Genotypisierung und Quantifizierung der In-Situ-Hybridisierungsfärbung in Zebrafischen
January 28th, 2020
Gen-Editing-Technologien haben es Forschern ermöglicht, Zebrafischmutanten zu generieren, um die Genfunktion relativ einfach zu untersuchen. Hier bieten wir einen Leitfaden zur parallelen Embryo-Genotypisierung und Quantifizierung von In-situ-Hybridisierungssignalen in Zebrafischen. Dieser unvoreingenommene Ansatz bietet eine höhere Genauigkeit bei phäotypischen Analysen auf der Grundlage der In-situ-Hybridisierung.
Die Folgen von Mutationen auf die Genexpression werden oft qualitativ durch In-situ-Hybridisierung bewertet und im Allgemeinen visuell bewertet, was subjektiv und von den Erwartungen des Forschers voreingenommen ist. Diese Methode bietet eine konsistentere Möglichkeit, In-situ-Experimente zu vergleichen, indem Bildintensitäten quantifiziert und diese Verzerrung entfernt wird. Dies kann auch leicht an andere Modellsysteme angepasst werden, die in situ Hybridisierung als Leser einer Genexpression verwenden.
Beginnen Sie mit der Abbildung der In-situ-Hybridisierungs- oder ISH-gefärbten Embryonen. Bereiten Sie eine Glycerinlösung vor und mischen Sie sie, um sie zu homogenisieren. Übertragen Sie die Embryonen mit einer Drei-Milliliter-Pasteur-Pipette in die Glycerinlösung und lassen Sie sie sich mindestens fünf Minuten lang begnügen.
Bereiten und beschriften Sie genügend PCR-Röhren, um die ISH-gefärbten Embryonen nach der Bildgebung zu übertragen, und verwenden Sie dann eine Pasteurpipeette mit drei Millilitern, um 100% Glycerin an den Boden des Brunnens eines Glasdepressionsschlittens zu geben. Übertragen Sie einen einzelnen ISH-gebeizten Embryo auf das Glasschlitten und orientieren Sie ihn unter einem Stereomikroskop, das mit einer Digitalkamera und einer Boden- und Oberbeleuchtung ausgestattet ist. Passen Sie mit dem ersten Embryo die Beleuchtungs- und Belichtungszeit bei der gewünschten Vergrößerung an.
Bild so viele Embryonen wie erforderlich und beschriften Sie jedes Bild mit einer eindeutigen Zahl. Übertragen Sie nach der Bildgebung jeden Embryo in ein pcR-Rohr, das mit der gleichen Anzahl gekennzeichnet ist, und saugen Sie bei Bedarf das überschüssige Glycerin aus den PCR-Röhren an. Um die DNA zu extrahieren, fügen Sie 40 bis 75 Mikroliter eines alkalischen Lysepuffers wie HoTSHOT zu jeder Röhre hinzu.
Die Rohre bei 95 Grad Celsius ca. 30 Minuten bebrüten und dann auf vier Grad Celsius abkühlen. Fügen Sie ein gleiches Volumen des Neutralisationspuffers hinzu und fahren Sie mit der Genotypisierung für die Mutation des Interesses fort. Um eine Bildanalyse durchzuführen, wählen Sie das Bild in Fidschi aus und öffnen Sie es, indem Sie auf Bearbeiten und dann inumlegen klicken, dann den Bildtyp in 8-Bit konvertieren, indem Sie auf die Registerkarte Bild klicken, Typ auswählen und 8-Bit auswählen.
Wählen Sie das Polygonwerkzeug aus, und zeichnen Sie manuell den Interessenbereich oder ROI auf dem Bild um den Bereich, der das zu messende ISH-Signal enthält. Drücken Sie T, um den ROI-Manager zu öffnen und die Interessenregion auszuwählen, und klicken Sie dann auf Messen. Kopieren Sie den Mittelwert aus dem Ergebnisfenster in eine Kalkulationstabelle.
Um die Hintergrundintensität zu messen, verschieben Sie den ROI in eine Region im Embryo ohne Färbung, und klicken Sie im ROI-Manager auf Hinzufügen. Wählen Sie den Hintergrundbereich aus, und klicken Sie auf Messen, und notieren Sie dann den mittleren Intensitätswert in der Kalkulationstabelle. Erhalten Sie die mittlere Pixelintensität des NC2-Hybridisierungssignals, indem Sie die mittlere Intensität des Hintergrunds von der des gebeizten Bereichs subtrahieren.
Nachdem Sie die mittlere Pixelintensität jeder Probe ermittelt haben, weisen Sie jeder Probe einen Genotyp zu. Wenn der Genotyp nicht bestimmt werden kann, schließen Sie die Probe von der nachfolgenden Analyse aus. Sortieren Sie die mittleren Probenintensitätswerte nach Genotyp und führen Sie statistische Tests durch.
Der Nutzen dieser Technik wurde auf der ISH für dnmt3bb demonstriert. 1 in Embryonen aus einem runx1 heterozygoten Incross. Ein Rückgang der dnmt3bb.
1 Expression wurde bei Runx1 homozygoten Mutanten nachgewiesen, während heterozygote Embryonen keine signifikanten Unterschiede in dnmt3bb zeigten. 1 Ausdruck. Bei dem Versuch, die Wirkung der Lmo4-Mutation auf die Runx1-Expression zu bestimmen, zeigte diese Analyse keine signifikanten Unterschiede in der Expression zwischen Wildtyp und homozygoten Lmo4-Mutanten.
Eine kleine Abnahme der Runx1-Expression wurde jedoch durch einzelne Embryo qPCR festgestellt. Bei etwa 0,4% der runx1-sonsierten Embryonen hatte die ISH einen hohen Hintergrund, der zu einer negativen Zahl führte, wenn sie vom Signal subtrahiert wurde. In solchen Fällen wurden die Embryonen von der Analyse ausgeschlossen.
Vier verschiedene Regionen an den Embryonen wurden getestet, um Hintergrundkorrekturen zu optimieren. Während es in einem der Hintergrundbereiche einen relativ stabilen Unterschied in der Intensität des ROI gab, zeigte R3 immer eine höhere Intensität als der ROI und sollte nicht für die Hintergrundkorrektur verwendet werden. R1 und R4 erwiesen sich als die am besten geeigneten Bereiche für die Hintergrundkorrektur.
Es ist wichtig, die besten Bedingungen für die Bildgebung zu finden und sie während des gesamten Experiments unverändert zu halten. Wir empfehlen auch, die Pixelintensität zu quantifizieren, bevor jeder Probe ein Genotyp zugewiesen wird.
Überblick
Dieser Artikel stellt eine Methode zur parallelen Embryo-Genotypisierung und Quantifizierung von in situ Hybridisierungssignalen bei Zebrafischen vor. Durch die Verwendung dieses unvoreingenommenen Ansatzes können Forscher eine höhere Genauigkeit bei phänotypischen Analysen erzielen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Genetik
- Entwicklungsbiologie
Hintergrund
- Genbearbeitungstechnologien erleichtern die Erzeugung von Zebrafischmutanten.
- In situ Hybridisierung ist eine gängige Methode zur Bewertung der Genexpression.
- Traditionelle Bewertungsmethoden können Verzerrungen und Subjektivität einführen.
- Diese Studie zielt darauf ab, einen konsistenteren und quantitativen Ansatz zu liefern.
Zweck der Studie
- Um die Genauigkeit phänotypischer Analysen bei Zebrafischen zu verbessern.
- Um eine standardisierte Methode für die Embryo-Genotypisierung bereitzustellen.
- Um in situ Hybridisierungssignale objektiv zu quantifizieren.
Verwendete Methoden
- Bildgebung ISH-gefärbter Embryonen mittels Stereomikroskop.
- Herstellung von Glycerinlösungen für den Embryotransfer.
- Verwendung von alkalischem Lysepuffer für die DNA-Extraktion.
- Einsatz von Fiji-Software für Bildanalyse und Quantifizierung.
Hauptergebnisse
- Demonstrierte eine Abnahme der dnmt3bb.1-Expression in runx1 homozygoten Mutanten.
- Identifizierte geeignete Hintergrundkorrekturbereiche für die Bildanalyse.
- Zeigte keine signifikanten Unterschiede in der Expression zwischen Wildtyp und lmo4 homozygoten Mutanten.
- Bietet eine zuverlässige Methode zur Zuordnung von Genotypen basierend auf Pixelintensität.
Schlussfolgerungen
- Die Methode verbessert die Zuverlässigkeit der Genexpressionsanalyse.
- Sie kann für die Verwendung in anderen Modellsystemen angepasst werden.
- Die Aufrechterhaltung konsistenter Bildgebungsbedingungen ist entscheidend für genaue Ergebnisse.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Quantitative in situ hybridization analysis reduces subjectivity in gene expression assessment, improving data reliability for target validation in zebrafish models. This approach supports mechanistic de-risking by enabling unbiased correlation of genotype with phenotypic expression patterns. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing standardized, replicable measurements across mixed-genotype samples.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through unbiased quantification of spatially restricted gene expression signals.
- Operational Value: Provides a consistent workflow for comparing mutant and wild-type phenotypes without observer bias.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing significant expression changes from background noise in genetic models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline expression profiles.
- Reproducibility: Standardizes image acquisition and analysis protocols to minimize inter-experiment variability.
- Quantitative Output: Generates measurable pixel intensity data suitable for statistical comparison across treatment groups.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains consistency from discovery through preclinical validation by using objective phenotypic readouts.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of gene expression changes with genotypic status for translational biomarker development.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables data-driven advancement decisions by reducing false positives in target validation studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by linking genotypic confirmation with quantitative phenotypic assessment, supporting lead identification through mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing quantitative mRNA distribution data to clarify gene function in developmental pathways.
- Screening: Enables assay standardization through reproducible imaging and analysis conditions for reliable compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative intensity measurements and background-subtracted values that enable statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by ensuring consistent phenotypic scoring across model systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genotyping and quantification platform applicable to multiple genes and mutant lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in gene expression data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized embryo handling and image analysis protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing objective data for capital allocation in early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by distinguishing true biological effects from technical variability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryo handling, microscopy, and basic genotyping techniques.
- Dependent on stereo microscopy with digital imaging capabilities and Fiji software for analysis.
- Necessitates cross-team standardization of imaging conditions, exposure times, and background correction regions.
- Involves adaptation considerations for different zebrafish strains and developmental stages.
- Includes practical limitations such as background correction optimization and exclusion of samples with indeterminate genotypes or high background noise.
