Name: Chronische Salmonelleninfektion induzierte Darmfibrose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Erfahren Sie ein robustes Mausmodell zur Induktion intestinaler Fibrose mit Salmonella Typhimurium ΔAroA nach Streptomycin-Vorbehandlung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung fibrotischer Mechanismen bei Morbus Crohn und die Entwicklung neuer Therapien.

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Wir danken Ingrid Barta für die Histologie.

Alle Tierprotokolle wurden vom Animal Care Committee der University of British Columbia genehmigt.
1. Herstellung von Salmonella Typhimurium -AroA-Kulturen zur oralen Gavage von Mäusen
<ol><li>Aus einem gefrorenen Glycerinbestand von S. Typhimurium -AroA, bereiten Sie eine Streifenplatte mit LB-Agar mit 100 g/ml Streptomycin mit einer sterilen Impfschleife vor. Über Nacht bei 37 °C inkubieren. Streifenplatten können bis zu einer Woche bei 4 °C gelagert werden.</li>
	<li>Einen Tag vor der Infektion Antibiotika vorbereiten, indem Sie 0,5 g Streptomycin in 2,5 ml Wasser auflösen. Nach der Filtersterilisation Streptomycin-Lösung, oral gavage die Mäuse mit einer Glühbirne-tippsed 22G Gavage Nadel und 1 ml Spritze mit 100 l Streptomycin-Lösung (20 mg Streptomycin/Dosis). Mit einer Impfschleife 3 ml LB-Brühe (50 g/ml Streptomycin) in einem Kulturrohr mit einer einzigen Kolonie impfen. Salmonellenkultur aerob bei 37 °C über Nacht mit Schütteln bei 200 RPM inkubieren.</li>
	<li>Am Tag der Infektion, bereiten endgültige Infektionsdosis durch Durchführung 2 aufeinander folgenden 1/10 Verdünnungen der über Nacht Salmonellenkulturen in sterilen PBS. Dies würde zu einem Inokulum von 100 l führen, das etwa 3 x 106 KBE enthält.</li>
	<li>Mit einer 22G-Gavage-Nadel mit Glühbirne und einer 1 ml Spritze jede Maus mit 100 l der vorbereiteten Salmonellen verkleben. HINWEIS: Bereiten Sie Salmonellenkulturen mit aseptischen Techniken vor. Die endgültige Inokulationskonzentration von Salmonellen kann durch Plattieren von seriellen Verdünnungen auf LB-Agar mit Streptomycin überprüft werden. Die Sorte S. Typhimurium -AroA kann durch Kontaktaufnahme mit Professor McNagny (kelly@brc.ubc.ca) erworben werden.</li>
</ol>2. Bewertung der Salmonellenbelastungen im Gewebe
<ol><li>Bereiten Sie 2 ml sichere, runde Bodenmikroröhrchen mit 1 ml sterilem PBS und einer autoklavierten Edelstahlperle vor. Vorwiegen der Schläuche vor der Gewebesammlung.</li>
	<li>Resektcecal und Milzgewebe von Mäusen, die durch Kohlendioxid-Exposition eingeschläfert wurden. Sammeln Sie Gewebe von einzelnen Tieren in separaten Röhrchen. Wiegen Sie die Rohre, um Gewebegewichte zu bestimmen.</li>
	<li>Homogenisieren Sie mit einem Mischermühlengerät für 15 min bei 30 Hz. Übertragen Sie 900 l PBS pro Brunnen in einem 96-well 2-ml Megablock. Die Pipette 100 l Desgewebe homogenisiert sich in den ersten Brunnen, mischt sich gut und führt serielle Verdünnungen durch, indem 100 l zu nachfolgenden Bohrungen hinzugefügt werden, bis eine Verdünnung von 10-6 erhalten ist. Platte 10 l jeder Verdünnung in Triplicaten auf LB-Agar mit 100 g/ml Streptomcyin.</li>
	<li>Zählen und multiplizieren Sie die durchschnittliche KBE mit dem Faktor 100, da 10 l der 1000-L-Probe plattiert wurde und der entsprechende Verdünnungsfaktor. Teilen Sie das Gewebegewicht gesamt KBE durch Gewebegewichte, um KBE pro Gramm Gewebe zu bestimmen. HINWEIS: Bewahren Sie alle Proben während der Gewebeverarbeitung auf Eis oder bei 4 °C auf. Verwenden Sie Breit-Orifice-Pipettenspitzen, wenn Sie serielle Verdünnungen mit Gewebehomogenaten durchführen. Bereiten Sie den 96-Well-Megablock mit PBS im Voraus vor.</li>
</ol>3. Picrosirius Rote Färbung und Quantifizierung von Kollagen.
<ol><li>Fix Cecal Gewebe über Nacht in 10% gepuffertes Formalin und bereiten für Paraffin Einbettung. Schneiden Sie 5-m Abschnitte für Picrosirius Rote Färbung, wie zuvor beschrieben25.</li>
	<li>Erfassen Sie zusammengesetzte Bilder ganzer Cecal-Querschnitte auf einem Hellfeldmikroskop.</li>
	<li>Öffnen Sie Fidschi (ImageJ) und ziehen Sie die .tif-Bilddatei auf die Symbolleiste.</li>
	<li>Wählen Sie in der Menüleiste Bild > Typ > RGB-Stapel aus, um das Bild in rote, grüne und blaue Kanäle aufzuteilen. Schieben Sie die horizontale Leiste am unteren Rand des Bedienfelds, um den Kanal auf Grün festzulegen.</li>
	<li>Öffnen Sie Bild > Anpassen > Schwellenwertwerkzeug. Passen Sie die minimalen und maximalen Grenzwerte an, um Hintergrundsignale zu eliminieren. Sobald der gewünschte Schwellenwert festgelegt ist, schließen Sie das Schwellenwertwerkzeug, und wechseln Sie zu Analysieren > Messungen festlegen. Deaktivieren Sie Bereich, Flächenfraktion, Limit auf Schwellenwertund Anzeigebeschriftung.
</li>
	<li>Gate the tissue section with either Freehand selections or Polygon selections tool and measure the % area positive for collagen by click Analyze > Measure.</li>
	<li>Normalisieren Sie den absoluten Bereich positiv für Kollagenfärbung zu Gewebebereich. HINWEIS: Fidschi (ImageJ) ist ein Open-Source-Programm, das bei https://fiji.sc heruntergeladen werden kann. Bilder mit denselben Aufnahmebedingungen (d. h. Helligkeit und Fokus) müssen identische Schwellenwerte für eine genaue Quantifizierung aufweisen. Wenn es eine Hintergrundfärbung innerhalb des ausgewählten Gewebes gibt, messen Sie den absoluten Bereich und subtrahieren Sie ihn vom Bereich positiv für Kollagen aus dem gesamten Gewebe.</li>
</ol>

<ol><li>Danese, S., Fiocchi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulcerative+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ulcerative colitis.</a> New England Journal of Medicine. 365 (18), 1713-1725 (2011).</li>
<li>Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Crohn's disease.</a> The Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).</li>
<li>Knights, D., Lassen, K. G., Xavier, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+inflammatory+bowel+disease+pathogenesis%3A+linking+host+genetics+and+the+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Advances in inflammatory bowel disease pathogenesis: linking host genetics and the microbiome.</a> Gut. 62 (10), 1505-1510 (2013).</li>
<li>Xavier, R. J., Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+pathogenesis+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease.</a> Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).</li>
<li>Cho, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+and+immunopathogenesis+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The genetics and immunopathogenesis of inflammatory bowel disease.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (6), 458-466 (2008).</li>
<li>Ogura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+frameshift+mutation+in+NOD2+associated+with+susceptibility+to+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A frameshift mutation in NOD2 associated with susceptibility to Crohn's disease.</a> Nature. 411 (6837), 603-606 (2001).</li>
<li>Jostins, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions+have+shaped+the+genetic+architecture+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease.</a> Nature. 491 (7422), 119-124 (2012).</li>
<li>Rivas, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+resequencing+of+GWAS+loci+identifies+independent+rare+variants+associated+with+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Deep resequencing of GWAS loci identifies independent rare variants associated with inflammatory bowel disease.</a> Nature Genetics. 43 (11), 1066-1073 (2011).</li>
<li>Rioux, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+study+identifies+new+susceptibility+loci+for+Crohn+disease+and+implicates+autophagy+in+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association study identifies new susceptibility loci for Crohn disease and implicates autophagy in disease pathogenesis.</a> Nature Genetics. 39 (5), 596-604 (2007).</li>
<li>Uhlig, H. H., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+intestinal+inflammation+as+tools+to+understand+the+pathogenesis+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of intestinal inflammation as tools to understand the pathogenesis of inflammatory bowel disease.</a> European Journal of Immunology. 39 (8), 2021-2026 (2009).</li>
<li>Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+the+microbiota+on+the+pathogenesis+of+IBD%3A+lessons+from+mouse+infection+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).</li>
<li>Grassl, G. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+enteric+Salmonella+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of enteric Salmonella infections.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 24 (1), 22-26 (2008).</li>
<li>Barthel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+of+mice+with+streptomycin+provides+a+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+colitis+model+that+allows+analysis+of+both+pathogen+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host.</a> Infection and Immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).</li>
<li>Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K., Vallance, B. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Enteric+Salmonella+Infection+in+Mice+Leads+to+Severe+and+Persistent+Intestinal+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Chronic Enteric Salmonella Infection in Mice Leads to Severe and Persistent Intestinal Fibrosis.</a> Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).</li>
<li>Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aromatic-dependent+Salmonella+typhimurium+are+non-virulent+and+effective+as+live+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are non-virulent and effective as live vaccines.</a> Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).</li>
<li>Valdez, Y., Ferreira, R. B., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+Salmonella+virulence+and+host+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of Salmonella virulence and host resistance.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 337, 93-127 (2009).</li>
<li>Valdez, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nramp1+drives+an+accelerated+inflammatory+response+during+Salmonella-induced+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Nramp1 drives an accelerated inflammatory response during Salmonella-induced colitis in mice.</a> Cellular Microbiology. 11 (2), 351-362 (2009).</li>
<li>Lo, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+nuclear+receptor+RORalpha+and+group+3+innate+lymphoid+cells+drive+fibrosis+in+a+mouse+model+of+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">The orphan nuclear receptor RORalpha and group 3 innate lymphoid cells drive fibrosis in a mouse model of Crohn's disease.</a> Science Immunology. 1 (3), eaaf8864(2016).</li>
<li>Burke, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrogenesis+in+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Fibrogenesis in Crohn's disease.</a> American Journal of Gastroenterology. 102 (2), 439-448 (2007).</li>
<li>Hogan, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+and+regeneration+of+the+respiratory+system%3A+complexity%2C+plasticity%2C+and+mechanisms+of+lung+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Repair and regeneration of the respiratory system: complexity, plasticity, and mechanisms of lung stem cell function.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 123-138 (2014).</li>
<li>Fiocchi, C., Lund, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Themes+in+fibrosis+and+gastrointestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Themes in fibrosis and gastrointestinal inflammation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (5), G677-G683 (2011).</li>
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<li>Fichtner-Feigl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-13+signaling+via+IL-13R+alpha2+induces+major+downstream+fibrogenic+factors+mediating+fibrosis+in+chronic+TNBS+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">IL-13 signaling via IL-13R alpha2 induces major downstream fibrogenic factors mediating fibrosis in chronic TNBS colitis.</a> Gastroenterology. 135 (6), e2001-e2007 (2013).</li>
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<li>Imai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellin-mediated+activation+of+IL-33-ST2+signaling+by+a+pathobiont+promotes+intestinal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Flagellin-mediated activation of IL-33-ST2 signaling by a pathobiont promotes intestinal fibrosis.</a> Mucosal Immunology. , (2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine finanziellen Interessenkonflikte offenzulegen.

Unser Verständnis der Pathogenese von IBD wurde durch Mausmodelle von Darmentzündungen erheblich verbessert. Obwohl solche einzelseitigen Modelle nicht alle Merkmale der komplexen und multifaktoriellen menschlichen Krankheit rekapitulieren, waren sie nützlich bei der Identifizierung von Schlüsselmerkmalen des Krankheitsverlaufs. Fibrotische Strenge im Zusammenhang mit IBD bleibt ein großer unerfüllter klinischer Bedarf, da aktuelle Behandlungen bei der Umkehrung der Krankheitsentwicklung wirkungslos sind. Darüber hinaus ...

Colitis ulcerosa (UC) und Morbus Crohn (CD) sind die beiden Hauptformen der IBD und werden als chronische und schubförmige entzündliche Erkrankungen des Magen-Darm-Traktes 1,2charakterisiert. Diese Störungen haben einen großen Einfluss auf die Lebensqualität der Patienten. Symptome von IBD sind Bauchschmerzen, Durchfall, Übelkeit, Gewichtsverlust, Fieber, und Müdigkeit3. Jüngste Studien haben genetische und Ökologische Faktoren identifiziert, die zur Pathogenese von Krankheiten beitragen; Es wird angenommen, dass solche Risikofaktoren zur Störung der Epithelbarriere beitragen, die zur Translokation oder Überprobenahmung von luminalen Antigenen4führt. Als Folge löst dies eine abnorme Entzündungsreaktion auf die beginnende Flora aus, die durch Darmimmunzellen vermittelt wird4. Merkmale der IBD-assoziierten Komplikationen können sich auf Standorte außerhalb des GI-Traktes erstrecken, die verschiedene Organe einschließlich Gelenke, Haut und Leberbetreffen 1,2. Markenzeichen von UC sind schwere und diffuse Entzündungen, die typischerweise im Dickdarm1lokalisiert sind. Krankheitspathologie wirkt sich auf die Schleimhaut und Submukose des Darms, was zu oberflächlichen Schleimhautgeschwüren1. Im Gegensatz dazu kann CD jeden Teil des GI-Traktes beeinflussen, obwohl Beweise für Krankheiten häufig im Dickdarm und distalen Ileum2gefunden werden. Darüber hinaus ist die Entzündung in CD transmural, die alle Schichten der Darmwandbetrifft 2.
Mehrere identifizierte IBD-Anfälligkeitsgene würden darauf hindeuten, dass die Dysregulation der Epithelbarriere oder -immunität einen kritischen Beitrag zum Fortschreiten der Krankheit s.5leistet. Mutationen in Dernuleotid-Oligomerisierungsdomäne 2 (NOD2), ausgedrückt durch Monozyten, wurden mit einer erhöhten Anfälligkeit für CD in Verbindung gebracht; Dies zeigt einen Zusammenhang zwischen dem veränderten angeborenen Immundetektion von bakteriellen Komponenten und der Krankheit6. Neuere genomweite Assoziationsstudien (GWAS) haben zusätzliche Wege ergeben, die potenziell an der Pathogenese von IBD beteiligt sind, einschließlich genetischer Variationen in: STAT1, NKX2-3, IL2RA, IL23R-abhängigen Pfaden verbunden mit adaptiver Immunität, MUC1, MUC19und PTGER4 bei der Wartung von Darmbarrieren und ATG16L-vermittelter Autophagie7,8,9. Während diese bevölkerungsbasierten genetischen Studien unser Verständnis von IBD verbessert haben, sind Anfälligkeitsallele allein wahrscheinlich nicht ausreichend, um chronische Krankheiten zu ins Leben zu erhalten und zu erhalten3. Andere nicht-genetische Faktoren wie Veränderungen in der Darmmikrobiomzusammensetzung und eine Verringerung der Diversität wurden mit Darmentzündungen in Verbindung gebracht. Es ist jedoch unklar, ob Darmdysbiose vorsteht oder die Folge von dysregulierten Immunantworten3ist. Obwohl die Ätiologie der IBD unklar bleibt, wurde unser Verständnis der Pathogenese der Krankheit durch experimentelle Mausmodelle der Darmentzündung10,11verbessert. Diese Modelle stellen einzeln nicht vollständig die Komplexität der menschlichen Krankheit dar, aber sie sind wertvoll für die Aufklärung pathophysiologischer Pfade, die für IBD relevant sein könnten, und für die Validierung vorläufiger therapeutischer Strategien10, 11. Solche Mausmodelle verlassen sich in der Regel auf die Einleitung von Entzündungen durch chemische Induktion oder Infektion, Immunzelltransfer oder genetische Manipulation. Darüber hinaus beinhalten diese Strategien oft Störungen in der epitheliaalen Integrität oder Modulation der angeborenen oder adaptiven Immunität.
Salmonella enterica serovars sind Darmpathogene, die Menschen und Mäuse infizieren können. Nach der Einnahme können Salmonellen den Darm durch direkte Invasion von Epithelien, M-Zellen oder Antigen-präsentierenden Zellen12besiedeln. Mäuse oral mit S infiziert Typhimurium führt zur Kolonisierung in erster Linie von systemischen Stellen wie der Milz und mesenterischen Lymphknoten mit relativ geringer Häufigkeit im GI-Trakt12. Jedoch, Vorbehandlung von Mäusen mit Streptomycin verbessert die Effizienz der Salmonellen-Kolonisation des Darms durch Verringerung der Wirt schutzfördernde Wirkung der normalen Mikrobiota13. Zu den pathologischen Merkmalen dieses Modells gehören die Störung oder Ulzeration der Epithelbarriere, granulozyte Rekrutierung und schwere Ödeme13. Alternativ kann eine Infektion mit der Impfstoffklasse S. Typhimurium -AroA Mutant führt zu chronischer Kolonisation des Zecums und Dickdarms, die bis zum Tag 40 nach der Infektion14anhält. Die S. Typhimurium -AroA-Stamm hat einen Defekt in der Biosynthese von aromatischen Aminosäuren; Dies macht den mutierten Stamm avirulent und kann als hochwirksamer Impfstoff verwendet werden15. Eine orale Infektion bei Mäusen führt zu einer Th1- und Th17-Zytokin-assoziierten Entzündungsreaktion, einer umfassenden Gewebeumgestaltung und Kollagenablagerung. Gewebepathologie ist verbunden mit erhöhten Niveaus der pro-fibrotischen Faktor wie TGF-Nr. 1, CTGF, und IGF14. Die in diesem Modell berichtete transmurale fibrotische Narbenbildung erinnert an Strengeformationen, die häufig bei IBD beobachtet werden. Die Induktion von Fibrose durch Salmonellen erfordert Virulenz, kodiert durch Salmonella Pathogenitätsinseln (SPI)-1 und 2 12. Wichtig ist, dass dieses S. Tymphimurium -AroA-Infektionsmodell ist ein nützliches System für die Untersuchung von fibrotischen Reaktionen bei mutierten Mäusen, die auf einem C57/Bl6-Hintergrund gehalten werden. Die C57/Bl6-Sorte ist extrem empfindlich gegenüber S. Typhiumurim SL1344-Infektion aufgrund einer Funktionsverlustmutation im Gen, die das natürliche resistenzassoziierte Makrophagenprotein (NRAMP)-116,17kodiert. Wir haben herausgefunden, dass IL-17A und ROR-abhängige lymphoide Zellen wichtige Beiträge zur Pathogenese in diesem Modell18sind.
Eine hauptverkompliktäre CD ist die dysregulierte und übermäßige Ablagerung der extrazellulären Matrix (ECM) einschließlich Kollagen2,19. Obwohl der GI-Trakt eine relativ hohe Regenerationsfähigkeit hat, kann fibrotische Narbenbildung durch ungelöste Wundheilungsreaktionen entstehen, die mit chronischen und schweren Entzündungen verbunden sind20,21. In CD führt dies zu schädlichen Auswirkungen auf die Gewebearchitektur, die zu einer signifikanten Organbeeinträchtigung führt21,22. Die transmurale Natur der entzündung, die in CD beobachtet wird, geht letztlich der Verdickung der Darmwand voraus, die mit symptomatischer Stenose oder Striktbildung verbunden ist21. Etwa ein Drittel der CD-Patienten benötigen eine Darmresektion für diese Komplikation22. Es gibt keine wirksamen antifibrotischen Therapien in IBD, da die Verwendung von Immunsuppressiva wie Azathioprin oder Anti-TNF-Biologika keine Auswirkungen haben oder nur geringfügig den Bedarf an chirurgischen Eingriffen reduziert19,23 . Während Fibrose wird angenommen, dass die Folge der chronischen Entzündung, Zellen mesenchymaler Herkunft wie Fibroblasten und Pericyten werden gedacht, um die primären zellulären Quellen von ECM in fibrotischen Narben21,24. Chronische S. Typhimurium -AroA-Infektion ist ein robustes Mausmodell der Darmfibrose, das Einblicke in die Pathogenese von CD-ähnlichen Merkmalen bieten kann.

<table><tbody><tr><td>2 ml Safe-Lock-Röhrchen mit rundem Boden</td><td>Eppendorf</td><td>22363344</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahlperlen</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen mit großer Öffnung</td><td>Fisher</td><td>2707134</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Megablockplatten</td><td>Sarstedt</td><td>82.1972.002</td><td></td></tr><tr><td>Sondennadeln</td><td>FST</td><td>18061-22</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycinsulfat</td><td>Sigma</td><td>S9137</td><td></td></tr><tr><td>Rührmühle</td><td>Retsch</td><td>MM</td><td></td></tr></tbody></table>

chronische salmonelleninfektion induzierte darmfibrose

Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis

Gewebefibrose, die durch die pathologische Ansammlung extrazellulärer Matrix wie Kollagen gekennzeichnet ist das Ergebnis einer anhaltenden Entzündung und dysregulierten Reparatur. Bei entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) führt Fibrose zu wiederkehrenden Stricture-Formationen, für die es keine andere wirksame Therapie als chirurgische Resektion gibt. Aufgrund seines späten Beginns sind die Prozesse, die Fibrose antreiben, weniger untersucht und weitgehend unbekannt. Daher stellen fibrotische Komplikationen eine große Herausforderung bei IBD dar. In diesem Protokoll wird ein robustes In-vivo-Modell der Darmfibrose beschrieben, bei dem Streptomycin-Vorbehandlung von C57Bl/6-Mäusen, gefolgt von oraler Gavage mit Deminfizierung s. Fibrose des Cecums. Methoden zur Vorbereitung von S. Typhimurium -AroA zur Impfung, Quantifizierung von Pathogenlasten im Cecum und Milz und Bewertung der Kollagenablagerung in Darmgewebewerden werden erläutert. Dieses experimentelle Krankheitsmodell ist nützlich für die Untersuchung von Wirtsfaktoren, die CD-ähnliche Darmfibrose entweder verstärken oder verschlimmern.

Streptomycin-Behandlung gefolgt von einer oralen Infektion mit S. Typhimurium -AroA führt zu robusten Darmentzündungen und Fibrose vor allem im Cecum (Abbildung 1). Typische Krankheitsbelastungen von 108 bis 109 KBE pro 1 g Cecum und 104 KBE pro 1 g Milz können von infizierten Tieren zurückgewonnen werden (Abbildung 2). Die Beurteilung der Fibrose in picrosirius rot gefärbten Cecal-Abschnitten zeigt Spitzenfibrose 21 Tag...

Dieses Protokoll beschreibt ein Mausmodell der Salmonellen-getriebenen Darmfibrose, die den wichtigsten pathologischen Merkmalen der Morbus Crohn ähnelt, einschließlich transmuraler Entzündungen und Fibrose. Diese Methode kann verwendet werden, um Wirtsfaktoren zu bewerten, die fibrotische Ergebnisse mit mutierten Mäusen verändern, die auf einem c57Bl/6 genetischen Hintergrund gehalten werden.

Chronische Salmonelleninfektion induzierte Darmfibrose

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and ...

Gewebefibrose ist die primäre Art und Weise, dass Organe im Laufe der Zeit versagen, als Reaktion auf chronische Entzündungen oder Alterung. Und in der Tat würde ich argumentieren, dass, wenn Sie nicht an einem Infektier oder Krebs sterben, Werden Sie wahrscheinlich an Organfibrose sterben, wenn Sie älter werden. Leider gibt es nicht viele großartige Mausmodelle, um menschliche Gewebefibrose nachzuahmen.Was wir also entwickelt haben, ist ein Mausmodell der Morbus Crohn, das ist eine Krankheit beim Menschen, die Fibrose des Darms verursacht und weitgehend unbehandelt ist. In der Tat, der einzige Weg, wie Sie es behandeln können, ist durch chirurgische Entfernung des fibrotischen Gewebes und Religation des Darms. Der Vorteil unseres Modells ist, dass es in allen Mausstämmen vollständig durchdringend ist und sehr eng die Krankheit des menschlichen Crohn imitiert und die Fibrose über einen Monat anhält, was wirklich ein robustes Modell ist.Der schwierigste Teil dieses Verfahrens ist der Umgang mit den Mäusen und vor allem die orale Gavage, da dies eine Menge Praxis spezielle Zertifizierung erfordert. Wenn Sie dieses Verfahren zum ersten Mal durchführen, sollte man sich bewusst sein, dass die Arbeit mit Salmonellen angemessene Sicherheitsvorkehrungen und sterile Technik erfordert. Die Entsorgung von Abfällen und Bakterien sollte vor dem Experiment geplant werden.Die visuelle Demonstration dieses Verfahrens ist sehr wichtig, da es den Umgang mit Salmonellen beinhaltet, die besondere Sicherheitsvorkehrungen sowie eine ordnungsgemäße sterile Technik erfordert. Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie eine Platte mit LB-Agar mit Streptomycin in einer Konzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter. Mit einer sterilen Impfschleife, streifen Sie die Platte mit einem gefrorenen Glycerin-Vorrat von S typhimurium Delta Pfeil a.Über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Streifenplatten können bei vier Grad Celsius bis zu einer Woche gelagert werden. Einen Tag vor der Infektion, lösen Sie 0,5 Gramm Streptomycin in 2,5 Milliliter Wasser, um das Antibiotikum vorzubereiten.Filter sterilisieren die Streptomycin-Lösung. Verwenden Sie dann eine mit einer Glühbirne gekippte 22-Spur-Gavage-Nadel mit einer Ein-Milliliter-Spritze, um die Mäuse mit 100 Mikrolitern der Streptomycin-Lösung oral zu verklauen. Als nächstes fügen Sie drei Milliliter LB-Brühe mit Streptomycin in einer Konzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter in eine Kulturröhre.Mit einer Impfschleife impfen Sie die LB-Brühe mit einer einzigen Kolonie. Inkubieren Sie die Kultur aerob über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 Umdrehungen/ Minute. Führen Sie am Tag der Infektion zwei aufeinander folgende ein bis zehn Verdünnungen der über Nacht Salmonellenkulturen mit sterilem PBS durch, um die endgültige Infektionsdosis vorzubereiten.Daraus ergibt sich ein 100-Mikroliter-Inokulum, das etwa drei Millionen koloniebildende Einheiten enthält. Danach verwenden Sie eine mit einer Glühbirne gekippte 22-Spur-Gavage-Nadel mit einer Milliliter-Spritze, um jede Maus mit 100 Mikrolitern der vorbereiteten Salmonellen zu verkleben. Legen Sie zunächst zwei Milliliter sicher-Schloss-Rundboden-Mikroröhren fest, fügen Sie jedem Rohr einen Milliliter sterilen PBS und eine autoklavierte Edelstahlperle hinzu.Vorwiegen der Schläuche vor der Gewebesammlung. Nach der Einschläfung von Mäusen, resektieren ihre Cecal und MilzGewebe, sicherstellen, gewebe von einzelnen Tieren in separate Röhren zu sammeln. Wiegen Sie jedes Rohr, um die Gewebegewichte zu bestimmen.Verwenden Sie ein Mischermühlengerät, um das Gewebe bei 30 Hertz für 15 Minuten zu homogenisieren. Dann übertragen Sie 900 Mikroliter PBS in jeden Brunnen eines 96-Well-Zwei-Milliliter-Megablocks. Pipette 100 Mikroliter Gewebe homogeniert in den ersten Brunnen, und gut mischen.Führen Sie serielle Verdünnungen durch Zugabe von 100 Mikrolitern zu nachfolgenden Brunnen durch, bis eine 10 zur negativen sechsten Verdünnung erhalten ist. Platte 10 Mikroliter jeder Verdünnung in Triplicaten auf LB-Agar, der Streptomycin enthält. Zählen Sie dann die durchschnittlichen koloniebildenden Einheiten und bestimmen Sie die koloniebildenden Einheiten pro Gramm Gewebe, wie im Textprotokoll beschrieben.Öffnen Sie Fidschi, eine Open-Source-Imaging-Software und ziehen und legen Sie die tif-Bilddatei auf die Werkzeugleiste. Wählen Sie in der Menüleiste Bild, Typ, RGB-Stack aus, um das Bild in rote, grüne und blaue Kanäle aufzuteilen. Schieben Sie die horizontale Leiste am unteren Rand des Bedienfelds, um den Kanal auf grün einzustellen.Öffnen Sie Bild, Anpassen, Schwellenwert Werkzeug. Passen Sie die minimalen und maximalen Grenzwerte an, um Hintergrundsignale zu eliminieren. Sobald der gewünschte Schwellenwert festgelegt ist, schließen Sie das Schwellenwertwerkzeug und gehen Sie zu Analysieren, Messen festlegen, Flächen auschecken, Flächenfraktion, Grenzwert auf Schwellenwert und Anzeigebeschriftung anzeigen.Holen Sie sich die Gewebeauswahl mit dem Freihandauswahl- oder Polygonauswahlwerkzeug und messen Sie den prozentualen Bereich positiv für Kollagen, indem Sie auf Analysieren, Messen klicken. Dann normalisieren Sie den absoluten Bereich positiv für Kollagenfärbung zu Gewebebereich. Streptomycin Behandlung gefolgt von oralen Infektion mit S typhimurium Delta Pfeil a führt zu robusten Darmentzündungen und Fibrose, vor allem im Cecum.Typische Krankheitslasten von 100 Millionen bis einer Milliarde Kolonien bildenden Einheiten können pro Gramm Cecum von infizierten Tieren zurückgewonnen werden, während 10 Tausend Koloniebildeinheiten in der Regel pro Gramm Milz zurückgewonnen werden können. Die Beurteilung der Fibrose in picrosirius rot gefärbten Cecal-Abschnitten zeigt Spitzenfibrose 21 Tage nach der Infektion, während ein Großteil der Pathologie durch Tag 42 nach der Infektion gelöst wird. Eine gründliche Vorbereitung der Materialien ist unerlässlich, da dieses Experiment mehrere Tage für die Einrichtung benötigt.Die Herstellung von LB-Platten und Salmonellen und Streptomycin sollte alle aseptisch erfolgen. Stellen Sie vor dem Experiment sicher, dass der Experimentator mit dem Tierprotokoll sowie mit Sicherheitsrisiken vertraut ist. Bei der Bewertung der Kollagenbelastung kann der Experimentator andere biologische Assays durchführen, wie z. B. RNA-Sequenzierung zur Bewertung von Genexpressionsprofilen oder Durchflusszytometrie zur Beurteilung von Immunzellteilmengen oder einem Gewebe-ELISA zur Beurteilung von Zytokinprofilen.So ist unser Modell besonders gut bei der Nachahmung einer menschlichen Krankheit namens Morbus Crohn, wo Sie Fibrose des Darms bekommen, die weitgehend unbehandelt ist und die einzige Möglichkeit, es zu behandeln ist, einen Abschnitt des Darms zu entfernen und es wieder zusammen zu nähen und hoffen, dass es nicht zurückkommt. Unser Modell ist sehr robust und wir haben bereits gezeigt, dass das Targeting angeborener lymphatischer Zellen Typ 3, ein Transkriptionsfaktor namens rohe Alpha, oder Interleukin 17 die Krankheit lindert und die Fibrose verhindert. Unser Modell ist besonders gut bei der Identifizierung der Faktoren, die bei der Pathogenese der Morbus Crohn und Darmfibrose spielen, und wir sind bereits auf dem Weg, eine Reihe von Zielen zu identifizieren, die therapeutisch behandelt werden könnten, um entzündliche Darmerkrankungen zu lindern.Unser Modell hat bereits den gleichen ILC3 oder Alpha NIL17 Zugang kann bei anderen fibrotischen Erkrankungen im Spiel sein und dies gehören Dinge wie Psoriasis, Multiple Sklerose, idiopathische Lungenfibrose. Es ist also möglich, dass die Ausrichtung auf dieselben Faktoren auch bei diesen Krankheiten die Fibrose lindern könnte. Obwohl der mutierte Salmonellenstrom nicht virulent ist, ist es wichtig, die standarden Biogefahren-Sicherheitsprotokolle der Anlage zu befolgen.Da Formaldehyddämpfe bekanntermaßen krebserregend sind, ist es wichtig, während des Fixierungsschritts hinter einer Dunstabzugshaube zu arbeiten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Stellen Sie eine chronische bakterielle Infektion Mausmodell mit...

Chronisch Salmonellen Infected Maus-Modell

Experimentelle Modelle von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen haben uns erlaubt, die komplexen angeborenen und adaptiven Immunantwort mit Pathogenese assoziiert zu untersuchen. Mit histologische Scoring, Quantifizierung von pro-inflammatorischen Zytokinen und Myeloperoxidase-Aktivität, kann man anfangen, diese Reaktionen in chronisch entzündlichen Darmerkrankungen gesehen zu beurteilen.

Untersuchung Darmentzündungen in DSS-induzierten Modell der IBD

Quelle: Lo, B. C., et al. Chronische Salmonellen-Infektion induzierte Darmfibrose. J. Vis. Exp. (2019)Das Video demonstriert die Quantifizierung der Bakterienlast in einem Mausmodell einer chronischen Infektion mit streptomycinresistenter Salmonella-Typhimurium.  Nach Euthanasie und steriler Dissektion werden Müses- und Milzgewebe entnommen, mit Stahlperlen homogenisiert, um Bakterien freizusetzen, und seriell verdünnt. Verdünnungen werden auf selektivem Agar verdünnt, und sichtbare Kolonien...

Quantifizierung der bakteriellen Gewebebelastung in einem Mausmodell chronischer Darminfektion

Citrobacter rodentium Infektion bietet ein wertvolles Modell zur enteralen bakterielle Infektionen zu untersuchen sowie Host Immunantwort und Kolitis bei Mäusen. Dieses Protokoll beschreibt die Messung der Barriere Integrität, pathogenen Belastung und histologische Beschädigung, die eine für die gründliche Charakterisierung von Erreger und Wirt Beiträge murine infektiöse Kolitis.

Die<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Model: Studieren Erreger und Wirt Beiträge zur Infectious Colitis

Eine Störung des Gallenflusses führt zu einer schweren entzündlichen cholestatischen Leberschädigung mit einer charakteristischen zeitabhängigen Abfolge morphologischer Veränderungen. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die chirurgische Ligatur des Gallengangs communis bei Mäusen vor, das es ermöglicht, nach 21 bis 28 Tagen eine starke fibrotische Reaktion zu induzieren.

Gallengang-Ligation in Mice: Induktion von Entzündungsleber-Verletzung und Fibrose von obstruktiver Cholestase

In dieser Studie beschreiben wir ein detailliertes Verfahren der TNBS-vermittelten Darmfibrose, die eine vergleichbare Pathophysiologie wie Morbus Crohns Fibrose aufweist. Wir diskutieren diesen Ansatz auch im Lichte von Rapamycin erleichterthemmende Auswirkungen auf Darmfibrose.

Mechanistische Einblicke in die Entwicklung von TNBS-vermittelter Darmfibrose und Bewertung der hemmenden Wirkungen von Rapamycin

Wir entwickelten ein Modell der Chorioamnionitis, um die fetale Exposition gegenüber mütterlichen Entzündungen (FEMI) ohne Komplikationen lebender Organismen zu simulieren, um die Auswirkungen von FEMI auf die Entwicklung des Darmtraktes der Nachkommen zu untersuchen. Dies ermöglicht die Untersuchung der mechanistischen Ursachen für die Entwicklung von Darmverletzungen nach Chorioamnionitis.

Ein murines Modell der fetalen Exposition gegenüber mütterlicher Entzündung, um die Auswirkungen der akuten Chorioamnionitis auf die Darmentwicklung von Neugeborenen zu untersuchen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Entwicklung eines Morbus Crohn-ähnlichen Colitis-Modells bei Nagetieren. Eine transmurale Entzündung führt zu einer Stenose an der TNBS-Instillationsstelle, und eine mechanische Vergrößerung wird im Segment proximal zur Stenose beobachtet. Diese Änderungen ermöglichen die Untersuchung der mechanischen Belastung bei Colitis.

Ein TNBS-induziertes Nagetiermodell zur Untersuchung der pathogenen Rolle von mechanischem Stress bei Morbus Crohn

Dieses Protokoll beschreibt die Induktion einer gramnegativen monobakteriellen Sepsis in einem Mausmodellsystem. Das Modell ist nützlich bei der Untersuchung der entzündlichen und tödlichen Wirtsreaktionen während der Sepsis.

Charakterisierung der Salmonella Typhimurium-induzierten septischen Peritonitis bei Mäusen

Dieses Protokoll zeigt, wie das Src-Homologie-2-Domänen-enthaltende 5'-Inositolphosphatase (SHIP)-defiziente Mausmodell für Morbus Crohn (CD)-ähnliche ileale Entzündung und Fibrose verwendet werden kann, um neuartige Therapeutika für Zöliakie zu testen.

Evaluierung therapeutischer Interventionen im SHIP-defizienten Mausmodell der Morbus Crohn-ähnlicher Ileitis und Fibrose

Erfahren Sie ein robustes Mausmodell zur Induktion intestinaler Fibrose mit Salmonella Typhimurium ΔAroA nach Streptomycin-Vorbehandlung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung fibrotischer Mechanismen bei Morbus Crohn und die Entwicklung neuer Therapien.

Chronische Salmonelleninfektion induzierte Darmfibrose

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