Name: Eine Methode zur Untersuchung der de novo Bildung von Chromatin-Domänen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Erfahren Sie eine Methode zur Untersuchung der de novo Bildung von PRC2-vermittelten Chromatin-Domänen in Maus-Embryonalstammzellen mittels CRISPR/Cas9. Dieses System ermöglicht die Echtzeit-Analyse dynamischer chromatischer Veränderungen.

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Wir danken Drs. L. Vales, D. Ozata und H. Mou für die Überarbeitung des Manuskripts. Das D.R. Lab wird vom Howard Hughes Medical Institute und den National Institutes of Health (R01CA199652 und R01NS100897) unterstützt.

Generierung induzierbarer EED-Rettungs-MESCs
1. Zellkultur
<ol><li>Verwenden Sie feederfreie C57BL/6-Maus-Embryonale Stammzellen (mESCs), die ein stabil integriertes CreERT2-Transgen besitzen, das sich bei Verabreichung von 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)13in den Kern transortieren kann.</li>
	<li>Wachsen Sie mESCs in konventionellen ESC-Medium14,15, ergänzt mit 1000 U/mL LIF, 1 M ERK-Hemmer PD0325901 und 3 M GSK3-Hemmer CHIR99021. Für herkömmliches ESC-Medium verwenden Sie Knockout DMEM mit 15% fetalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 1X Penicillin/Streptomycin und 0,1 mM 2-Mercaptoethanol.</li>
	<li>Verwenden Sie Platten, die mit 0,1% Gelatinelösung für die Kultivierung von mESCs beschichtet sind.</li>
</ol>2. Erzeugung von klonalen EED Knockout (KO) mESCs
<ol><li>Entwurfsanleitung RNAs (gRNAs), um Exon 10 und Exon 11 der endogenen Kopie von EED in mESCs mit dem CRISPR-Designtool in Benchling16zu löschen. EED-KO-gRNA-1 zielt unmittelbar vor Exon 10 auf das Intron und EED-KO-gRNA-2 auf das Intron unmittelbar flussabwärts von Exon 11. Die gleichzeitige Anwendung dieser gRNAs löscht sowohl Exon 10 als auch Exon 11 durch nicht-homologe Endverbindung (NHEJ).</li>
	<li>Klonen Sie gRNAs in pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) mit Anweisungen in Ran et al., 201317.</li>
	<li>In einem 6-Well-Plattenformat transfekieren Sie 2 x 105 mESCs mit je 1 mg EED-KO-gRNA-1 und EED-KO-gRNA-2 (siehe Materialtabelle) unter Verwendung von Transfektionsreagenz, indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen. Ändern Sie das Medium 24 h nach der Transfektion.</li>
	<li>Zwei Tage nach der Transfektion isolieren GfP-positive Zellen mit Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS). Erwarten Sie, dass die Transfektionseffizienz um 10-30 % variiert. Sortieren Sie etwa 5 x 105 Zellen, um genügend GFP-positive Zellen für die Beschichtung zu erfassen.</li>
	<li>Die isolierten GFP-positiven mESCs in 15 cm Platten vorbeschichtet mit 0,1% Gelatine (10-20 x103 Zellen pro Platte) für die Koloniekommissionierung.</li>
	<li>Wachsen Sie die Zellen im ESC-Medium für etwa eine Woche, bis einzelne Kolonien sichtbar sind. Wechseln Sie die Medien alle 2 Tage.</li>
	<li>Wählen Sie mindestens 48 Kolonien mit 20 L Mikropipette Spitze. Schrott über die Kolonie, während in die Mikropipette Spitze zu aspirating. Zerteilen Sie die Kolonie nicht in einzelne Zellen. Übertragen Sie die Kolonie in eine accutase-haltige (20 ml) 96 Brunnenplatte.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Kolonien 10 min bei 37 °C, bis alle Zellen getrennt sind.</li>
	<li>Fügen Sie 200 ml ESC-Medien in jeden Brunnen mit Mehrkanal-Pipette.</li>
	<li>Mischen Sie die Zellen gut und verblechen Sie die Zellen in zwei separate 96 Brunnenplatten mit Mehrkanal-Pipette.</li>
	<li>Verwenden Sie eine der 96 Brunnenplatten für die Genotypisierung und halten Sie die andere wachsen, bis die Genotypisierung abgeschlossen ist. Verwenden Sie DNA-Extraktionslösung, um DNA aus der 96-Well-Platte zu extrahieren, indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen.</li>
	<li>Verwenden Sie genotypisierende Primer Gnt_EED-KO-up und Gnt_EED-KO_down, die die gelöschte Seite umfassen und die Genotypisierung szieren PCR mit Taq DNA Polymerase nach den Anweisungen des Herstellers durchführen. HINWEIS: Andere Arten von DNA-Polymerasen können auch für die Genotypisierung verwendet werden, jedoch bietet Taq DNA-Polymerase Komfort, da die PCR-Reaktion direkt auf ein Gel geladen werden kann, wenn sein farbiger Reaktionspuffer verwendet wird.<ol>
<li>Beobachten Sie ein DNA-Produkt mit geringerem Molekulargewicht in Zellen mit einer homozygoten Deletion relativ zum Wildtyp-Fall (WT). ANMERKUNG: Um PRC2-Nullzellen zu erzeugen, ist die homozygote Löschung der Exons 10 und 11 notwendig, um EED zu destabilisieren und zu degradieren, eine wesentliche Untereinheit des Kerns PRC213. Die CRISPR-Zieleffizienz beträgt rund 10 %.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Validieren Sie die Löschung von EED exon 10 und 11 und den Verlust von EED-Protein durch Sanger-Sequenzierung bzw. Western Blotting.</li>
	<li>Bestätigen Sie die Erschöpfung von EED und H3K27me2/me3 aus Chromatin in EED KO-Zellen durch ChIP-seq unter Verwendung von Antikörpern gegen H3K27me2/me3 und EED. Verwenden Sie das Protokoll in Oksuz et al., 201715 für ChIP-seq-Experimente.</li>
</ol>3. Entwicklung der EED-Knockout-mESCs für Cre-ERT2-basierte induzierbare EED-Expression
<ol><li>Entwerfen Sie gRNA (EED-gRNA-inducible), um einen Schnitt innerhalb des intron folgenden Exons 9 von EED mit dem CRISPR-Design-Tool in Benchling16 einzuführen (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Klonen Sie gRNAs in pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) mit Anweisungen in Ran et al., 201317.</li>
	<li>Entwerfen Sie eine Spender-Vorlagen-DNA, die EED-cDNA-Sequenz nach Exon 9 und ein C-terminales Flag-HA-Tag vor einer T2A-GFP-Sequenz umfasst, alles in umgekehrter Ausrichtung in Bezug auf die endogene Gensequenz.<ol>
<li>Flankieren Sie die Kassette mit einem Spleiß-Akzeptor und einer Polyadenylierungssequenz, die zwischen heterologen invertierten LoxP-Standorten (lox66 und lox71) verschachteltist 18.</li>
		<li>Schließen Sie mindestens 500 bp Homologiearme von jedem Ende ein. Teilen Sie die Spendervorlage in 2 Segmente von gBlocks-Genfragmenten auf (siehe gBlock-1, gBlock-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" und gBlock-2-Käfigmut "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") und montieren Sie sie in PCR Blunt Vektor mit Gibson Klonen nach den Anweisungen des Herstellers. HINWEIS: gblock-2 enthält einen aromatischen Rückstand (Y365) im EED-Käfig, der für die Interaktion mit H3K27me312wichtig ist. gBlock-2-Wt enthält Wildtyprückstände, während gblock-2-cage-mutant die Käfigmutante eED (Y365A) enthält, die nicht an H3K27me3 gebunden werden kann. Induzierbare WT EED Rettung wird als i-WT-r bezeichnet und induzierbare Käfig-mutierte EED-Rettung wird als i-MT-r aus Bequemlichkeit bezeichnet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>In einem 6-Well-Plattenformat transfekieren Sie 2 x 105 mESCs mit 1 mg der gRNA (EED-gRNA-inducible) und 1 mg der Spenderschablonen (i-WT-r oder i-MT-r) mit Transfektionsreagenz und isolieren GFP-positive Zellen mit FACS.</li>
	<li>Befolgen Sie die Schritte 2.3-2.11, um einzelne Kolonien zu isolieren, die für die Genotypisierung bereit sind, um eine erfolgreiche Ausrichtung zu haben.</li>
	<li>Verwenden Sie Genotypisierungsprimer Inducible_Genotype-FW-1 und Inducible_Genotype-REV-1, die die eingelegte Kassette überspannen und genotypisierende PCR mit Taq DNA-Polymerase durchführen. HINWEIS: Die Targeting-Effizienz für CRISPR beträgt etwa 10 %.<ol>
<li>Bestätigen Sie die korrekte Integration der Kassette per PCR mit Inducible_Genotype-FW-2 und Inducible_Genotype-REV-2 Primern, die außerhalb der Homologiearme liegen. HINWEIS: Die homozygote Integration der Kassette ist notwendig, um eine effiziente Rettung von EED zu erreichen. Beachten Sie, dass Zellen mit homozygoter Integration ein einziges großes DNA-Produkt im Vergleich zu WT EED produzieren, das ein kurzes Produkt produziert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bestätigen Sie die Integration der Kassette durch Sanger-Sequenzierung.</li>
	<li>Bestätigen Sie das Umblättern der Kassette und den Ausdruck von EED und anderen PRC2-Kernkomponenten (z. B. EZH2 und SUZ12) bei 4-OHT-Verwaltung durch Western Blotting.</li>
	<li>Bestätigen Sie die Expression von T2A-GFP und den Prozentsatz des Flip-by-Flow-Zytometrie. Beachten Sie, dass die Expression von GFP auf das Umdrehen der Kassette und den Ausdruck von EED hindeutet.</li>
</ol>4. Nach Keimbildung und Verbreitung der PRC2-Aktivität auf Chromatin
<ol><li>Bestätigen Sie, dass i-WT-r und i-MT-r mESCs keine undichte Expression von GFP durch Durchflusszytometrie haben. Im Falle einer undichten Expression von GFP, isolieren GFP-negative Zellen durch FACS vor Beginn des Experiments.</li>
	<li>Erweitern Sie die mESCs i-WT-r und i-MT-r in fünf 15 cm Platten (5x 106 Zellen pro Platte).</li>
	<li>Induzieren Sie die Expression von WT oder Käfig-mutierteem EED durch Verabreichung von 0,5 mM 4-OHT für 0 h, 12 h, 24 h, 36 h und 8 Tage (eine 15 cm Platte pro Zustand). Wechseln Sie das Medium nach 12 h für Behandlungen länger als 12 h. Isolieren Sie die erfolgreich rekombinierten Zellen durch FACS mit GFP. Passen Sie die Zeit der Behandlungen so an, dass alle Bedingungen auf einmal gesammelt werden.</li>
	<li>Führen Sie ChIP-seq für H3K27me2, H3K27me3 durch, um ihre zeitliche Ablagerung an Chromatin als Reaktion auf die Wiederexpression von WT oder Käfig-mutiertem EED zu untersuchen. Verwenden Sie das ChIP-seq-Protokoll einschließlich der Bibliotheksvorbereitung, die in Oksuz et al., 201715beschrieben ist.</li>
	<li>Verwenden Sie die Spike-in-Steuerung in jeder Stichprobe, um einen quantitativen Vergleich zwischen verschiedenen Zeitpunkten19zu ermöglichen.<ol>
<li>Für die Spike-in-Kontrolle verwenden Sie Chromatin von Drosophila melanogaster (im Verhältnis 1:50 zum mESC-abgeleiteten Chromatin) sowie Drosophila-spezifischem H2Av-Antikörper (1 l H2Av-Antikörper pro 4 g Drosophila-Chromatin nach Herstelleranweisungen) in jeder Probe.</li>
		<li>Bereiten Sie das Chromatin von Drosophila ähnlich wie von mESCs mit dem Protokoll in Oksuz et al., 201715.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ordnen Sie die Sequenz für ChIP-seq bis mm10 Genom mit Bowtie 2 mit Denisstandardparametern20.</li>
	<li>Normalisieren Sie die Maus ChIP-seq liest zu spike-in Drosophila Lesezählt21. Berechnen Sie den Spike-in-Normalisierungsfaktor mit der folgenden Formel: 1 x 106/eindeutige Drosophila-Lesezahlen. Erwarten Sie etwa 1 x 106Drosophila Lesezahlen und 20 x 106 Maus Lesezahlen pro Experiment zu bekommen.<ol>
<li>Fügen Sie das Drosophila-Chromatin bei der Sequenzierung der Eingangsproben nicht ein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie genomecov Werkzeug von Bettwerkzeugen, um Bam-Datei in Bettgraph22zu konvertieren. Als nächstes, konvertieren Sie die bettgraph in bigwig Datei mit bedGraphToBigWig Werkzeug von USCS23,24. Siehe das folgende Skript: gen="Pfad zum mm10-Genom" chr="Pfad zu mm10 Chromosomengrößen" inp_bam="pfad zur Eingabe bam-Datei " multiply="berechnen Sie den Spike-in-Normalisierungsfaktor" betttools genomecov -bg -scale $multiply -ibam $inp_bam -g $gen > output.bedGraph sortieren -k1,1 -k2,2n output.bedGraph > output_sorted.bedGraph bedGraphToBigWig output_sorted.bedGraph $chr output.bw
</li>
	<li>Visualisieren Sie die ChIP-seq Lesedichten, indem Sie die bigwig-Dateien auf den USCS-Genombrowser24hochladen.</li>
</ol>5. Überwachung der Entstehung und des Wachstums der H3K27me3-Schwerpunkte in den mESCs-Kernen
<ol><li>Platte 1x 104 mESCs in 8-Well-Kammer-Dias vorbeschichtet mit 0,1% Gelatine.</li>
	<li>Am nächsten Tag beginnen Sie mit der Durchführung aufeinander folgender 4-OHT-Induktionen (0,5 mM), um die Zellen zu sammeln, die EED für angegebene Zeitpunkte (0 h, 12 h, 24 h und 36 h) exemiten. Wechseln Sie das Medium nach 12 h für Behandlungen länger als 12 h.</li>
	<li>Fixieren Sie die mESCs mit 4% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Saline (PBS) bei Raumtemperatur (RT) für 10 min.</li>
	<li>Permeabilisieren Sie die Zellen mit PBS/0,25% Triton X-100 bei RT für 30 min.</li>
	<li>Blockieren Sie die Zellen mit PBS/5% Eselserum/0,1% Triton X-100 (Sperrpuffer) bei RT für 30 min.</li>
	<li>H3K27me3 Primärantikörper 1:500 im Sperrpuffer verdünnen und den Zellen hinzufügen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen mit primärem Antikörper über Nacht bei 4 °C.</li>
	<li>Führen Sie am nächsten Tag 3 Wässen mit PBS/0,1% Triton X-100 durch.</li>
	<li>Sekundärantikörper (Alexa fluor 595) 1:1000 im Sperrpuffer verdünnen und zellenverstärken.<ol>
<li>Führen Sie alle Inkubationen im Dunkeln in den folgenden Schritten durch, da sekundäre Antikörper, die mit Alexa Fluor konjugiert sind, lichtempfindlich sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie den sekundären Antikörper für 2 h bei RT.</li>
	<li>Führen Sie 3 Wässen mit PBS/0.1% Triton X-100 durch.</li>
	<li>DAPI (1 mg/ml) 1:4000 mit PBS/0,1% Triton X-100 verdünnen und zellenverstärken.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen mit DAPI für 10 min bei RT.</li>
	<li>Montieren Sie die Zellen mit Aqua-Halterung.</li>
	<li>Stellen Sie die Zellen mit konfokaler Mikroskopie bei 63-facher Vergrößerung ab.</li>
	<li>Verarbeiten und Pseudo-Farbe der Bilder mit einer Verteilung von ImageJ, Fidschi25.</li>
</ol>

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<li>Højfeldt, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+H3K27+methylation+can+be+established+de+novo+by+SUZ12-directed+PRC2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).</li>
</ol>

D.R. ist Mitbegründer von Constellation Pharmaceuticals und Fulcrum Therapeutics. Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Ein kraftvoller Ansatz, um die mechanistischen Details während der Bildung einer bestimmten Chromatin-Domäne zu verstehen, besteht darin, zuerst die Domäne zu stören und dann ihre Rekonstruktion in den Zellen zu verfolgen. Der Prozess kann jederzeit während der Rekonstruktion angehalten werden, um die laufenden Ereignisse im Detail zu analysieren. Frühere Studien an Chromatin-Domänen waren nicht in der Lage, solche Ereignisse zu lösen, wie sie unter stationären Bedingungen durchgeführt wurden (z. B. Vergleich von Wildtyp...

Eukaryotische Genome sind hoch gradig organisiert und Veränderungen in der Chromatin-Zugänglichkeit steuern direkt die Gentranskription1. Das Genom enthält verschiedene Arten von Chromatin-Domänen, die mit transkriptionaler Aktivität und Replikationtiming2,3korrelieren. Diese Chromatin-Domänen reichen von wenigen Kilobasen (kb) bis zu mehr als 100 kb und zeichnen sich durch eine Bereicherung in unterschiedlichen Histonmodifikationenaus 4. Die zentralen Fragen sind: Wie werden diese Domänen gebildet und wie werden sie propagiert?
Eine der am besten charakterisierten Chromatin-Domänen wird durch die Aktivität des Polycomb-Repressionskomplexes 2 (PRC2) gefördert. PRC2 ist ein Komplex mit mehreren Untereinheiten, der aus einer Teilmenge der Polycomb-Gruppe (PcG) der Proteine5,6besteht und die Mono-, Di- und Trimethylierung von Lysin 27 des Histons H3 (H3K27me1/me2/me3)7,8, 9,10. H3K27me2/me3 sind mit einem repressiven Chromatinzustand verbunden, aber die Funktion von H3K27me1 ist unklar6,11. Eine der Kernkomponenten der PRC2, die embryonale Ektodermentwicklung (EED), bindet durch ihren aromatischen Käfig an das Endprodukt der PRC2-Katalyse, H3K27me3, und diese Funktion führt zur allosterischen Stimulation von PRC212,13. Die enzymatische Aktivität der VR China ist entscheidend für die Erhaltung der zellulären Identität während der Entwicklung, da die unangemessene Expression bestimmter Entwicklungsgene, die für eine bestimmte Abstammung kontraindiziert sind, schädlich wäre5,6 . Daher ist die Auflösung der Mechanismen, mit denen PRC2 die Bildung repressiver Chromatindomänen bei Säugetieren fördert, von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der zellulären Identität.
Alle bisherigen experimentellen Systeme zur Untersuchung der Chromatin-Domänenbildung einschließlich PRC2-vermittelter Chromatin-Domänen wurden unter stationären Bedingungen durchgeführt, die nicht in der Lage sind, die sich entfaltenden Ereignisse der Chromatin-Domänenbildung in Zellen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung eines induzierbaren Zellsystems vor, das die anfängliche Rekrutierung und Verbreitung von Chromatin-Domains überwacht. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die Verfolgung der Bildung von PRC2-vermittelten repressiven Chromatin-Domänen, die H3K27me2/3 umfassen. Dieses System, das die mechanistischen Details der Chromatin-Domänenbildung erfassen kann, könnte angepasst werden, um andere Chromatin-Domänen zu integrieren, wie die weithin untersuchten Domänen, die entweder H2AK119ub oder H3K9me umfassen. In Kombination mit Genomik- und Bildgebungstechnologien hat dieser Ansatz das Potenzial, verschiedene, zentrale Fragen der Chromatinbiologie erfolgreich anzugehen.

<table><tbody><tr><td>(Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg)</td><td>Sigma</td><td>H7904-5MG</td><td>Zur Induktion der EED-Expression</td></tr><tr><td>16%ige wässrige Paraformaldehyd-Lösung (10x10 ml)</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15710</td><td>Für Immunfluoreszenz</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>LifeTechnologies</td><td>21985-023</td><td>Für mES-Kultur</td></tr><tr><td>2%ige Gelatinelösung</td><td>Sigma</td><td>G1393-100ml</td><td>Für mESCs Kultur</td></tr><tr><td>Accutase 500 ML</td><td>Innovative Cell Tech/FISHER</td><td>AT 104-500</td><td>Für mES-Kultur</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson immunoresaerch</td><td>711-585-152</td><td>Für Immunfluoreszenz</td></tr><tr><td>Aqua-Mount Eindeckmedium</td><td>FISHER/VWR</td><td>41799-008</td><td>Für Immunfluoreszenz</td></tr><tr><td>CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK</td><td>Fisher Sci</td><td>177445PK</td><td>Für Immunfluoreszenz-DAPI</td></tr><tr><td>(4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid) - 10 mg</td><td>Life Tech</td><td>D1306</td><td>Für Immunfluoreszenz-ERK-Inhibitoren</td></tr><tr><td>, PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006</td><td>Für mES-Kultur</td></tr><tr><td>ESGRO Rekombinantes Maus-LIF-Protein</td><td>Millipore/Fisher</td><td>ESG1107</td><td>Für mES-Kultur-FBS-Stammzell-qualifizierte</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Atlanta S10250</td><td>Für mES-Kultur</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>Für die Klonierung von Spender-Templates</td></tr><tr><td>GSK3-Inhibitor, CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>Für mESCs-Kultur</td></tr><tr><td>H3K27me2 (D18C8) Kaninchen mAB</td><td>Zellsignalisierung</td><td>9728S</td><td>Antikörper für ChIP-seq</td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Zellsignalisierung</td><td>9733S</td><td>Antikörper für ChIP-seq</td></tr><tr><td>Histon H2Av Antikörper (pAb)</td><td>Aktives Motiv</td><td>39715</td><td>Spike-in-Kontrolle für ChIP-seq</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td><td>Für mES-Kultur</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>Für mES-Kultur</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>LifeTech</td><td>11668019</td><td>Für die Transfektion</td></tr><tr><td>MangoTaq DNA-Polymerase</td><td>Bioline</td><td>BIO-21079</td><td>Für die Genotypisierung</td> PCR</tr><tr><td>Normales Eselsserum (10 mL)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>Für Immunfluoreszenz</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma/Roche</td><td>P0781</td><td>Für mES-Kultur</td></tr><tr><td>pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)</td><td>Addgene</td><td>48138</td><td>Für die gRNA-Klonierung</td></tr><tr><td>QuickExtract DNA-Extraktionslösung</td><td>Lucigen</td><td>QE0905T</td><td>Für die Genotypisierung PCR</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Zero Blunt PCR Klonierungskit</td><td>Thermo</td><td>Fisher K270020</td><td>Für die Klonierung von Spender-Templates</td></tr><tr><td>Primers/gBlocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EED-KO-gRNA-1</td><td></td><td></td><td>Sequenz: ctctggctactgtcaactag. gRNAs paaren sich mit Knockout-EED in C57BL/6 ESCs für i-WT-r- und i-MT-r-Systeme.</td></tr><tr><td>EED-KO-gRNA-2-Sequenz</td><td></td><td></td><td>: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs paaren sich mit Knockout-EED in C57BL/6 ESCs für i-WT-r und i-MT-r Systeme.</td></tr><tr><td>EED-gRNA-induzierbare</td><td></td><td></td><td>Sequenz: atggcaccccgaaattagaa. gRNA und Donor zur Erzeugung eines i-WT-r-Systems im EED-KO-Hintergrund.</td></tr><tr><td>i-WT-r Spender</td><td></td><td></td><td>https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA und Spender zur Erzeugung des i-WT-r-Systems im EED-KO Hintergrund.</td></tr><tr><td>EED-gRNA-induzierbare</td><td></td><td></td><td>Sequenz: atggcaccccgaaattagaa. gRNA und Donor zur Erzeugung eines i-WT-r-Systems im EED-KO-Hintergrund.</td></tr><tr><td>i-MT-r-Spender</td><td></td><td></td><td>https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA und Spender zur Erzeugung des i-MT-r-Systems im EED-KO-Hintergrund.</td></tr><tr><td>Genotypisierungsprimer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gnt-EED-KO-FW-1</td><td></td><td></td><td>Sequenz: ctgtaggctgccatctgtga. Das Wildtyp-Allel erzeugt ein Produkt von 1,9 kb. Das Knockout-Allel produziert ein Produkt von 200 bp.</td></tr><tr><td>Gnt-EED-KO-REV-1</td><td></td><td></td><td>Sequenz: agccagggctacacagagaa. Das Wildtyp-Allel erzeugt ein Produkt von 1,9 kb. Das Knockout-Allel produziert ein Produkt von 200 bp.</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-FW-1</td><td></td><td></td><td>Sequenz: tgcagtgaaacaaatttggaa. Wenn die Kassette eingesetzt wird, erzeugen die Zündhütchen 1863 bp. Das Wildtyp-Allel erzeugt ein Produkt von ~200 bp.</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-REV-1</td><td></td><td></td><td>Sequenz: gagaggggtggcactgtaaa. Wenn die Kassette eingesetzt wird, erzeugen die Zündhütchen 1863 bp. Das Wildtyp-Allel erzeugt ein Produkt von ~200 bp.</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-FW-2</td><td></td><td></td><td>Sequenz: ccccctctttctccttttct. Wenn die Kassette eingesetzt wird, erzeugen die Zündhütchen 3200 bp. Das Wildtyp-Allel erzeugt ein Produkt von 1560 bp.</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-REV-2</td><td></td><td></td><td>Sequenz: atgcctgggtgaatgaaaaa. Wenn die Kassette eingesetzt wird, erzeugen die Zündhütchen 3200 bp. Das Wildtyp-Allel erzeugt ein Produkt von 1560 bp.</td></tr></tbody></table>

eine methode zur untersuchung der de novo bildung von chromatin-domänen

A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains

Die Organisation und Struktur von Chromatindomänen ist für einzelne Zelllinien einzigartig. Ihre Fehlregulation könnte zu einem Verlust der zellulären Identität und/oder Krankheit führen. Trotz enormer Anstrengungen ist unser Verständnis der Bildung und Verbreitung von Chromatin-Domänen immer noch begrenzt. Chromatin-Domänen wurden unter stationären Bedingungen untersucht, die nicht förderlich für die Verfolgung der ersten Ereignisse während ihrer Einrichtung sind. Hier stellen wir eine Methode vor, um Chromatin-Domänen induduziert und deren Neubildung als Funktion der Zeit zu verfolgen. Obwohl, zuerst auf den Fall der PRC2-vermittelten repressiven Chromatin-Domänenbildung angewendet, könnte es leicht an andere Chromatin-Domänen angepasst werden. Die Modifikation und/oder Kombination dieser Methode mit Genomik- und Bildgebungstechnologien wird unschätzbare Werkzeuge liefern, um die Etablierung von Chromatin-Domänen im Detail zu untersuchen. Wir glauben, dass diese Methode unser Verständnis davon revolutionieren wird, wie Chromatin-Domänen sich bilden und miteinander interagieren.

Ein allgemeines Schema des bedingten Rettungssystems Abbildung 1 zeigt das Targeting-Schema zur bedingten Rettung von EED-KO-Zellen mit entweder WT- oder Käfigmutant (Y365A) EED, das aus dem endogenen EED-Lokus exprimiert wird. Nach dem Knocking out EED, einer Kernuntereinheit von PRC2, die für ihre Stabilität und enzymatische Aktivität unerlässlich ist, wird eine Kassette innerhalb des intron folgenden Exon s 9 von EED eingeführt (Abbildung 1</strong...

Diese Methode wurde entwickelt, um der Bildung von PRC2-vermittelten Chromatindomänen in Zelllinien zu folgen, und die Methode kann an viele andere Systeme angepasst werden.

Eine Methode zur Untersuchung der de novo Bildung von Chromatin-Domänen

The organization and structure of chromatin domains are unique to individual cell lineages. Their misregulation might lead to a loss in cellular identity ...

Wir skizzieren ein System zur Bewertung der dynamischen Bildung von Chromatin-Domänen. Wir nutzen dieses System, um die Rekrutierung und Verbreitung von PRC2-vermittelten Chromatin-Domänen in Zellen zu verfolgen. Der Prozess kann jederzeit angehalten werden, um die laufenden Ereignisse zu analysieren.Dieses System könnte darauf ausgerichtet sein, dynamische Veränderungen in einem bestimmten zellulären Prozess zu überwachen und ist daher nicht auf die Verfolgung der Bildung von Chromatin-Domänen beschränkt. Beginnen Sie mit dem Entwurf von Guide RNAs, um Exon 10 und 11 einer endogenen Kopie der embryonalen Ektodermentwicklung (EED) in embryonalen Stammzellen der Maus mit dem CRISPR Design Tool zu löschen. Klonen Sie die Guide RNAs in das CRISPR/Cas9-Plasmid gemäß Manuskriptanweisungen.In einem Sechs-Well-Plattenformat transfekt 200 000 mausembryonale Stammzellen oder mESCs mit einem Mikrogramm jeder Führungs-RNA mit Transfektionsreagenzien gemäß herstellerspezifischen Anweisungen. Wechseln Sie das Medium 24 Stunden nach der Transfektion. Zwei Tage nach der Transfektion gfP-positive Zellen mit FACS isolieren.Die Transfektionseffizienz reicht von etwa 10 bis 30%, also sortieren Sie etwa 500.000 Zellen, um genügend GFP-positive Zellen für die Beschichtung zu erfassen. Die isolierten GFP-positiven Zellen in 15-Zentimeter-Platten vorschichten, die mit 0,1% Gelatine für die Koloniepfierung vorbeschichtet sind. Wachsen Sie die Zellen im ESC-Medium für etwa eine Woche, bis einzelne Kolonien sichtbar sind, und stellen Sie sicher, dass die Medien alle zwei Tage wechseln.Wählen Sie mindestens 48 Kolonien, indem Sie eine 20-Mikroliter-Pipettenspitze verwenden, um während des Ansaischens über die Kolonie zu kratzen. Ohne die Kolonie in einzelne Zellen aufzuteilen, übertragen Sie sie auf eine Accutase-haltige 96-Well-Platte. Inkubieren Sie die Kolonien bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten, um die Zellen zu dissoziieren.Dann fügen Sie 200 Mikroliter ESC-Medien zu jedem Brunnen mit einer Mehrkanalpipette. Gut mischen und die Zellen in zwei separate 96-Well-Platten unterteilen. Verwenden Sie eine der Platten für die Genotypisierung, und halten Sie die andere wachsen, bis genotypisieren abgeschlossen ist.Extrahieren Sie DNA aus der Platte mit kommerziellen Reagenzien und nach den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie Genotypisierungsprimer, die die gelöschte Seite überspannen, um genotypisierende PCR mit Taq-DNA-Polymerase durchzuführen. Beobachten Sie ein DNA-Produkt mit geringerem Molekulargewicht in Zellen mit einer homozygoten Deletion relativ zu den Wildtypzellen.Design-Leitfaden-RNA, um einen Schnitt innerhalb des Introns nach Exon 9 von EED mit einem CRISPR Design Tool einzuführen und ihn gemäß Manuskriptanweisungen in das CRISPR/Cas9-Plasmid zu klonen. Entwerfen Sie eine Spender-Vorlagen-DNA, die die EED-cDNA-Sequenz nach Exon 9 und ein C-terminales Flag-HA-Tag vor einer T2A-GFP-Sequenz enthält, alles in umgekehrter Ausrichtung in Bezug auf die endogene Gensequenz. Flankieren Sie die Kassette mit einem Spleiß-Akzeptor und einer Polyadenylierungssequenz, die zwischen heterologen invertierten LoxP-Standorten verschachtelt ist, und schließen Sie mindestens 500 Basispaare von Homologiearmen von jedem Ende ein.Teilen Sie die Spendervorlage in zwei Segmente von gBlocks Gene Fragments auf und montieren Sie sie mithilfe des Gibson-Klonens gemäß den Anweisungen des Herstellers in einen PCR Blunt-Vektor. In einem Sechs-Well-Plattenformat transfekt man 200 000 mESCs mit einem Mikrogramm der Führungs-RNA und einem Mikrogramm der Spendervorlagen. Isolieren Sie dann GFP-positive Zellen mit FACS.Isolieren Sie einzelne Kolonien für die Genotypisierung nach Manuskriptrichtungen. Verwenden Sie die Durchflusszytometrie, um zu bestätigen, dass die mESCs keine undichte Expression von GFP haben, und isolieren Sie, falls dies der Fall ist, GFP-negative Zellen durch FACS, bevor Sie mit dem Experiment beginnen. Erweitern Sie die Zellen in fünf 15-Zentimeter-Platten und induzieren Sie die Expression von Wildtyp oder Käfig-mutiertem EED, indem Sie 5-Mikromolar 4-Hydroxytamoxifen für fünf verschiedene Zeitdauern von null Stunden bis zu acht Tagen verabreichen.Wechseln Sie die Medien nach 12 Stunden für Behandlungen, die länger als das dauern. Isolieren Sie die erfolgreich rekombinierten Zellen durch FACS mit GFP, und führen Sie ChIP-seq für H3K27me2 und H3K27me3 durch, um ihre zeitliche Ablagerung an Chromatin als Reaktion auf die Wiederexpression ungezügelter oder käfigmutierter EED zu untersuchen. Zur Validierung der induzierbaren Wildtyp-Rettungs- und induzierbaren mutierten Rettungssysteme wurde westlicher Blot nach Induktion von Wildtyp- oder Käfigmutanten EED mit 4-Hydroxytamoxifen-Behandlung an ganzen Extrakten durchgeführt.Die Durchflusszytometrie-Analyse wurde verwendet, um die Effizienz der T2A-GFP-Expression in i-WT-r-Zellen vor und nach der 4-Hydroxytamoxifen-Behandlung zu bestätigen, was das erfolgreiche Flip der invertierten Kassette demonstriert. ChIP-seq von H3K27me3 wurde nach Wiederexpression von Wildtyp oder Käfig-mutant EED durchgeführt. Die Entstehung von H3K27me3 wird 12 Stunden nach der Wilden-Typ-EED-Expression an diskreten Keimbildungsstellen und dann 24 Stunden in Regionen beobachtet, die von den ursprünglichen Keimbildungsstätten entfernt sind.ChIP-seq wurde auch verwendet, um die zeitliche Ablagerung von H3K27me2 zu verfolgen, die H3K27me3 Ablagerung vorausgehen scheint. Die H3K27me3-Schwerpunkte und ihr Wachstum wurden ebenfalls mit Fluoreszenzmikroskopie visualisiert. Nach 12 Stunden Wildtyp EED-Expression gibt es Hinweise auf H3K27me3 Foci Bildung.Diese Brennpunkte nehmen um 24 Stunden zu und breiten sich schließlich um 36 Stunden auf große Regionen des Kerns aus. Die genaue Konstruktion von DNA-Konstrukten ist sehr wichtig, um das gewünschte induzierbare Rettungssystem zu erzeugen. Diese Methode kann eine zeitliche und spezielle Kontrolle von Mutationen von Proteinen bei Mäusen bieten.Auf diese Weise könnte man die Wirkung von Mutationen in einem bestimmten Gewebe oder in einem bestimmten Entwicklungsstadium bestimmen. Wir verwenden derzeit dieses System, um die dynamische Etablierung einer anderen Chromatin-Domäne zu überwachen, Polycomb repressiven Komplex 1.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Dieses Video beschreibt das Protokoll für die Chromatinscherung mittels enzymatischem Mikrokokken-Nuklease-Verdau. Die Chromatinscherung ist ein wesentlicher Schritt im Chromatin-Immunpräzipitations- oder ChIP-Workflow, der zur Untersuchung der Protein-DNA-Interaktion in menschlichen chronischen myeloischen Leukämiezellen beiträgt. Im Feature-Protokoll wird die Chromatinscherung mittels Beschallung durchgeführt.

Chromatinscherung: Eine Methode zur Erzeugung von Chromatinfragmenten mittels enzymatischem Verdau

Die Frage, wie Chromatin Regulierungsbehörden und Chromatin-Staaten betreffen das Genom in vivo ist der Schlüssel zum Verständnis, wie frühe Zellschicksal Entscheidungen werden in den sich entwickelnden Embryo gemacht. ChIP-Seq-die beliebteste Ansatz zur Chromatin Funktionen auf globaler Ebene, wird hier für Xenopus Embryonen beschrieben untersuchen.

Genomweite Snapshot von Chromatin Regulierungsbehörden und Staaten in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonen von ChIP-Seq

Sequentielle Salzgewinnung gebunden Chromatin Proteine ist ein nützliches Werkzeug für die Bestimmung der Bindungseigenschaften von großen Proteinkomplexen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Rolle der einzelnen Untereinheiten oder Domänen in die allgemeine Affinität von einem Proteinkomplex, bulk-Chromatin zu bewerten.

Sequentielle Salz Extraktionen für die Analyse von Bulk-Chromatin bindenden Eigenschaften von Chromatin komplexe ändern

Wir präsentieren eine modifizierte native Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung (ChIP-Seq) Methodik für die Generation der Sequenz Datasets geeignet für ein Nukleosom Dichte ChIP-Seq analytischer Rahmen micrococcal Nuklease (MNase) Zugänglichkeit zu integrieren mit Histon Modifikation Messungen.

Erzeugung von nativen Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung Bibliotheken für Nukleosom Dichteanalyse

Die Plastizität der nuklearen Architektur wird durch dynamische epigenetischen Mechanismen, einschließlich nicht-kodierende RNAs, DNA-Methylierung, Nukleosom Neupositionierung sowie Histon Zusammensetzung und Modifikation gesteuert. Hier beschreiben wir eine Formaldehyde-Assisted Isolation von regulatorischen Elemente (FAIRE) Protokoll ermöglicht die Bestimmung der Chromatin-Barrierefreiheit in gewissem Sinne reproduzierbar, preiswert und unkompliziert.

Formaldehyd-gestützte Isolation regulatorischer Elemente auf die Maßnahme Chromatin Barrierefreiheit in Säugerzellen

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Chromatinpräparation aus tiefgefrorenem Gewebe und eignet sich für die Vernetzung der Chromatin-Immunpräzipitation (X-ChIP), gefolgt von einer quantitativen PCR-Analyse (X-ChIP-qPCR) oder einem Next-Generation-Sequencing-Ansatz (X-ChIP-seq).

Chromatinextraktion aus gefrorenem chimärem Lebergewebe für die Chromatin-Immunpräzipitationsanalyse

Dieses Protokoll stellt eine Technik zur hochauflösenden Kartierung von Replikationsstellen in strukturell konserviertem Chromatin in situ vor, die eine Kombination aus voreingebetteter EdU-Streptatvid-Nanogold-Markierung und ChromEMT verwendet.

Abbildung replikativer Domänen in ultrastrukturell konserviertem Chromatin mittels Elektronentomographie

Dieses Protokoll beschreibt die Capture Hi-C-Methode, die verwendet wird, um die 3D-Organisation von megabasierten Zielgenomregionen mit hoher Auflösung zu charakterisieren, einschließlich der Grenzen topologisch assoziierender Domänen (TADs) und langreichweitiger Chromatininteraktionen zwischen regulatorischen und anderen DNA-Sequenzelementen.

Entschlüsselung der hochauflösenden 3D-Chromatinorganisation über Capture Hi-C

Hier stellen wir eine Adaption der Technik zur Erfassung der Chromosomenkonformation (3C) im Detail vor, wobei der Schwerpunkt auf der Beteiligung und dem Lernen von Studenten liegt.

Eine Eins mit den 3Cs bekommen: Erfassung der Chromosomenkonformation für Studenten

Wir präsentieren ein dreifarbiges Chromatin-Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie-(SMLM)-Färbungs- und Analyseverfahren, das eine reproduzierbare Abbildung von Euchromatin, Heterochromatin und RNAP II für die räumliche Analyse ermöglicht. Dieses Protokoll ermöglicht eine effiziente mehrfarbige Markierung in dichten nuklearen Umgebungen, einschließlich chromatinassoziierter Ziele, und ermöglicht eine zuverlässige gleichzeitige Erkennung.

Ein mehrschichtiges Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopieprotokoll zur Untersuchung von Chromatin in der dichten Kernumgebung

Erfahren Sie eine Methode zur Untersuchung der de novo Bildung von PRC2-vermittelten Chromatin-Domänen in Maus-Embryonalstammzellen mittels CRISPR/Cas9. Dieses System ermöglicht die Echtzeit-Analyse dynamischer chromatischer Veränderungen.

Eine Methode zur Untersuchung der de novo Bildung von Chromatin-Domänen

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