Lichtinduzierte molekulare Adsorption von Proteinen mit dem PRIMO-System für Mikro-Patterning zur Untersuchung von Zellreaktionen auf extrazelluläre Matrixproteine

Mikro-Musterung ist ein sehr leistungsfähiges Werkzeug, weil es die Untersuchung zellulärer Reaktionen ermöglicht, um biochemische und biophysikalische Signale zu definieren, denen Zellen in lebenden Organismen begegnen. Im Gegensatz zu anderen Methoden ist die beschriebene für die Mustergenerierung flexibler. Zum Beispiel ermöglicht es die Produktion von Gradienten und Mikromustern mehrerer Proteine mit hoher Reproduzierbarkeit.

Unsere Gruppe nutzt LIMAP nicht nur, um neuronale Pfadfindungen zu untersuchen, sondern auch, wie andere Zellen auf Signale reagieren, die Einfluss auf Zellproliferation, Differenzierung und Migration haben. Mikromusterung wird verwendet, um grundlegende Fragen in der Zellbiologie zu beantworten. Das gewonnene Wissen kann genutzt werden, um bestehende Geräte in der regenerativen Medizin zu modifizieren, zum Beispiel Nervenreparatur nach peripheren Nervenverletzungen.

Beginnen Sie mit dem Entwerfen von Vorlagen für das Mustern auf digitaler Zeichensoftware. Wählen Sie eine Bildgröße von 1, 824 Pixel n. Chr. und 1, 140 Pixel in der Breite aus. Entwerfen Sie die Vorlage, und speichern Sie die Vorlage als 8-Bit-TIFF-Datei.

Reinigen und aktivieren Sie vor dem Mustern die Oberfläche mit einem Plasmareiniger mit einem Prozessdruck von 1.000 bis 1, 300 Millitorr und einer Leistung von 29,6 Watt für ein bis fünf Minuten. Verwenden Sie eine Glasbodenschale mit einer 20-Millimeter-Innenbrunnengröße und einer Glasdicke von 0,16 bis 0,19 Millimetern. Wählen Sie entweder ein Sechs-Gut oder ein Einzel-Gut-Gericht, abhängig von der Anzahl der Bedingungen, die getestet werden.

SCHNEIDEN Sie PDMS Schablonen unter sterilen Bedingungen, um sicherzustellen, dass sie gut in den inneren Glasboden passen. Entfernen Sie die inneren Mikrobrunnenfüllungen mit steriler Zange, und kleben Sie die Schablonen gut auf das Glas. Bereiten Sie eine 0,1 Milligramm pro Milliliter PLL-PEG-Lösung in PBS vor und fügen Sie jedem Mikrobrunnen 20 Mikroliter hinzu.

Dann inkubieren Sie das Gericht bei Raumtemperatur für eine Stunde. Nach der Inkubation 15 Mikroliter des PLL-PEG aus jedem Brunnen entfernen und fünfmal mit 20 Mikroliter PBS waschen, ohne es trocknen zu lassen. Bereiten Sie einen Mikrobrunnen vor, um ein Referenzmuster zu erstellen, indem Sie 18 Mikroliter PBS aus einem einzigen Brunnen entfernen und fünf Mikroliter Photoinitiator hinzufügen, sodass PBS in den verbleibenden Mikrobrunnen verbleibt.

Verwenden Sie dann einen fluoreszierenden Highlighter, um einen leeren Inneren Glasbrunnen zu markieren. Positionieren Sie die weit über dem Ziel, und passen Sie den objektiven Fokus, bis das PRIMO-Logo und der Slogan kümmern sich um Ihre Zellen"sind im Fokus. Zeichnen Sie dann die Z-Position der Brennebene auf.

Um ein Referenzmuster zu erstellen, visualisieren Sie den Rand des Mikrobrunnens mit dem Photoinitiator mithilfe des übertragenen Lichts durch die Kamera, und wählen Sie das ROI-Symbol aus dem rechten Menü aus. Wählen Sie PRIMO aus, um die gewünschte Mustervorlage hochzuladen, die als Konstruktionseinheit auf den ROI projiziert wird. Navigieren Sie zu einem peripheren Bereich des Mikrobrunnens, wählen Sie Sperren aus, und passen Sie den Fokus an die Z-Position der Kalibrierung an.

Wählen Sie dann Wiedergabe aus, um mit dem Fotomuster des Referenzmusters zu beginnen. Waschen Sie das Referenzmuster Microwell dreimal mit 20 Mikroliter PBS, um den Photoinitiator zu entfernen. Fügen Sie dann 20 Mikroliter fluoreszierend extrazellulärer Matrix oder ECM-Proteinlösung hinzu.

Inkubieren Sie die Schale bei Raumtemperatur für 10 bis 20 Minuten, um sicherzustellen, dass die Referenz gut vor Licht zu schützen. Nach der Inkubation 18 Mikroliter Proteinlösung entfernen und den Brunnen dreimal mit 20 Mikroliter PBS waschen. Verwenden Sie ein Epifluoreszenzmikroskop, um das Referenzmuster zu visualisieren.

Passen Sie den Fokus auf die Musterkanten durch den Kamerapfad an, und zeichnen Sie die Z-Position entsprechend dem besten Fokus auf. Diese Position wird der optimale Laserfokus für die nachfolgende Musterung verwendet. Entfernen Sie unter sterilen Bedingungen 18 Mikroliter PBS aus allen Mikrobrunnen.

Fügen Sie fünf Mikroliter des Photoinitiators zu jedem Brunnen hinzu und homogenisieren Sie, indem Sie nach oben und unten pfeifen. Wenn Sie mehrere Proteine im selben Mikrobrunnen mustern, laden Sie alle Sätze der gewünschten Mustervorlagen gleichzeitig hoch. Wählen Sie dann die Anzahl der Zeilen, Spalten und Dosis aus.

Speichern Sie die Vorlagenkonfiguration als Datei in der Software. Navigieren Sie zu dem Bereich, in dem das Referenzmuster erstellt wurde, und passen Sie den Fokus an die optimale Z-Position an. Wählen Sie dann Wiedergabe aus, um die Fotomusterung zu initiieren.

Die Designeinheiten drehen sich von rot zu blau, wenn die Fotomusterung abgeschlossen ist. Entfernen Sie den Photoinitiator aus den Mikrobrunnen, indem Sie ihn dreimal mit 20 MikroliterPBS waschen. Nach der letzten Wäsche 18 Mikroliter PBS aus jedem Mikrobrunnen entfernen und 20 Mikroliter ECM-Proteinlösung hinzufügen.

Inkubieren Sie das Gericht bei Raumtemperatur für 20 bis 30 Minuten, um es vor Licht zu schützen. Als nächstes entfernen Sie 15 Mikroliter der ECM-Proteinlösung und waschen Sie die Mikrobrunnen dreimal mit 20 Mikroliter PBS. Um eine Kreuzbindung zu vermeiden, fügen Sie 20 Mikroliter PLL-PEG oder BSA in die Mikrobrunnen ein und inkubieren Sie die Schale bei Raumtemperatur für eine Stunde im Dunkeln.

Entfernen Sie dann 15 Mikroliter des Blockiermittels und waschen Sie alle Mikrobrunnen dreimal mit 20 Mikroliter PBS. Entfernen Sie 18 Mikroliter PBS, und fügen Sie 5 Mikroliter des Photoinitiators zu jedem Mikrobrunnen hinzu, um sicherzustellen, dass der Photoinitiator auf der gesamten Oberfläche der Mikrobrunnen homogen ist. Navigieren Sie zum ersten Microwell, und laden Sie die zuvor gespeicherte Vorlagenkonfiguration.

Wählen Sie dann die Aktionen aus, die für die zweite Fotomusterrunde gemustert werden sollen, und stellen Sie sicher, dass die Auswahl der Aktionen aus der ersten Runde aufheben wird. Entfernen Sie PLPP nach dem Photomustern, indem Sie es mit PBS waschen. Dann 20 Minuten mit der zweiten ECM-Proteinlösung inkubieren und die Mikrobrunnen dreimal mit 20 Mikroliter PBS waschen.

Verwenden Sie ein Epifluoreszenzmikroskop, um die gedruckten Muster zu visualisieren und abzubilden. Wenn Sie bereit sind, die Zellen zu befestigen, fügen Sie dem inneren Glasgut einen Milliliter Medium mit Zellen hinzu, um sicherzustellen, dass alle Mikrobrunnen abgedeckt sind. Und legen Sie das Kulturgericht in einem 37 Grad Celsius, und 5% Kohlendioxid-Inkubator.

Um sicherzustellen, dass die erzeugten Muster eine präzise Darstellung der Schablonen sind, werden fluoreszenzintensive Messungen entlang der Streifen und aus einem entsprechenden Hintergrundbereich über jedem Streifen durchgeführt. Reproduzierbare definierte Mikromuster werden im Bereich von 20 bis 2 Mikrometern Breite erreicht, aber ein Kanteneffekt kann beobachtet werden, wenn Druckfunktionen von 20 Mikrometern oder breiter sind. Definierte Proteinkonzentrationen werden entweder durch Inkubation mit unterschiedlichen Proteinkonzentrationen oder durch Variation der Laserdosis, die zum Spalten des Antiklebstofffilms verwendet wird, erreicht.

Die Laserintensität ist proportional zum Graustufenniveau der Vorlage und erzeugt Gradienten der UV-Beleuchtung. Die Messung des Fluoreszenzintensitätsprofils entlang des Farbverlaufsstreifens ist linear in der Mustervorlage und im generierten Gradientenmuster. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Mikromuster mit mehreren Proteinen im gleichen Mikrobrunnen zu erstellen, wie z. B. Kreuzmuster mit horizontalen Streifen von Fibronectin und vertikale Lamininstreifen.

Aber ein Blockierungsschritt ist notwendig, um kreuzbindenvon Proteinen zu verhindern. Die erzeugten Kreuzmuster können anschließend für zelluläre Assays mit neuronalen Zelllinien oder CAD-Zellen oder primären Neuronen, Ratten-DRGs, verwendet werden. Bei der Durchführung dieses Protokolls sind die wichtigsten Aspekte, die Sie sich merken sollten, eine ordnungsgemäße Systemkalibrierung durchzuführen, die Mikrobrunnen während der mehrfachen Waschschritte nicht austrocknen zu lassen und die richtigen Parameter für die Inkubation und Blockierung von Proteinen zu verwenden.

Die Analyse des Zellverhaltens umfasst in der Regel Mikroskopie, wie Fluoreszenz, Zeitraffer, AFM. Weitere Charakterisierungen können andere biochemische Methoden umfassen, wie z. B. das Profiling der Genexpression.