bei vier Grad Celsius.Nach 24 Stunden, übertragen Sie das Gehirn in eine 30%Saccharose-Lösung und lassen Sie es bei vier Grad Celsius für vollständige Dehydrierung. Vor dem Schneiden, einbetten Sie das Gehirn in optimale Schnitttemperatur Verbindung und kühlen auf minus 20 Grad Celsius für mindestens eine Stunde. Schnitt Gehirnproben mit einer Dicke von 20 bis 40 Mikrometern mit einem Kryostat-Mikrotom.Sammeln Sie Abschnitte in PBS und lagern Bei vier Grad Celsius. Nehmen Sie die Gehirnabschnitte von Interesse und legen Sie sie in eine 24-Well-Platte mit PBS. Abschnitte mit PBS 10 Minuten auf einem Shaker waschen.Entfernen Sie die PBS und behandeln Sie mit vorgewärmten ein-Molaren-Salzsäure bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Salzsäure ist ätzend und bereiten Sie sie bitte im chemischen Laderaum zu. Dann waschen Sie die Proben dreimal mit PBS für fünf Minuten und blockieren Sie sie mit PBS, die 3% normales Ziegenserum und 0,1% Triton X-100 enthalten.Lassen Sie die Proben auf einem Shaker bei Raumtemperatur für eine Stunde. Fügen Sie den Abschnitten spezifische Primärantikörper hinzu und brüten Sie über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Shaker. Am nächsten Tag nehmen Sie die Proben heraus und lassen Sie sie bei Raumtemperatur für eine Stunde.Waschen Sie die Proben dreimal mit PBS und fügen Sie sekundäre Antikörper hinzu. Bedecken Sie die Platte mit Aluminium und lassen Sie sie beim Schütteln eine Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Proben nach der Inkubation dreimal mit PBS und montieren Sie sie auf Dias.Fügen Sie 100 bis 150 Mikroliter Anti-Fade-Montagemedium, Abdeckung mit einem Premium-Abdeckung Glas, und Versiegelung mit Nagellack. Stellen Sie die Gehirnabschnitte mit einem regelmäßigen oder konfokalen Mikroskop ab. Um genomische DNA zu isolieren, beginnen Sie mit der Zersebung des Hippocampus, des Kortex und des Kleinhirngewebes auf einer eisgekühlten Schale.Fügen Sie einen Milliliter DNA-Lysepuffer hinzu und mahlen Sie das Gewebe. Übertragen Sie die Probe in ein sauberes Mikrozentrifugenrohr und fügen Sie 250 Mikrogramm Proteinase-K pro 600 Mikroliter Lysepuffer hinzu. Fügen Sie dann etwa 50 Mikrogramm RNase A pro Probe hinzu und brüten sie mindestens 12 Stunden bei 37 Grad Celsius.Nach der Inkubation ein gleiches Volumen phenolchloroformisoamylalkohol hinzufügen und gründlich mischen. Zentrifugieren Sie die Mischung nach Manuskriptrichtungen und übertragen Sie den Überstand in ein neues Rohr. Fügen Sie dem Überstand 600 Mikroliter Chloroform hinzu, mischen Sie ihn gründlich und zentrifugieren Sie nach Manuskriptanweisungen.Übertragen Sie den Überstand auf ein neues Rohr und fügen Sie 500 Mikroliter Isopropanol hinzu. Mischen Sie gründlich und Zentrifuge wieder, um die DNA zu fällen. Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen und das DNA-Pellet mit 70% Ethanol nach Manuskriptanweisungen waschen.Trocknen Sie das DNA-Pellet vollständig und lösen Sie es dann im Tris-HCl-Puffer auf. Vor dem Start die erforderlichen Lösungen und Mustermischung enden nach Manuskriptanweisungen. Denaturen Sie die DNA-Probe, indem Sie sie 10 Minuten lang auf 100 Grad Celsius erhitzen und dann auf Eis legen.Schneiden Sie die entsprechende Größe einer Nylonmembran und spülen Sie sie mit 6X SSC ab. Legen Sie die Membran auf ein Punkt-Blot-Gerät und schließen Sie die Vakuumpumpe an. Sechs-Mikroliter-Punkte auf die Membran erkennen und 30 Minuten bei 80 Grad Celsius hybridisieren.Blockieren Sie dann die Probenmembran mit fettfreier Milch und Tris-gepufferter Salin, oder TBS, für eine Stunde. Fügen Sie den polyklonalen Kaninchen Anti-5-Hydroxymethylcytosin-Antikörper in die Membran und inkubieren Über nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag die Probenmembran für eine Stunde bei Raumtemperatur lassen und dann dreimal mit TBS waschen.Inkubieren Sie die Membran mit dem Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper für 30 Minuten und dann dreimal mit TBS waschen. Visualisieren Sie die Chemilumineszenzsignale und quantifizieren Sie ihre Intensität. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um 5-Hydroxymethylcytosin, oder 5hmC, im Hippocampus von erwachsenen Mäusen zu visualisieren.Immunfluoreszenz mit Antikörpern gegen neuronale Zellen, die 5hmC zeigt, dass es eine Anreicherung von 5hmC in Neuronen. Die Dynamik von 5hmC während der neuronalen Entwicklung kann mit einem Punkt-Blot-Test von DNA-Proben bestimmt werden, die aus vermehrten und differenzierten adulten neuronalen Stammzellen isoliert wurden. Globale Konzentrationen von 5hmC deutlich während der Differenzierung und das Niveau von 5hmC in Neuronen ist höher als in neuronalen Stammzellen.Der wichtigste Schritt dieser Methode besteht darin, sicherzustellen, dass die dna-Proben vollständig denaturiert werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Die EpiMark 5-HMC und 5-mC Analysis Kit kann verwendet werden, um zu analysieren und zu quantifizieren 5-Methylcytosin und 5-Hydroxymethylcytosin innerhalb einer spe cific locus werden. Das Kit unterscheidet 5-mC von 5-HMC von der Zugabe von Glucose an die Hydroxylgruppe von 5-HMC über eine enzymatische Reaktion unter Verwendung von β-glucosyltransferase (T4-BGT). Als 5-HMC im Rahmen der CCGG auftritt, wandelt diese Modifikation eines spaltbaren MspI Ort zu einer nicht-spaltbare Website.

Hohe Empfindlichkeit 5-Hydroxymethylcytosin Erkennung in Balb / C Gehirngewebe

Beschrieben wird ein zweistufiges Verfahren unter Verwendung Kennzeichnung β-Glucosyltransferase (β-GT), um ein Azid-Glukose zu 5-HMC übertragen, gefolgt von Klickchemie einen Linker Biotin für die einfache und dichteunabhängigen Anreicherung zu übertragen. Dieses effiziente und spezifische Kennzeichnung Methode ermöglicht die Anreicherung von 5-HMC mit extrem niedrigen Hintergrund und hohem Durchsatz epigenomischen Mapping über Next-Generation-Sequenzierung.

Selektive Aufnahme von 5-Hydroxymethylcytosin aus genomischer DNA

Hier beschreiben wir ein in-vivo-Mutagenese-Assay für eine kleine Anzahl von gereinigten hämatopoetischen Zellen unter Verwendung des lacI transgenen Mausmodell. Die LacI Gen isoliert, um die Häufigkeit, Ort und Art der DNA-Mutanten entstanden spontan oder nach der Exposition zu Genotoxinen bestimmen.

Identifizierung von DNA-Mutationen in hämatopoetischen Stammzellen Gereinigtes / Vorläuferzellen

Verwaltung der beiden Analoga von Thymidin, EDU und BrdU, bei schwangeren Mäusen ermöglicht die Analyse des Zellzyklus in neuronalen und Vorläuferzellen im embryonalen Gehirn der Maus. Dieses Verfahren ist nützlich, um die Auswirkungen der genotoxischen Stress, einschließlich ionisierender Strahlung, während der Gehirnentwicklung zu bestimmen.

Beurteilung der Zellzyklus-Progression of Neural Stem-und Vorläuferzellen im sich entwickelnden Gehirn Maus nach genotoxischen Stress

Hierin beschreiben wir eine empfindliche immunchemische Methode zur Kartierung der räumlichen Verteilung von 5mC-Oxidationsderivaten, die auf der Verwendung von Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörpern und Tyramid-Signalamplifikation basiert.

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Neu entdeckte oxidierte Formen von 5-Methylcytosine (Oxi-mCs), 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-Formylcytosine (5-Fu) und 5-Carboxylcytosine (5caC) kann verschiedene DNA-Modifikationen mit einzigartigen funktionellen Rollen vertreten. Hier ist ein semi-quantitative Workflow zur Visualisierung der räumlichen Verteilung Oxi-mCs, Signal Intensität Profilierung und NS1 beschrieben.

Immunostaining für DNA-Modifikationen: computergestützte Analyse der konfokalen Bilder

Wir präsentieren Ihnen eine effektive und reproduzierbare Methode zum isolieren und Kultur neurale Vorläuferzellen aus embryonalen und postnatale Hirngewebe für Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) von Histon 3 Lysin 79 Dimethylation (H3K79me2) - eine Histon-Markierung befindet sich innerhalb der globulären Domäne des Histon 3.

Isolierung und Kultivierung von neuronalen Vorläuferzellen gefolgt von Chromatin Immunopräzipitation Histon 3 Lysin 79 Dimethylation Marke

Das Ziel dieses Berichts ist es, das Protokoll für robuste immunhistochemischen Nachweis von epigenetischen Markierungen beschreiben, 5-Methylcytosine (5mC) und 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC) bei der Entwicklung und postmitotischen Maus Netzhaut.

Immunhistochemische Nachweis von 5 Methylcytosine und 5-Hydroxymethylcytosine bei der Entwicklung und der postmitotischen Maus Retina

Der methylierte RNA-Immunpräzipitationstest ist eine Antikörper-basierte Methode zur Anreicherung für methylierte RNA-Fragmente. Gekoppelt mit einer tiefen Sequenzierung führt dies zur Identifizierung von Transkripten, die die m5C-Modifikation tragen.

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Die Fähigkeit, Stammzellen und ihre Nachkommen mit einem Fluorophor unter Verwendung einer induzierbaren transgenen Linienverfolgungs-Mauslinie dauerhaft zu markieren, ermöglicht eine räumliche und zeitliche Analyse von Aktivierung, Proliferation, Migration und / oder Differenzierung in vivo. Die Abstammungsverfolgung kann neue Informationen über die Verpflichtung der Abstammung, die Reaktion auf Interventionen und die Multipotenz aufdecken.

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Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der normalen und aberranten Cytosinmethylierung in intakten Zebrafischembryonen.

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Lernen Sie den Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in neuronalen Stammzellen und Mäusegehirnen mittels Immunfluoreszenz und DNA-Dot-Blot. Diese Methode erleichtert die Erforschung epigenetischer Regulation in der Neurowissenschaft.

Der Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in neuralen Stammzellen und Gehirnen von Mäusen

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