Name: Herstellung von E. coli-exprimierenden selbstmontierenden Protein-Nanopartikeln für Impfstoffe, die eine trimerische Epitop-Präsentation erfordern (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 s
Description: Lernen Sie die Herstellung selbstmontierender Protein-Nanopartikel in E. coli für Impfstoffe mit trimerer Epitop-Präsentation. Diese Methode ermöglicht Reinigung, Refaltung und Charakterisierung für klinische Anwendungen.

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Diese Arbeit wurde durch eine Kooperationsvereinbarung (W81XWH-11-2-0174) zwischen der Henry M Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine, Inc. und dem US-Verteidigungsministerium unterstützt. Der Anti-HIV-1 gp41 mAb 167-D IV Antikörper wurde von Dr. Susan Zolla-Pazner über das NIH AIDS Reagenzprogramm erhalten.

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Die geäußerten Ansichten sind die der Autoren und sollten nicht so ausgelegt werden, dass sie die Positionen der US-Armee oder des Verteidigungsministeriums repräsentieren. Peter Burkhard hat Interesse an der Alpha-O Peptides AG und hat Patente auf die Technologie. Die anderen Autoren haben keine Zugehörigkeit oder finanzielle Beteiligung an einem Unternehmen mit einem finanziellen Interesse an dem in diesem Papier vorgestellten Thema.

Die Nanotechnologie bietet viele Vorteile und Lösungen für die Entwicklung von Impfstoffen aus Untereinheiten. Nanoimpfstoffe können wiederholt Antigene als Partikel für das Wirtsimmunsystem darstellen und die Immunogenität erhöhen26. Obwohl es viele verschiedene Arten von Nanoimpfstoffen gibt, glauben wir, dass solche, die aus de novo designten Proteinen bestehen, der stärkste Ansatz für die Impfstoffentwicklung zu sein scheinen1. Sie können ohne Sequenzhomologie zu den Wirtsproteinen entwickelt werden und präsentieren das Antigen von Interesse in der Nähe von nativen-ähnlichen Konformationen bei gleichzeitig niedrigen Produktionskosten und hohen Produkterträgen. Ein Paradebeispiel für diesen Ansatz ist die SAPN-Technologie, die wir auf Impfstoffe gegen mehrere Infektionskrankheiten angewendet haben7. Um die Schwierigkeiten bei der Entwicklung von HIV-1-Impfstoffen zu beheben, haben wir einen einzigartigen SHB-SAPN-Kern entwickelt, um das V1V2-Antigen effektiv in einer nativen trimeren Konformation9zu präsentieren. Viele Impfziele, insbesondere bei Viruserkrankungen, sindals Trimmer 27 vorhanden. Dieses Phänomen deutet darauf hin, dass unser SAPN-Design weitreichende Auswirkungen auf die Entwicklung von Subunit-Impfstoffen hat.
Mit dieser Methode zeigen wir, wie SHB-SAPNs in einem E. coli-Expressionssystem produziert werden. Wir drückten hohe Proteinerträge aus (ca. 6 mg/100 ml Kultur). Das Protein enthielt 10 Histidine und wurde leicht mit einer immobilisierten Metallaffinitätschromatographie mit Ni2+ Säule gereinigt. Diese Länge des His-Tags erwies sich als das Optimum für den höchsten Proteinertrag. Das gereinigte Protein enthielt die volle Länge des entworfenen Proteins, wie durch das Vorhandensein des N-terminalen HisTag und der C-Terminal-Heptad-Wiederholung angezeigt wird. Wir haben weithin akzeptierte Techniken eingesetzt und für den Ausdruck, die Produktion und die Charakterisierung des SHB-SAPN-Kerns optimiert. Ein Mangel an Produktion des Voll-Längen-Proteins während der Entwicklung eines SAPN, das ein neues Protein-Epitop enthält, könnte auf ein Expressionsproblem des Gens in der Wirtszelle hindeuten. Wenn dies geschieht, müssen das Gen und das Expressionssystem neu gestaltet und an das beschriebene Protokoll angepasst werden. Eine Änderung der Beschallungszeit oder -intensität kann auch die Konzentration des vorhergesagten Voll-Längen-Proteins erhöhen.
Umgeklappte Partikel lagen im erwarteten Größenbereich (20 bis 100 nm)8,24,25, wie durch DLS- und Nanopartikel-Tracking-Analyse bestimmt. Diese Ergebnisse wurden durch die Verwendung von TEM weiter bestätigt. Wenn es in diesem Schritt Probleme gibt, ist dies normalerweise auf ein Problem mit dem pH- oder Ionenstärke des Umfaltpuffers zurückzuführen. Wenn großformatige Partikel auf den Partikelgrößentechniken erkannt werden, zeigt dies eine Aggregation an, die durch Erhöhung des pH-Werts des Umfaltpuffers vermieden werden kann. Wenn die Partikel nicht von DLS erkannt werden, überprüfen Sie die Konzentration des Proteins und überprüfen Sie den pH-Wert des Puffers. Die endgültige Proteinkonzentration für DLS sollte mindestens 100 g/ml betragen. Wenn die Konzentration nicht das Problem ist, zeigt sie die Fülle kleiner, unvollständig gebildeter Teilchen an, deren Konzentration durch Senkung des pH-Werts reduziert werden kann. Alternativ kann die Natriumchloridkonzentration auf den optimalen Bereich eingestellt werden, um das Vorhandensein von Partikeln mit unerwünschter Größe zu minimieren.
Schließlich konnten wir durch die Verwendung eines Isopropanol-Waschschritts während der Reinigung die kontaminierende LPS vom Wirt E. coli auf 0,01 EU/g SAPN reduzieren, was unter dem Grenzwert von 5 EU/kg Körpergewicht für injizierbare Produkte liegt. 28. Dieser Pegel kann durch die Verwendung einer Anionenaustauschsäule, auch bekannt als Q-Spalte, weiter reduziert werden. Wenn noch hohe Konzentrationen an Endotoxin vorhanden sind, überprüfen Sie alle Materialien, die für die Puffervorbereitung verwendet wurden. Denken Sie daran, nur depyrogenierte Glaswaren und Endotoxin freie Kunststoffe in dieser Methode zu verwenden.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass wir erfolgreich eine Methode zur Herstellung des SHB-SAPN-Kerns entwickelt haben, die für präklinische Immunisierungsstudien verwendet werden kann. Diese Methode mit nur geringfügigen Änderungen, wenn überhaupt, kann auf die Reinigung von SHB-SAPNs angewendet werden, wenn ein Antigen von Interesse hinzugefügt wird. Mit dieser Methode als Ausgangspunkt ist eine der wichtigsten Änderungen im Elutionsschritt. Verschiedene Proteine werden in unterschiedlichen Imidazolkonzentrationen elute, die experimentell bestimmt werden müssen. Der andere große Unterschied könnte die Zusammensetzung des Umfaltungspuffers sein. Die Optimierung würde die Prüfung verschiedener pH-Bedingungen sowie ionischer Stärken erfordern.
Im Hinblick auf die zukünftige Arbeit sind nur zwei geringfügige Änderungen erforderlich, um eine menschliche Anwendung des SHB-SAPN zu ermöglichen. Die erste ist, dass der Expressionsvektor aufgrund der Ampicillinallergie beim Menschen in einen kanamycin-resistenzwählbaren Marker geändert werden muss29. Die andere wichtige Anforderung der Proteinherstellung für den menschlichen Gebrauch ist die Herstellung des SHB-SAPN in tierproduktfreien Medien. Eine kleine Studie zeigte bereits einen angemessenen Proteinertrag in einem pflanzlichen Medium. Die hier vorgestellte Arbeit ist für die ultimative GMP-Produktion leicht skalierbar, wie mit einem Malaria-Impfstoff-Kandidaten, FMP01416,demonstriert wurde. Diese groß angelegte FMP014-SAPN-Produktion umfasste sowohl den Anionenaustausch als auch die Kationenaustauschschritte, um den LPS- und Ni2+-Gehalt aus dem Endprodukt weiter zu reduzieren. Dieses bakterielle SAPN wurde bereits für eine bevorstehende klinische Phase 1/2a-Studie skaliert.

Während sich die traditionelle Impfstoffentwicklung auf die inaktivierten oder abgeschwächten Krankheitserreger konzentrierte, hat sich der Fokus moderner Impfstoffe auf Untereinheitsimpfstoffe verlagert1. Dieser Ansatz kann zu einer gezielteren Reaktion und potenziell wirksameren Impfstoffkandidaten führen. Einer der Hauptnachteile ist jedoch, dass Impfstoffe aus Untereinheiten keine Partikel wie ganze Organismen sind, was zu einer reduzierten Immunogenität führen kann2. Ein Nanopartikel als repetitives Antigen-Anzeigesystem kann sowohl die Vorteile des zielgerichteten Impfstoffansatzes der Untereinheit als auch die Partikelart des gesamten Organismus1,3haben.
Unter den bestehenden Arten von Nanoimpfstoffen ermöglichen rationell gestaltete Proteinassemblys das Design und die Entwicklung von Impfstoffkandidaten, die mehrere Kopien des Antigens möglicherweise in einer nativen Konformium darstellen können1,4 ,5,6. Ein Beispiel für diese Proteinassemblys sind die selbstzusammenstellungsreichenden Protein-Nanopartikel (SAPNs)7. SAPNs basieren auf Coiled-Coil-Domains und werden traditionell in Escherichia coli8ausgedrückt. SAPN-Impfstoffkandidaten wurden für eine Vielzahl von Krankheiten wie Malaria, SARS, Grippe, Toxoplasmose und HIV-19,10,11,12,13 entwickelt. , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. Die Konzeption jedes SAPN-Kandidaten ist spezifisch für den Pathogen von Interesse, jedoch sind die Herstellungs-, Reinigungs- und Umfaltungstechniken im Allgemeinen anwendbar.
Eines unserer aktuellen Interessen ist ein wirksamer HIV-1-Impfstoff. In RV144 – der einzigen klinischen Phase-III-Studie eines HIV-1-Impfstoffs, die eine bescheidene Wirksamkeit zeigte – korrelierte das reduzierte Infektionsrisiko mit IgG-Antikörpern mit der V1V2-Schleife des Hüllproteins20,21. Die native trimerische Darstellung dieser Region gilt als wichtig für die schützende Immunogenität22. Um die V1V2-Schleife möglichst nah an der nativen konformen Konformation zu präsentieren, haben wir einen Proof of Principle SAPN-Impfstoffkandidaten entwickelt, der den HIV-1-Hüllumschlag nach der Fusion (SHB) enthielt, um die V1V2-Schleife in die richtige Konformation 9 zu präsentieren. . Dieser Kandidat wurde von bekannten monoklonalen Antikörpern gegen HIV-1-Hüllkurvenprotein erkannt. Mäuse, die mit V1V2-SHB-SAPN immunisiert wurden, hoben V1V2-spezifische Antikörper auf, die vor allem an gp70 V1V2, die richtigen Konformalepitope9gebunden sind. Der SHB-SAPN-Kern könnte über die Rolle als Träger der HIV-1 V1V2-Schleife hinaus andere Funktionen haben. Hier beschreiben wir eine detaillierte Methodik für den Ausdruck, die Reinigung, das Umfalten und die Validierung des SHB-SAPN-Kerns. Die Sequenzauswahl, das Nanopartikeldesign, das molekulare Klonen und die Transformation von E. coli wurden zuvor beschrieben9.

<table><tbody><tr><td>10x Tris/Glycin/SDS</td><td>BioRad</td><td>1610732</td><td>1 L</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>BioRad</td><td>1610710</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fisher</td><td>BP26181</td><td>4 L</td></tr><tr><td>2x Laemmli Probenpuffer</td><td>BioRad</td><td>1610737</td><td>30 mL</td></tr><tr><td>40ul Küvette 100er Pack mit Stoppern</td><td>Malvern Panalytical</td><td>ZEN0040</td><td>100er Pack</td></tr><tr><td>4&ndash; 20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-Well, 30 & Mikro; l</td><td>BioRad</td><td>4561093</td><td>10er-Pack</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher</td><td>BP1760-25</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Anti-6X His-Tag-Antikörper [HIS. H8]</td><td>AbCam</td><td>ab18184</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>Anti-HIV-1 gp41 Monoklonal (167-D IV)</td><td>AIDS Reagent Repository</td><td>11681</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>BCIP/NBT Substrat, Lösung</td><td>Southern Biotech</td><td>0302-01 &nbsp;</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Einweg-Vakuumfilter/Aufbewahrungssysteme</td><td>Fisher</td><td>09-761-108</td><td>Eine Vielzahl von Größen</td></tr><tr><td>Formvar/Carbon 400 Mesh, Kupfer ca. Gitterlochgröße: 42&micro; m</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>01754-F</td><td>25er Pack</td></tr><tr><td>GE Healthcare&nbsp; 5 mL HisTrap HP Vorgepackte Säulen</td><td>GE HealthCare</td><td>45-000-325</td><td>5er Pack</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Fisher</td><td>BP229-4</td><td>4 L</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG H& L (alkalische Phosphatase)</td><td>ABCam</td><td>ab97020</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Fisher</td><td>O3196-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Instant fettfreie Trockenmilchqualität</td><td>Biologisch</td><td>A614-1003 10er</td><td>Pack</td></tr><tr><td>Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay</td><td>Lonza Walkersville</td><td>50650U</td><td>192 Test Kit</td></tr><tr><td>LAL Reagenzienqualität Multiwell-Platten</td><td>Lonza Walkersville</td><td>25-340</td><td>1 Platte</td></tr><tr><td>Magic Media E. coli Expressionsmedium</td><td>ThermoFisher</td><td>K6803</td><td>1 L</td></tr><tr><td>MilliporeSigma Millex Sterile Spritze 0,22 mm Filter</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RB</td><td>250er Pack</td></tr><tr><td>Maus Anti-Human IgG Fc-AP</td><td>Southern Biotech</td><td>9040-04 &nbsp;</td><td>1,0 mL</td></tr><tr><td>One Shot BL21 Star (DE3) Chemisch kompetent E. coli</td><td>ThermoFisher</td><td>C601003</td><td>20 Fläschchen</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Ungefärbte Proteinstandards, rekombinant mit Strep-Tagg,</td> <td>BioRad</td><td>1610363</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Dialysekassetten, 10K MWCO, 12 mL</td><td>ThermoFisher</td><td>66810</td><td>8er Pack</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher</td><td>BP358-212</td><td>2,5 kg</td></tr><tr><td>Monobasisches Natriumphosphat</td><td></td><td>Fisher BP329-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Tris-(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid</td><td>Biosynth</td><td>International C-1818</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Uranylacetat, Reagenz, ACS</td><td>Elektronenmikroskopie Dienstleistungen</td><td>541-09-3</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Fisher</td><td>BP169-500</td><td>2,5 kg</td></tr><tr><td>Whatman qualitatives Filterpapier</td><td>Sigma Aldrich</td><td>WHA10010155</td><td>Packung mit 500</td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>&nbsp; Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChromLab Software ver 4</td><td>BioRad</td><td>12009390</td><td>Software</td></tr><tr><td>Epoch 2 Mikroplatten-Spektralphotometer</td><td>BioTek</td><td>EPOCH2</td><td>Plate Reader</td></tr><tr><td>Fiberlite F14-14 x 50cy Festwinkelrotor</td><td>ThermoFisher</td><td>096-145075</td><td>Rotor</td></tr><tr><td>Gel Doc EZ Gel Dokumentationssystem</td><td>BioRad</td><td>1708270</td><td>Gel Imager für Fleckenfreie Gele</td></tr><tr><td>JEOL TEM</td><td>JEOL</td><td>1400</td><td>Transmissionselektronenmikroskop</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Vertikale Elektrophoresezelle für Mini-Fertigteilgele</td><td>BioRad</td><td>1658004</td><td>Zum Ausführen von Gelen</td></tr><tr><td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spektralphotometer</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-ONE-W</td><td>Für die Proteinkonzentration</td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td>Particle Dimensionierung</td></tr><tr><td>NanoSight NTA Software NTA</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td>Particle Sizing</td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 44/44R</td><td>Eppendorf</td><td>M1282-0000</td><td>Inkubator/Shaker</td></tr><tr><td>NGC Quest 10 Chromatographiesystem</td><td>BioRad</td><td>7880001</td><td>FPLC zur Unterstützung der Proteinreinigung</td></tr><tr><td>PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td><td>Ted Pella, INC</td><td>91000S</td><td>Zur Reinigung von Gittern</td></tr><tr><td>PowerPac Universal-Netzteil</td><td>BioRad</td><td>1645070</td><td>Zum Laufen Gele</td></tr><tr><td>Rocker Shaker</td><td>Daigger</td><td>EF5536A</td><td>Für Western</td></tr><tr><td>Sonifer 450</td><td>Branson</td><td>auch bekannt als 096-145075&nbsp;</td><td>Ultraschallgerät</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Zentrifuge</td><td>ThermoFisher</td><td>75-006-580</td><td>Zentrifuge</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Mini Nitrozellulose Transfer Packs</td><td>BioRad</td><td>1704158</td><td>für Western</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td><td>BioRad</td><td>1704150</td><td>für Western</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Daigger</td><td>EF3030A</td><td>Vortex</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td>Partikelgrößenbestimmung</td></tr><tr><td>Zetasizer Software</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td>Partikelgrößenbestimmung</td></tr></tbody></table>

herstellung von e. coli-exprimierenden selbstmontierenden protein-nanopartikeln für impfstoffe, die eine trimerische epitop-präsentation erfordern

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Selbstzusammenstellung sammle Protein-Nanopartikel (SAPNs) fungieren als repetitive Antigen-Displays und können zur Entwicklung einer breiten Palette von Impfstoffen gegen verschiedene Infektionskrankheiten verwendet werden. In diesem Artikel zeigen wir eine Methode zur Herstellung eines SAPN-Kerns, der eine Sechs-Helix-Bundle(SHB)-Baugruppe enthält, die Inderantigene in einer trimerischen Konformation darstellen kann. Wir beschreiben die Expression des SHB-SAPN in einem E. coli-System sowie die notwendigen Proteinreinigungsschritte. Wir haben einen Isopropanol-Waschschritt aufgenommen, um das verbleibende bakterielle Lipopolysaccharid zu reduzieren. Als Hinweis auf die Proteinidentität und Reinheit reagierte das Protein mit bekannten monoklonalen Antikörpern in Western-Blot-Analysen. Nach dem Umfalten fiel die Größe der Teilchen in den erwarteten Bereich (20 bis 100 nm), was durch dynamische Lichtstreuung, Nanopartikel-Tracking-Analyse und Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt wurde. Die hier beschriebene Methodik ist für den SHB-SAPN optimiert, kann jedoch nur geringfügig auf andere SAPN-Konstrukte angewendet werden. Diese Methode ist auch leicht auf die Großproduktion für die GMP-Herstellung für Menschliche Impfstoffe übertragbar.

Der hier gezeigte vollständig montierte SHB-SAPN basiert auf Proteinsequenzen (Abbildung 1A), die sich voraussichtlich in ein Teilchen falten, das 60 Kopien des Monomers enthält (Abbildung 1B). Abbildung 2 enthält einen Überblick über die Methode für die Produktion, Reinigung und Identifizierung des SHB-SAPN-Kerns. E. coli aus einem Glycerinbestand, der einen pPep-T-Expressionsvektor mit Gensequenz des SHB-SAPN-Kerns enthielt, wurde in BL21 (DE3) E. coli induziert. Bakterielle Zellen wurden erfolgreich angebaut und unter denaturierenden und reduzierenden Bedingungen lysiert.
Das gesamte Zelllysat wurde verwendet, um SHB-SAPN-Monomere durch FPLC mit einer Ni 2+-Spalte zu reinigen (Abbildung 3A). Der FPLC-Chromatograph zeigt, dass Proteine, die sowohl bei 150 mM als auch bei 500 mM Imidazol eluiert wurden (Abbildung 3A). Das Chromatogramm zeigt auch zwei weitere Spitzen bei 185 ml bzw. 210 ml Gesamtvolumen, die der Isopropanolwäsche bzw. der Imidazol-freien Wäsche entsprechen. Die Fraktionen und die Reinheit des rekombinanten Proteins wurden durch Gradienten-SDS-PAGE-Gele identifiziert (Abbildung 3B). Das protein von interest wurde in erster Linie in den Fraktionen 68'u201279 (278'u2012300 ml Gesamtvolumen) lokalisiert. Diese Fraktionen wurden für weitere Analysen kombiniert. Western Blot mit Anti-His-Antikörper (N-Terminal) und 167-D-IV-Antikörper (C-Terminus) deutete darauf hin, dass die gepoolten Fraktionen tatsächlich das Protein von Interesse waren (Abbildung 4A,B). Diese Flecken zeigten auch die Präsenz der SHB-SAPN Multimer. Frühere Washes und Elutionsfraktionen enthielten tendenziell eine höhere Konzentration an multimerisiertem Protein und wurden daher ausgeschlossen.
Die Proben, die die von Interesse sindden Proteinmonomere enthielten, wurden durch Dialyse in den vollständig montierten SHB-SAPN gefaltet. Die Partikelgrößenverteilung wurde durch DLS- und Nanopartikel-Tracking-Analyse bestimmt (Abbildung 5A,B). Die DLS identifizierte Partikel mit einem Z-durchschnittlichen hydrodynamischen Durchmesser von 67 nm, während das NTA-System eine mittlere Größe von 81 nm maß. Die leichten Größenunterschiede waren auf die Partikelgrößentechniken zurückzuführen, die Größe beider Analysen lag jedoch im erwarteten Bereich von 20-u2012100 nm8,24,25. SHB-SAPNs wurden von TEM visualisiert und die Bilder zeigten wohlgeformte Einzelteilchen mit der Größenverteilung, die aus den beiden Partikelgrößentechniken gewonnen wurde (Abbildung 5C).
Während der Reinigung des Proteins wurde die Säule mit Isopropanol gewaschen, um die LPS-Kontamination im endgültigen SHB-SAPN-Produkt zu verringern. Um zu überprüfen, ob der Endotoxinspiegel für die Immunisierung akzeptabel war, wurde die Konzentration von LPS in SHB-SAPN-Proben, die mit oder ohne Isopropanol-Waschschritt gereinigt wurden, durch einen kinetischen LAL-Assay bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Isopropanolwäsche die Endotoxinwerte von &gt;0,25 EU/g auf 0,010 EU/g SHB-SAPN-Protein verringerte (Tabelle 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig1.jpg"> Abbildung 1: SHB-SAPN-Proteinsequenz und -struktur. (A) Die Aminosäuresequenz des SHB-SAPN-Monomers. (B) Computermodell der Struktur des vollständig montierten SHB-SAPN-Kerns bestehend aus 60 Proteinmonomeren. Farbschema für Aminosäuresequenzen: Grau = HisTag; Grün = Pentamer; Dunkelblau = de novo entworfen Trimmer; Hellblau = Sechs-Helix-Bundle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig2.jpg"> Abbildung 2: Flussdiagramm der Protokoll für die SHB-SAPN-Produktion. Farbschema: Schwarz = Expression des Proteinmonomers in E. coli; Dunkelgrau = Monomerreinigung; Mittelgrau = Monomer-Identifikation; Hellgrau = Umfalten und Charakterisieren; Weiß = vollständig montiertes SHB-SAPN-Produkt. In Schritten, die mit dunkel und mittelgrau gekennzeichnet sind, ist das Protein unter denaturierenden und reduzierenden Bedingungen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig3.jpg"> Abbildung 3: Proteinreinigung der SHB-SAPN-Monomere. (A) Chromatograph aus der FPLC-Reinigung. Die grüne Linie über dem Chromatogramm zeigt die Reinigungsschritte an. Blaue Linie im Chromatogramm stellt die optische Dichte der Fraktionen bei 280 nm Wellenlänge dar. Die schwarze Linie zeigt, welcher Prozentsatz des Puffers B (8 M Harnstoff, 20 mM Tris, 50 mM Natriumphosphat monobasic, 5 mM TCEP, 500 mM Imidazol, pH 8,5) in jeder Phase der Reinigung verwendet wurde. (B) SDS-PAGE Gele der gepoolten Fraktionen aus dem Lysat (L), durchfließen (FT), Erste Wäsche (W1), Isopropanolwäsche (W2), dritte Waschung (W3) und einzelne Fraktionen aus dem 150 mM Imidazol (E150) und 500 mM Imidazol (E500) reinigung. Molekulare Marker in der ersten Spur (M) identifizieren Bänder zwischen 10 und 250 kDa. Das Zielprotein wird durch einen schwarzen Pfeil angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig4.jpg"> Abbildung 4: Identifizierung des Proteins durch Western Blot. Alle Bahnen sind mit 100 ng Protein beladen. (A) Ergebnisse eines westlichen Blots mit Anti-6x HisTag. (B) Ergebnisse eines westlichen Flecks mit einem 167-D-IV HIV-1 monoklonalen Antikörper. Bahnen sind wie beschriftet als: M = Molekulargewichtsmarker; 1 = Lysat; 2 = Durchfließen; 3 = erste Wäsche; 4 = Isopropanolwäsche (zweite Wäsche); 5 = dritte Wäsche; 6 = gepoolte Volumenfraktionen 56-u201261 (erste Elutionsspitze), 7 = gepoolte Volumenfraktionen 62-u2201267 (zwischen den beiden Spitzen), 8 = gepoolte Volumenfraktionen 68-u201278 (zweite Elutionsspitze). Zielprotein mit der erwarteten Bandgröße von 18,07 kDa als monomeres SHB-SAPN-Band wird durch einen schwarzen Pfeil angezeigt. Zusätzliche Bänder in den Bahnen 7 und 8 sind Dimer, Trimmer und Multimer des SHB-SAPN (roter Pfeil). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig5v2.jpg"> Abbildung 5: Charakterisierung des neu gefalteten SHB-SAPN. (A). Partikelgrößenverteilung, die von DLS bestimmt wird. (B) Partikelgröße, die durch Nanopartikelverfolgung (System) bestimmt wird. (C) Visualisierung der SHB-SAPN-Partikel durch TEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>probe</td>
			<td>Endotoxin (EU/ml)</td>
			<td>Endotoxin (EU/g Protein)</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAPN mit Isopropanol Wash</td>
			<td>2.02</td>
			<td>0.01</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAPN ohne Isopropanol Wash</td>
			<td>&gt;50</td>
			<td>&gt;0,25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Negative Kontrolle</td>
			<td>Unterhalb der Erkennungsstufe</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Endotoxingehalte von umgeklappten SHB-SAPNs. Endotoxingehalte in SHB-SAPN-Proben, die mit oder ohne Isopropanolwäsche gereinigt werden, sowohl als Endotoxineinheiten/ml als auch als Endotoxineinheiten/g SHB-SAPN-Protein dargestellt.

Hier wird eine detaillierte Methode zur Beschreibung der Reinigung, Umfaltung und Charakterisierung selbstassemblierender Protein-Nanopartikel (SAPNs) für die Impfstoffentwicklung beschrieben.

Herstellung von E. coli-exprimierenden selbstmontierenden Protein-Nanopartikeln für Impfstoffe, die eine trimerische Epitop-Präsentation erfordern

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...

Selbstzusammenstellung von Protein-Nanopartikeln oder SAPNs kann zur Entwicklung von Impfstoffen gegen verschiedene Infektionskrankheiten verwendet werden. Diese Methode, die wir hier beschreiben, kann verwendet werden, um SAPNs zu reinigen, neu zu falten und zu charakterisieren, die ein Sechs-Helix-Bundle enthalten. Dieses Nanopartikel kann trimerische Antigene in einer nativen konformen Konformation darstellen.Mit leichten Modifikationen kann diese Methode auch auf andere innovative SAPN-Impfstoffkonstrukte angewendet werden. Darüber hinaus kann es leicht auf großflächige Produktion für klinische Studien übertragbar sein. Für die Lyse der geernteten E.coli, die das Sechs-Helix-Bundle SAPN exzessient, verwenden Sie eine Sonde mit der Beschallungsleistung von 150 Watt mit vier Sekunden Beschallung und sechs Sekunden Ruhezeit, um resuspendierte Bakterienpellets in 40 Milliliterimidazol-freiem Puffer auf Eis für fünf Minuten zu beschallen.Zentrifugieren Sie das zelluläre Lysat, um einen geklärten Überstand zu erzeugen, und übertragen Sie den Überstand in einen sterilen 150-Milliliter-Kolben. Dann bringen Sie die Probe auf ein endgültiges Volumen von 100 Milliliter mit frischem Imidazol-freien Puffer. Um das Protein von Interesse zu isolieren, öffnen Sie die FPLC-Software und klicken Sie auf die Option Neue Methode.Öffnen Sie im Menü Methodeneinstellungen das Dropdown-Menü Spaltenposition, und wählen Sie C1-Port 3 aus. Wählen Sie im Dropdownmenü Gezeigt nach Technik Affinität aus. Wählen Sie im Dropdownmenü Spaltentyp Andere, HisTrap HP und fünf Milliliter aus.Das Spaltenvolumen und die Druckfelder werden automatisch auf die entsprechenden Werte gesetzt. Klicken Sie auf Methodenumriss, und ziehen Sie die Schaltflächen "Ausgleich" und "Beispielanwendung", drei Spaltenwäscheschaltflächen und die Schaltfläche Elution aus dem Popupmenü Phasenbibliothek neben dem Pfeil, bevor Sie das Menü Phasenbibliothek schließen. Klicken Sie auf Ausgleich, und legen Sie die in der Tabelle aufgeführten Werte auf Anfangspuffer B, 4%Endpuffer B, 4 % und Spaltenvolumen, fünf fest.Klicken Sie auf Beispielanwendung. Klicken Sie im Feld Beispielbeladung auf das Optionsfeld für Das Einfügen von Sample auf Spalte mit Sample Pumpe, und bestätigen Sie, dass das Kontrollkästchen Flow-Rate aus Methodeneinstellungen verwenden im Feld Probeninjektion mit Systempumpe aktiviert ist. Ändern Sie den Volume-Boxwert auf 100 Milliliter und das Fraction Collection Scheme auf Aktivieren.Deaktivieren Sie das Feld Bruchgröße aus Methodeneinstellungen verwenden, und ändern Sie die Bruchgröße auf vier Milliliter. Klicken Sie auf die erste Schaltfläche Spaltenwäsche, legen Sie die in der Tabelle aufgeführten Werte auf Anfangspuffer B, 4%Endpuffer B, 4% und Spaltenvolumen, 10 fest. Klicken Sie auf das Feld Fraction Collection Scheme Enable, und klicken Sie auf die Größe der Fraktion aus den Methodeneinstellungen verwenden.Ändern Sie die Bruchgröße auf vier Milliliter, und klicken Sie auf die zweite Spalte waschen. Legen Sie die Werte in der Tabelle auf Anfangspuffer B, 0%Endpuffer B, 0% und Spaltenvolume, fünf fest. Klicken Sie auf das Feld Fraction Collection Scheme Enable, und klicken Sie auf die Größe der Fraktion aus den Methodeneinstellungen verwenden.Ändern Sie die Bruchgröße auf vier Milliliter, und klicken Sie auf die dritte Spalte waschen. Legen Sie die Werte in der Tabelle auf Anfangspuffer B, 0%Endpuffer B, 0% und Spaltenvolume, 10 fest. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Bruchsammlungsschema aktivieren", und deaktivieren Sie das Feld Bruchgröße aus Methodeneinstellungen verwenden.Ändern Sie dann die Bruchgröße auf vier Milliliter. Klicken Sie auf die Schaltfläche Elution und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Informationen in der Tabelle. Klicken Sie im Popup-Menü auf Schritt löschen, und ziehen Sie die Schaltfläche Isokratischer Farbverlauf zweimal auf die Tabelle, sodass es zwei Einträge gibt.Legen Sie den Wert für den ersten Eintrag auf Anfangspuffer B, 30%Endpuffer B, 30 % und Spaltenvolume, 10 fest. Legen Sie den Wert für den zweiten Eintrag auf Initial Buffer B, 100%Final Buffer B, 100% und Column Volume, 10 fest. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Bruchsammlungsschema aktivieren", und klicken Sie auf das Feld Bruchbruchgröße aus Methodeneinstellungen verwenden.Klicken Sie dann auf Speichern unter, und benennen Sie die Dateireinigung. Legen Sie die Pumpe A-Schläuche des FPLC in den Imidazol-freien Waschpuffer und die Pumpe B-Schläuche in den 500-Millimolar-Imidazolpuffer. Legen Sie den Probenpumpenschlauch in die 100-Milliliter-Probe und führen Sie das Reinigungsprogramm aus.Wenn die 60%Isopropanol-Wäsche benötigt wird, halten Sie das Programm an, verschieben Sie die Pumpe A-Schläuche aus dem Imidazol-freien Waschen in die 60%Isopropanol-Wäsche, und starten Sie das Programm neu. Am Ende der Wäsche, halten Sie das Programm erneut, geben Sie die Pumpe A Schlauch in den imidazolfreien Waschpuffer, und starten Sie das Reinigungsprogramm. Um die Reinheit des gereinigten Proteins zu beurteilen, kombinieren Sie zunächst die Fraktionen aus dem Durchfluss, waschen Sie einen, waschen Sie zwei und waschen Sie drei Schritte, in einzelnen 50-Milliliter-Konikonröhren.Als nächstes mischen Sie 15 Mikroliter aus jedem Probenröhrchen mit 15 Mikroliter 2X Laemmli Puffer in einzelnen 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohren und denaturieren die Proben bei 95 Grad Celsius für 10 Minuten. Am Ende der Inkubation wird ein Gellaufgerät mit drei fleckenfreien vier bis 20% vorgefertigten Polyacrylamidgelen im Tris-Glycin-SDS-PAGE-Laufpuffer aufgestellt. Laden Sie acht Mikroliter Molekulargewichtsmarker auf den ersten Brunnen jedes Gels und 30 Mikroliter denaturierter Probe in die anderen Brunnen.Führen Sie die Gele mit 200 Volt, bis die Farbfront auf den Boden des Gels trifft und spülen Sie die Gele kurz mit entionisiertem Wasser ab, bevor Sie sofort mit einem fleckenfreien Bildgebungssystem bildgeben. Identifizieren Sie dann die Fraktionen, die Proteinbänder mit der richtigen Größe enthalten, und bündeln Sie diese Fraktionen. Für das Sechs-Helix-Bundle SAPN-Umfalten 10 bis 20 Milliliter gepooltes Protein zu einer 10 Kilodalton-Molekulargewichts-Cut-off-Dialysekassette hinzufügen.Dialyze die Kassette in acht Molharnstoff, 20-Millimolar Tris, 5%Glycerin und fünf Millimolar TCEP bei Raumtemperatur über Nacht. Am nächsten Morgen die Harnstoffkonzentration im Dialysepuffer schrittweise um zwei Mol alle zwei Stunden zu verringern, um den Harnstoff langsam aus der Probe zu dialysieren. Wenn die Harnstoffkonzentration zwei Mol erreicht, bewegen Sie das Dialysegerät auf vier Grad Celsius und dialysieren Sie die Probe in 120-Millimolar-Harnstoff, 20-Millimolar Tris und 5% Glycerin über Nacht, um die Umfaltung zu beenden.Am nächsten Morgen das umgeklappte Protein aus der Kassette entfernen und das Sechs-Helix-Bündel SAPN durch einen 0,22-Mikrometer-Polyvinyliden-Fluorid-Spritzenfilter filtern. Um die mittlere Partikelgröße des Sechs-Helix-Bündels SAPN zu messen, fügen Sie 45 Mikroliter Sechs-Helix-Bundle SAPN zu einer Einwegküvette hinzu und legen Sie die Küvette in die DLS-Maschine. Erstellen Sie als Nächstes eine neue Messdatei und führen Sie ein vorgefertigtes Standardbetriebsverfahren für Proteine in 120-Millimolar-Harnstoff, 20-Millimolar-Tris und 5% Glycerinpuffer bei 25 Grad Celsius aus.Starten Sie dann die Messung. Die Größe des Z-Durchschnitts, die PDI und die Verteilungsergebnisse werden für jeden Durchlauf berechnet. Die Maschine liest das Beispiel fünfmal.Dieses komplett montierte Sechs-Helix-Bundle SAPN basiert auf Proteinsequenzen, die sich voraussichtlich zu einem Teilchen falten, das 60 Kopien des Monomers enthält. Totales Zelllysat wurde verwendet, um das Sechs-Helix-Bundle SAPN-Monomere mittels FPLC mit einer Nickelsäule zu reinigen, was zeigt, dass das Protein sowohl bei 150- als auch bei 500-Millimolar-Imidazol eluierte. Das Chromatogramm zeigt auch zwei weitere Spitzen bei 185 bzw. 210 Milliliter Gesamtvolumen, die der Isopropanolwäsche bzw. der Imidazol-freien Wäsche entsprechen.Die Fraktionen und die Reinheit des rekombinanten Proteins konnten durch Gradienten-SDS-PAGE-Gele identifiziert werden, wobei sich das Protein in erster Linie in Fraktion 68 bis 79 befindet. Western Blot Analyse mit Anti-His und Anti-167D4 Antikörper neratonen darauf, dass die gepoolten Fraktionen tatsächlich das Protein von Interesse waren. Die Flecken zeigten auch das Vorhandensein des Sechs-Helix-Bundles SAPN-Multimer.Die Proben, die die von Interesse wichtigen Proteinmonomere enthielten, wurden durch Dialyse in das vollmontierte Sechs-Helix-Bundle SAPN gefaltet und die Partikelgrößenverteilung wurde durch DLS- und Nanopartikel-Tracking-Analyse bestimmt. Die Visualisierung durch Transmissionselektronenmikroskopie ergab wohlgeformte einzelne Sechs-Helix-Bundle-SAPN-Partikel mit der Größenverteilung, die aus den beiden Partikelgrößentechniken gewonnen wurde. Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist die Neufaltung des Sechs-Helix-Bundles SAPN.Der richtige pH-Wert und die Ionenstärke des Umfaltpuffers sind unerlässlich. Mit einer Isopropanol-Waschanlage während der Reinigung konnten wir die Kontaminierung von LPS auf ein sehr niedriges Niveau reduzieren. LPS kann jedoch bei Bedarf durch eine Anionenaustauschsäule weiter reduziert werden.Diese Technologie kann leicht für den menschlichen Einsatz angepasst werden. Ein bakterielles SAPN wurde bereits für eine bevorstehende klinische Phase 1/2a-Malaria-Studie skaliert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Erzeugung von multivalent anzeigenden Impfstoffen mit äußerem Membranvesikel (OMV). Säugetierzellen werden transfiziert, um virale Antigene zu exprimieren und zu sezernieren, die mit einem SpyTag und einem Polyhistidin-Tag fusioniert sind. Diese Antigene werden dann mit einer Nickel-Nitriotriessigsäure (Ni-NTA)-Affinitätssäule aufgereinigt. Das gereinigte Antigen wird mit äußeren Membranvesikeln gemischt, die das oberflächengebundene SpyCatcher...

Erzeugung eines multivalent anzeigenden Impfstoffs gegen äußere Membranvesikel

Dieses Video zeigt die Herstellung von Nanoemulsions-Tumorimpfstoffen. Die stabilen Ölreservoir-Depots, die synthetische Peptide und Adjuvantien enthalten, werden durch niederenergetische Nanoemulsionen hergestellt, was für die Tumorimmuntherapie vielversprechend ist.

Herstellung eines adjuvanten Nanoemulsionsimpfstoffs

Dieses Video zeigt eine Methode zur Erzeugung eines mRNA-Impfstoffkandidaten unter Verwendung von polymeren Nanopartikeln. Das kationische Polymer interagiert mit negativ geladener mRNA und bildet Polyplexe. Die Bildung von Polyplexen stabilisiert die mRNA und macht sie zu einem potenziellen Kandidaten für zukünftige mRNA-Impfstoffe in immuntherapeutischen Anwendungen.

Formulierung von mRNA-beladenen Nanopartikeln für Impfzwecke

Dieses Video zeigt die Aufreinigung von Histidin-markierten selbstorganisierten Protein-Nanopartikeln oder SAPNs mittels Affinitätsflüssigkeitschromatographie. Die daraus resultierenden gereinigten SAPN-Fraktionen eignen sich für die Impfstoffentwicklung und sind vielversprechend für potenzielle immuntherapeutische Anwendungen.

Aufreinigung von selbstorganisierenden Protein-Nanopartikeln mittels Affinitätschromatographie

Hier stellen wir ein Protokoll für die Synthese von virusähnlichen Partikeln entweder Baculovirus oder Säuger-Expressionssystemen und Ultrazentrifugation Reinigung. Dieser hochgradig anpassbare Ansatz wird verwendet, um virale Antigene als Impfstoff Ziele in eine sichere und flexible Art und Weise identifizieren.

Expression und Reinigung von virusähnlichen Partikeln zur Vakzinierung

Hier präsentieren die Autoren ein einfaches und effizientes Protokoll zur Definition eines linearen antigenen Epitops unter Verwendung eines gereinigten monoklonalen Antikörpers und Peptid-Scans durch Dot-Blot-Hybridisierung. Das identifizierte Epitop kann dann in therapeutischen und diagnostischen Anwendungen eingesetzt werden.

Peptid-Scanning-gestützte Identifizierung eines monoklonalen Antikörpers anerkannte Linear B-Zell-Epitop

Die genetische Codeerweiterung wird für die Einführung einer unnatürlichen Aminosäure angewendet, die eine biorthogonale funktionelle Gruppe auf einem Trägerprotein an einem definierten Ort trägt. Die biorthogonale Funktion wird weiter für die standortselektive Kopplung eines Kohlenhydratantigens verwendet, um einen homogenen Glykonokjugate-Impfstoff bereitzustellen.

Homogenes Glycoconjugate hergestellt durch kombinierte unnatürliche Aminosäure-Inkorporation und Click-Chemie für Impfstoffzwecke

Hier wird ein einfaches Protokoll zur Herstellung von mRNA-Nanopartikeln auf Basis von Poly(beta-Aminoester)-Polymeren vorgestellt, das einfach durch Änderung der verkapselten mRNA angepasst werden kann. Der Workflow für die Synthese der Polymere, der Nanopartikel und deren in vitro essentielle Charakterisierung werden ebenfalls beschrieben. Ein Proof-of-Concept zur Immunisierung wird ebenfalls hinzugefügt.

Synthese und Charakterisierung von mRNA-beladenen Poly(beta-Aminoestern) Nanopartikeln für Impfzwecke

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung kommerzieller, zellfreier Proteinexpressionskits zur Herstellung von Membranproteinen, die in Nanodisc unterstützt werden und als Antigene in Subunit-Impfstoffen verwendet werden können.

Zellfreie skalierte Produktion und adjuvante Zugabe zu einem rekombinanten Haupt-Außenmembranprotein aus Chlamydia muridarum für die Impfstoffentwicklung

Das vorliegende Protokoll beschreibt das Bioengineering von äußeren Membranvesikeln als "Plug-and-Display"-Impfstoffplattform, einschließlich Produktion, Reinigung, Biokonjugation und Charakterisierung.

Eine "Plug-and-Display"-Nanopartikel-Impfstoffplattform basierend auf äußeren Membranvesikeln mit SARS-CoV-2-Rezeptorbindungsdomäne

Hier stellen wir detaillierte Methoden zur Herstellung und Evaluierung des nasalen selbstassemblierten Nanoemulsions-Tumorimpfstoffs in vitro und in vivo vor.

Herstellung, Eigenschaften, Toxizität und Wirksamkeitsbewertung des nasalen selbstassemblierten Nanoemulsions-Tumorimpfstoffs in vitro und in vivo

Lernen Sie die Herstellung selbstmontierender Protein-Nanopartikel in E. coli für Impfstoffe mit trimerer Epitop-Präsentation. Diese Methode ermöglicht Reinigung, Refaltung und Charakterisierung für klinische Anwendungen.

Herstellung von E. coli-exprimierenden selbstmontierenden Protein-Nanopartikeln für Impfstoffe, die eine trimerische Epitop-Präsentation erfordern (Video) | JoVE Journal

Herstellung von E. coli-exprimierenden selbstmontierenden Protein-Nanopartikeln für Impfstoffe, die eine trimerische Epitop-Präsentation erfordern

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