Genotypisierung und Quantifizierung der In-Situ-Hybridisierungsfärbung in Zebrafischen
28. Januar 2020
Gen-Editing-Technologien haben es Forschern ermöglicht, Zebrafischmutanten zu generieren, um die Genfunktion relativ einfach zu untersuchen. Hier bieten wir einen Leitfaden zur parallelen Embryo-Genotypisierung und Quantifizierung von In-situ-Hybridisierungssignalen in Zebrafischen. Dieser unvoreingenommene Ansatz bietet eine höhere Genauigkeit bei phäotypischen Analysen auf der Grundlage der In-situ-Hybridisierung.
Die Folgen von Mutationen auf die Genexpression werden oft qualitativ durch In-situ-Hybridisierung bewertet und im Allgemeinen visuell bewertet, was subjektiv und von den Erwartungen des Forschers voreingenommen ist. Diese Methode bietet eine konsistentere Möglichkeit, In-situ-Experimente zu vergleichen, indem Bildintensitäten quantifiziert und diese Verzerrung entfernt wird. Dies kann auch leicht an andere Modellsysteme angepasst werden, die in situ Hybridisierung als Leser einer Genexpression verwenden.
Beginnen Sie mit der Abbildung der In-situ-Hybridisierungs- oder ISH-gefärbten Embryonen. Bereiten Sie eine Glycerinlösung vor und mischen Sie sie, um sie zu homogenisieren. Übertragen Sie die Embryonen mit einer Drei-Milliliter-Pasteur-Pipette in die Glycerinlösung und lassen Sie sie sich mindestens fünf Minuten lang begnügen.
Bereiten und beschriften Sie genügend PCR-Röhren, um die ISH-gefärbten Embryonen nach der Bildgebung zu übertragen, und verwenden Sie dann eine Pasteurpipeette mit drei Millilitern, um 100% Glycerin an den Boden des Brunnens eines Glasdepressionsschlittens zu geben. Übertragen Sie einen einzelnen ISH-gebeizten Embryo auf das Glasschlitten und orientieren Sie ihn unter einem Stereomikroskop, das mit einer Digitalkamera und einer Boden- und Oberbeleuchtung ausgestattet ist. Passen Sie mit dem ersten Embryo die Beleuchtungs- und Belichtungszeit bei der gewünschten Vergrößerung an.
Bild so viele Embryonen wie erforderlich und beschriften Sie jedes Bild mit einer eindeutigen Zahl. Übertragen Sie nach der Bildgebung jeden Embryo in ein pcR-Rohr, das mit der gleichen Anzahl gekennzeichnet ist, und saugen Sie bei Bedarf das überschüssige Glycerin aus den PCR-Röhren an. Um die DNA zu extrahieren, fügen Sie 40 bis 75 Mikroliter eines alkalischen Lysepuffers wie HoTSHOT zu jeder Röhre hinzu.
Die Rohre bei 95 Grad Celsius ca. 30 Minuten bebrüten und dann auf vier Grad Celsius abkühlen. Fügen Sie ein gleiches Volumen des Neutralisationspuffers hinzu und fahren Sie mit der Genotypisierung für die Mutation des Interesses fort. Um eine Bildanalyse durchzuführen, wählen Sie das Bild in Fidschi aus und öffnen Sie es, indem Sie auf Bearbeiten und dann inumlegen klicken, dann den Bildtyp in 8-Bit konvertieren, indem Sie auf die Registerkarte Bild klicken, Typ auswählen und 8-Bit auswählen.
Wählen Sie das Polygonwerkzeug aus, und zeichnen Sie manuell den Interessenbereich oder ROI auf dem Bild um den Bereich, der das zu messende ISH-Signal enthält. Drücken Sie T, um den ROI-Manager zu öffnen und die Interessenregion auszuwählen, und klicken Sie dann auf Messen. Kopieren Sie den Mittelwert aus dem Ergebnisfenster in eine Kalkulationstabelle.
Um die Hintergrundintensität zu messen, verschieben Sie den ROI in eine Region im Embryo ohne Färbung, und klicken Sie im ROI-Manager auf Hinzufügen. Wählen Sie den Hintergrundbereich aus, und klicken Sie auf Messen, und notieren Sie dann den mittleren Intensitätswert in der Kalkulationstabelle. Erhalten Sie die mittlere Pixelintensität des NC2-Hybridisierungssignals, indem Sie die mittlere Intensität des Hintergrunds von der des gebeizten Bereichs subtrahieren.
Nachdem Sie die mittlere Pixelintensität jeder Probe ermittelt haben, weisen Sie jeder Probe einen Genotyp zu. Wenn der Genotyp nicht bestimmt werden kann, schließen Sie die Probe von der nachfolgenden Analyse aus. Sortieren Sie die mittleren Probenintensitätswerte nach Genotyp und führen Sie statistische Tests durch.
Der Nutzen dieser Technik wurde auf der ISH für dnmt3bb demonstriert. 1 in Embryonen aus einem runx1 heterozygoten Incross. Ein Rückgang der dnmt3bb.
1 Expression wurde bei Runx1 homozygoten Mutanten nachgewiesen, während heterozygote Embryonen keine signifikanten Unterschiede in dnmt3bb zeigten. 1 Ausdruck. Bei dem Versuch, die Wirkung der Lmo4-Mutation auf die Runx1-Expression zu bestimmen, zeigte diese Analyse keine signifikanten Unterschiede in der Expression zwischen Wildtyp und homozygoten Lmo4-Mutanten.
Eine kleine Abnahme der Runx1-Expression wurde jedoch durch einzelne Embryo qPCR festgestellt. Bei etwa 0,4% der runx1-sonsierten Embryonen hatte die ISH einen hohen Hintergrund, der zu einer negativen Zahl führte, wenn sie vom Signal subtrahiert wurde. In solchen Fällen wurden die Embryonen von der Analyse ausgeschlossen.
Vier verschiedene Regionen an den Embryonen wurden getestet, um Hintergrundkorrekturen zu optimieren. Während es in einem der Hintergrundbereiche einen relativ stabilen Unterschied in der Intensität des ROI gab, zeigte R3 immer eine höhere Intensität als der ROI und sollte nicht für die Hintergrundkorrektur verwendet werden. R1 und R4 erwiesen sich als die am besten geeigneten Bereiche für die Hintergrundkorrektur.
Es ist wichtig, die besten Bedingungen für die Bildgebung zu finden und sie während des gesamten Experiments unverändert zu halten. Wir empfehlen auch, die Pixelintensität zu quantifizieren, bevor jeder Probe ein Genotyp zugewiesen wird.
Übersicht
Dieser Artikel stellt eine Methode zur parallelen Genotypisierung von Embryonen und Quantifizierung von In-situ-Hybridisierungssignalen bei Zebrafischen vor. Mithilfe dieses unvoreingenommenen Ansatzes können Forscher eine höhere Genauigkeit bei phänotypischen Analysen erzielen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Genetik
- Entwicklungsbiologie
Hintergrund
- Genbearbeitungstechnologien erleichtern die Erzeugung von Zebrafisch-Mutanten.
- Die In-situ-Hybridisierung ist eine gängige Methode zur Beurteilung der Genexpression.
- Herkömmliche Bewertungsmethoden können Verzerrungen und Subjektivität hervorrufen.
- Diese Studie zielt darauf ab, einen konsistenteren und quantitativeren Ansatz bereitzustellen.
Zweck der Studie
- Verbesserung der Genauigkeit phänotypischer Analysen bei Zebrafischen.
- Bereitstellung einer standardisierten Methode zur Genotypisierung von Embryonen.
- Objektive Quantifizierung von In-situ-Hybridisierungs-Signalen.
Verwendete Methoden
- Abbildung von ISH-gefärbten Embryonen mittels Stereomikroskop.
- Herstellung von Glycerinlösungen für die Embryotransferierung.
- Verwendung von alkalischer Lysepufferlösung zur DNA-Extraktion.
- Einsetzen der Fiji-Software zur Bildanalyse und Quantifizierung.
Hauptergebnisse
- Nachweis einer Abnahme der dnmt3bb.1-Expression in runx1-homozygoten Mutanten.
- Identifizierung geeigneter Hintergrundkorrekturbereiche für die Bildanalyse.
- Keine signifikanten Unterschiede in der Expression zwischen Wildtyp und lmo4-homozygoten Mutanten gezeigt.
- Bereitstellung einer zuverlässigen Methode zur Zuweisung von Genotypen basierend auf der Pixelintensität.
Schlussfolgerungen
- Die Methode verbessert die Zuverlässigkeit der Genexpressionsanalyse.
- Sie kann für die Anwendung in anderen Modellsystemen angepasst werden.
- Die Aufrechterhaltung konsistenter Bildgebungsbedingungen ist entscheidend für genaue Ergebnisse.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die quantitative in-situ-Hybridisierungsanalyse verringert die Subjektivität bei der Beurteilung der Genexpression und verbessert die Datenzuverlässigkeit für die Target-Validierung in Zebrafisch-Modellen. Dieser Ansatz unterstützt die mechanistische Ent-Risikobewertung, indem er eine unvoreingenommene Korrelation von Genotyp und phänotypischen Expressionsmustern ermöglicht. Die Methode erhöht das Vorhersagevertrauen in der frühen Entdeckungsphase, indem sie standardisierte, replizierbare Messungen über gemischte Genotyp-Proben hinweg bereitstellt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch eine unvoreingenommene Quantifizierung räumlich begrenzter Genexpressionssignale.
- Operativer Wert: Bietet einen konsistenten Arbeitsablauf zum Vergleich von mutierten und wildtypischen Phänotypen ohne Beobachterbias.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem signifikante Expressionsänderungen von Hintergrundrauschen in genetischen Modellen unterschieden werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Wirkstoff-Screening vor, indem Baseline-Expressionsprofile etabliert werden.
- Reproduzierbarkeit: Standardisiert die Bildakquisition und Analyseprotokolle, um die Variabilität zwischen Experimenten zu minimieren.
- Quantitative Ausgabe: Erzeugt messbare Pixelintensitätsdaten, die für statistische Vergleiche zwischen Behandlungsgruppen geeignet sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Gewährleistet Konsistenz von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung durch die Verwendung objektiver phänotypischer Endpunkte.
- Biomarker-Ausrichtung: Ermöglicht die Korrelation von Genexpressionsänderungen mit dem genotypischen Status zur Entwicklung translationeller Biomarker.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Ermöglicht datengestützte Fortschrittsentscheidungen durch Verringerung von falsch-positiven Ergebnissen in Target-Validierungsstudien.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows, indem sie die genotypische Bestätigung mit einer quantitativen phänotypischen Bewertung verknüpft und somit die Identifizierung von Leitverbindungen durch mechanistische Entwirkungsanalyse unterstützt.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem sie quantitative Daten zur mRNA-Verteilung liefert, um die Genfunktion in Entwicklungswegen zu klären.
- Screening: Ermöglicht die Standardisierung von Assays durch reproduzierbare Bildgebung und Analysebedingungen für eine zuverlässige Wirkstoffbewertung.
- Analytik: Stellt quantitative Intensitätsmessungen und hintergrundsubtrahierte Werte bereit, die einen statistischen Vergleich experimenteller Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet Erkenntnisse aus der Grundlagenforschung mit der präklinischen Kontinuität, indem sie eine konsistente phänotypische Bewertung über verschiedene Modellsysteme hinweg sicherstellt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für Genotypisierung und Quantifizierung, die auf mehrere Gene und Mutantenlinien anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unklarheiten in Genexpressionsdaten reduziert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit durch standardisierte Protokolle für die Handhabung von Embryonen und die Bildanalyse.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem objektive Daten für die Kapitalallokation in frühen Programmphasen bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung, indem echte biologische Effekte von technischer Variabilität unterschieden werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Zebrafischembryonen, in Mikroskopie und in grundlegenden Genotypisierungstechniken.
- Benötigt eine Stereomikroskopie mit digitaler Bildgebung und Fiji-Software zur Analyse.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams hinsichtlich der Bildaufnahmebedingungen, Belichtungszeiten und der Auswahl der Hintergrundkorrekturbereiche.
- Beinhaltet Anpassungen für verschiedene Zebrafischstämme und Entwicklungsstadien.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie die Optimierung der Hintergrundkorrektur sowie die Ausschlusskriterien für Proben mit unbestimmtem Genotyp oder hohem Hintergrundrauschen.
