Eine semi-High-Throughput-Anpassung des NADH-gekoppelten ATPase-Assays zum Screening kleiner Molekülinhibitoren

Dieses Protokoll gilt für eine Breite von Screening-Projekten zur Entwicklung von ATPase-Inhibitoren, entweder als Sonden für die Grundlagenforschung oder für potenzielle klinische Verbindungen. Diese Methode wurde für Screening-Anwendungen mit hohem Durchsatz optimiert. Es wurde auch entwickelt, um mehrere gängige Artefakte zu vermeiden und es erfordert nicht den Umgang mit gefährlichen Materialien.

In unserem Labor haben wir diesen Test verwendet, um neue und spezifische nicht-muskelfreie Myosin-II-Hemmer für die Behandlung von Methamphetamin-Konsumstörungen zu entwickeln. Theoretisch kann diese Methode leicht auf alle Enzyme angewendet werden, die ATP produzieren. Visuelle Demonstration hilft, alle wichtigen technischen Details zu klären.

Zunächst 4, 500 Mikroliter 20 mikromolare verdünnte Aktinlösung für jede 384-well schwarze Polystyrol-Mikroplatte vorbereiten, indem Sie die konzentrierte Aktin-Stock-Lösung im Aktinpuffer verdünnen. Mischen Sie die Lösung gründlich, indem Sie 30 Mal nach oben und unten pipetieren, um Aktin-Filamente zu brechen, um Viskosität und Heterogenität zu reduzieren. Dann zentrifugieren Sie die Lösung, um alle gefällten Protein vorhanden zu entfernen.

Den Überstand vorsichtig in ein sauberes Zentrifugenrohr geben. Bereiten Sie den Master-Enzymmix in einem 15-Milliliter-Konifugenrohr für jede Assayplatte vor, indem Sie 3, 252,9 Mikroliter Myosinpuffer für den Test mit Skelettmuskel Myosin II, 171,4 Mikroliter LDH-Lösung und 171,4 Mikroliter PK-Lösung kombinieren. Bereiten Sie die Master-Substratmischung in einem 15-Milliliter-Konikonzentrigerohr für jede Platte vor, indem Sie 162,1 Mikroliter ATP, 162,1 Mikroliter PEP und 324,1 Mikroliter NADH-Lösung kombinieren.

Fügen Sie an dieser Stelle kein Actin hinzu, um Aggregation und Niederschlag zu vermeiden. Um siebenstufige serielle Ein-zu-zwei-Verdünnungen von NADH für die Kalibrierung zu erstellen, bereiten Sie acht 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohre vor. Mischen Sie 12,3 Mikroliter NADH-Lagerlösung mit 257,7 Mikroliter Myosinpuffer in der ersten Röhre, um eine 250 Mikromolar-Lösung zu machen.

Dann aliquot 135 Mikroliter Myosin Puffer in jedem der verbleibenden sieben Röhren. 135 Mikroliter der Lösung aus dem ersten Rohr in das zweite geben und durch Pipettieren mischen. Wiederholen Sie dies, bis Sie die siebte Röhre erreichen.

Verwenden Sie die letzte Röhre als No-NADH-Steuerung mit nur Puffer. Enthalten immer positive und negative Kontrollen auf Zusammengesetzten Platten und NADH-Verdünnungen für die Kalibrierung auf Assay-Platten. Diese Steuerelemente sind äußerst wichtig, um Artefakte während der Datenanalyse zu identifizieren.

Mit einer Achtkanalpipette 20 Mikroliter der NADH-Kalibrierlösungen in dreillütige Dreigebung in einer Assayplatte in die erste Reihe übertragen. Fügen Sie nun 4,2 Mikroliter Skelettmuskel Myosin II in den Enzymmix ein. Wirbel kurz.

Fügen Sie Myosin der Enzymmischung direkt vor dem Dosieren hinzu. Eine lange Inkubation verdünnter Myosinlösungen kann zu einem Verlust der Aktivität aufgrund von Niederschlägen und einer unspezifischen Bindung an Kunststoffoberflächen führen. Laden Sie den vorbereiteten Myosin-Enzymmix in einen der Probenbehälter eines automatischen Spenders.

Geben Sie in der Platte bis auf die erste Reihe 8,4 Mikroliter des Myosinenzyms in jeden Brunnen der Assayplatte. Legen Sie dann die Assayplatte und die Verbundplatte auf die Labware-Positionierer eines automatisierten Flüssigkeitshandhabungssystems, das mit einem 100-Nanoliter-Stiftwerkzeugkopf ausgestattet ist. Führen Sie dann die entsprechende Methode in der Software aus, um 100 Nanoliter Lösungen von der vorbereiteten Verbundplatte auf die Assayplatte zu übertragen.

Als nächstes legen Sie die Assayplatte auf einen Mikroplatten-Shaker, um eine Minute bei Raumtemperatur bei 1 200 Rpm zu schütteln. 4, 052 Mikroliter der zentrifugierten Aktinlösung kurz in die Substratmischung geben und wirbeln. Um die enzymatische Reaktion zu starten, geben Sie 11,6 Mikroliter Actinsubstrat in jeden Brunnen der Assayplatte mit einem automatischen Spender, mit Ausnahme der ersten Reihe.

Auf einem Mikroplatten-Shaker die Assayplatte eine Minute bei Raumtemperatur bei 1 200 Umdrehungen pro Minute schütteln. Zentrifugieren Sie die Assayplatte 30 Sekunden lang bei 101 mal g. Verwenden Sie einen 380-Nanometer- 10-Nanometer-Bandbreiten-Anregungsfilter und einen Emissionsfilter mit einer Bandbreite von 470 Nanometern und 24 Nanometer Bandbreite in Verbindung mit dem 425-Nanometer-Abschaltdichroic-Spiegel für die Assays.

Optimieren Sie die Anzahl der Blitze, die Detektorverstärkung, die Plattenabmessungen und die Messhöhe, bevor Sie die Tests ausführen. Führen Sie die Messung im Hochkonzentrationsmodus aus. Stellen Sie sicher, dass sich die Innentemperatur des Plattenlesers bei 25 Grad Celsius stabilisiert hat.

Laden Sie die Platte in den Plattenleser und schütteln Sie weitere 30 Sekunden, um die Form der flüssigen Oberfläche in jedem Brunnen ähnlich zu machen und die Platte die Messtemperatur erreichen zu lassen. Scannen Sie die Platte in 45-Sekunden-Intervallen und zeichnen Sie die NADH-Fluoreszenz 30 Minuten lang auf. Zeichnen Sie mit den exportierten Daten die beobachtete Fluoreszenzintensität gegen die Zeit für jeden Brunnen.

Führen Sie eine einfache lineare Regression durch, um die Neigung und das Abfangen der Fluoreszenzantworten für jeden Brunnen zu bestimmen. Die Steigung ist proportional zur NADH-Verbrauchsrate, die als sehr gute Annäherung an die ATP-Verbrauchsrate verwendet werden kann. Der Abfang ist proportional zur NADH-Konzentration zu Beginn der Messung.

Erstellen Sie dann eine Kalibrierkurve für NADH, indem Sie die für die erste Reihe der Platte erhaltenen Abschnitte gegen die Konzentration von NADH zeichnen. Die Intercepts schätzen die realen Fluoreszenzintensitäten am Anfang mit viel mehr Vertrauen, als der Durchschnitt der Rohfluoreszenzintensität am Anfang liest. Führen Sie eine einfache lineare Regression durch, um die Steigung und den Abfang der NADH-Kalibrierungslinie zu erhalten.

Hier beschreiben die Intercepts das Fluoreszenz-Hintergrundsignal ohne NADH, während die Steigung der extrapolierten theoretischen Fluoreszenzintensität einer einmolaren NADH-Lösung entspricht. Um Fluoreszenzänderungen in ATP-Verbrauchsraten umzuwandeln, dividiert die Neigung der Fluoreszenzantwort, die für den Rest der Brunnen durch die Steigung der NADH-Kalibrierlinie erhalten wird. Als nächstes werden die ATP-Verbrauchsraten gegen die Konzentration des Inhibitors aufgerechnet.

Um die hemmenden Konstanten zu bestimmen, verwenden Sie eine geeignete statistische Software, die nichtlineare Kurvenanpassung kann, wie z. B. Origin 2017. Wählen Sie nichtlineare Kurvenanpassung aus, um die Dosis-Wirkungs-Daten an eine quadratische Gleichung anzupassen, die einem einfachen Eins-zu-Eins-Bindungsgleichgewichtsmodell entspricht. Y ist die ATP-Verbrauchsrate.

Y-Minimum ist die ATP-Verbrauchsrate in Abwesenheit von Inhibitor. Y-Maximum ist die theoretische ATP-Verbrauchsrate bei 100%Hemmung. t und t sind die Gesamtkonzentration des Myosinenzyms bzw. des Inhibitors.

KI ist die hemmende Konstante. In dieser Studie zeigten Skelett- und Herzmuskelmyosin-II-ATPase-Reaktionen lineare Fluoreszenzintensitätsspuren unabhängig vom verwendeten Myosin oder dem Vorhandensein von Inhibitoren. Basale und aktinaktivierte ATPase-Raten zeigten eine lineare Abhängigkeit von der Konzentration von Skelett- oder Herzmuskelmyosin II.Ein Screening-Fensterkoeffizient oder Z-Faktor von 0,78 zeigte einen zuverlässigen Assay mit sehr gut getrennten positiven und negativen Kontrollen.

Blebbistatin, Para-Aminoblebbistatin, und Para-Nitroblebbistatin zeigten regelmäßige Dosis-Wirkungs-Kurven bei oder unter ihren gemeldeten Löslichkeitswerten. Hemmende Konstanten für Herz- und Skelettmuskelmyosin-IIs wurden bestimmt, indem eine quadratische Gleichung, die ein einfaches Gleichgewichtsbindungsmodell darstellt, an die Daten anpasste. Fluoreszenzintensitätsspuren für Blebbistatin, die in einem ATPase-Assay mit Skelettmuskel Myosin II erhalten wurden, zeigten ein normales linear abnehmendes Signal, abhängig von der Menge des vorhandenen Inhibitors.

Jedoch, über der Löslichkeit von Blebbistatin wurde eine unerwartete Zunahme des Signals am ehesten aufgrund der Bildung von hell blühenden Blebbistatin-Kristallen beobachtet. Bei Para-Nitroblebbistatin mit normalen Rohfluoreszenzintensitätsspuren unterschieden sich die über Löslichkeit erhaltenen Reaktionsraten aufgrund von Niederschlag von der ermittelten Dosis-Wirkungs-Kurve. Mit dieser Methode haben wir neue, potente und selektive Myosininhibitoren entwickelt, die in Zukunft als wissenschaftliche Instrumente in der Grundlagenforschung oder als Direktkandidaten eingesetzt werden könnten.

Es wird immer empfohlen, einen anderen ATPase oder einen anderen funktionellen Assay zu verwenden, der spezifisch für das Enzym von Interesse ist, um zwischen realen und falsch positiven Treffern zu unterscheiden. Alle Proteine binden Kunststoffoberflächen. Dieses Problem kann die Ergebnisse stark beeinflussen, vor allem, wenn das Protein in niedrigen Konzentrationen vorhanden ist.

Vermeiden Sie immer unnötige Flüssigkeitshandhabung und verwenden Sie unverbindliche Schläuche. Alternative ATPase-Assays erfordern in der Regel den Umgang mit Schwefelsäure, toxischen Substanzen oder radioaktiven Stoffen. Im Gegensatz dazu benötigt der NADH-gebundene ATPase-Assay reagenzien nur ohne oder nur mit sehr geringer Toxizität.