Human Adipose Tissue Mikrofragmentierung für Zell-Phänotypisierung und Secretome-Charakterisierung

Mit diesem System können wir die Submillimeter-Cluster des menschlichen Fettgewebes sammeln, in denen die gesamte Mikroumgebung von regenerativen Zellen intakt ist. Das gesamte mikrovaskuläre System ist ebenfalls intakt, und so können wir diese Art von Mikroorganen für In-vivo-Transplantationen zur In-vitro-Kultur und zur Zellisolation zur weiteren Charakterisierung nutzen. Die Hauptbegründung für den Einsatz des Systems im Forschungslabor ist, dass der Prozess völlig enzymfrei ist, und so ermöglicht es die schnelle und effiziente Verarbeitung von menschlichem Fettgewebe unter Beibehaltung einer Mikroarchitektur und es wird die Mikrovaskulatur des Gewebes völlig intakt sein.

Und so können wir direkt ein Zelltherapieprodukt studieren, das sich in der Klinik bereits als sehr nützlich erwiesen hat. Diese geschlossene Systemtechnologie ist eine einfach zu bedienende Technik zur intraoperativen Ernte, Verarbeitung und Reinjektion von raffiniertem Fettgewebe und kann erfolgreich in der kosmetischen Orthopädie, Proktologie und auch gynäkologischen Anwendung gebracht werden. Diese Methode ermöglicht eine weitere Untersuchung der Auswirkungen von Fett bei der Geweberegeneration.

Das Verfahren wird von Bianca Vezzani, einer Postdoktorandin, und von Mario Gomez-Salazar, einem Doktoranden, demonstriert. Arbeiten Sie unter aseptischen Bedingungen innerhalb von 16 Stunden nach der Ernte, legen Sie die Abdominoplastikprobe auf ein chirurgisches Tuch mit der Haut nach oben. Verwenden Sie eine Einweg-Gewebeinfiltrationskanüle, um 50 bis 100 Milliliter 37 Grad Celsius 0,9% Natriumchloridlösung in das subkutane Fettgewebe zu injizieren.

Verbinden Sie eine 10 Milliliter Luer Lock Spritze mit einer Einweg-Liposuktionskanüle und greifen Sie die Probe an der Hautregion in der Nähe eines Rands der Probe, bringen Sie die Kanüle vorsichtig in das Fettgewebe ein. Sobald sich die Kanüle im Gewebe befindet, extrahieren Sie den Kolben und bewegen Sie die Kanüle radial innerhalb der Fettgewebeprobe. Es ist wichtig, das Fettgewebe während der Lipo-Aspiration fest zu behandeln.

Wenn nicht genug Fett gesammelt wird, erwägen Sie eine zusätzliche Saline-Injektion. Wenn die Spritze voll von Lipo-Aspirat ist, entfernen Sie vorsichtig die Kanüle aus dem Gewebe und ersetzen Sie die volle Spritze durch eine neue leere Spritze, bis insgesamt 60 Milliliter Aspirat geerntet sind. Entfernen Sie zur Mikrofragmentierung des Lipo-Aspirats das Gerät aus der Verpackung und überprüfen Sie, ob die Haupteinheit mit dem Abfallbeutel verbunden ist.

Legen Sie den Abfallsammelbeutel auf den Boden, und stellen Sie sicher, dass die Ventile an den Verschlüssen der Prozesseinheit befestigt sind. Pierce den Sackanschluss, um die Klemmspitze der Eingangsleitung in den Saline-Beutel zu verbinden und den Saline-Beutel höher als die Verarbeitungseinheit zu positionieren. Stellen Sie sicher, dass alle fünf Klemmen, die mit den Rohren der Schaltkreise verbunden sind, geöffnet sind, platzieren Sie die Verarbeitungseinheit in einer vertikalen Position, lassen Sie die Saline-Lösung die Verarbeitungseinheit befüllen und bestätigen Sie, dass der Durchfluss den Abfallbeutel erreicht.

Schütteln Sie die Verarbeitungseinheit, um Luftblasen zu entfernen, und platzieren Sie das Gerät in einer vertikalen Position mit der blauen Kappe nach oben. Schließen Sie die Klemme neben der Eingangsleitung und schließen Sie eine Spritze mit Lipo-Aspirat an das selbstverschließende Ventil der blauen Eingangskappe, um mit der Injektion des Lipo-Aspirats zu beginnen. Halten Sie die Verarbeitungseinheit vertikal, drücken Sie langsam auf den Spritzenkolben, bis das gesamte Lipo-Aspirat auf das Gerät übertragen wurde.

Wenn das gesamte Lipo-Aspirat injiziert wurde, öffnen Sie die Eingangsklemme, um den Saline-Fluss wiederherzustellen, und schütteln Sie die Verarbeitungseinheit mindestens zwei Minuten lang kräftig, und überprüfen Sie regelmäßig den Schaummittellösungsfluss in den Abfallbeutel. Wenn die Saline-Lösung in der Verarbeitungseinheit transparent wird, legen Sie das Gerät mit der grauen Kappe nach oben und schließen Sie die Klemmen, die sich am Abfluss in der Nähe der blauen und grauen Kappen befinden. Das verarbeitete Gewebe schwebt oben.

Als nächstes füllen Sie eine 10 Milliliter Luer-Sperrspritze mit Einer saline Lösung und schließen Sie die Spritze an das Ladeventil der blauen Kappe an. Schließen Sie eine leere 10 Milliliter Luer-Sperrspritze mit vollständig an das Ventil der grauen Kappe eingesetzten Kolben an. Die Saline aus der blauen Kappe fest in die Verarbeitungseinheit einspritzen und überprüfen, ob die mit dem grauen Ventil verbundene Spritze folglich mit dem verarbeiteten Gewebe gefüllt wird.

Wenn die gesamte Saline injiziert wurde, entfernen Sie vorsichtig beide Spritzen und wiederholen Sie die Saline-Infusion, bis das gesamte verarbeitete Gewebe gesammelt wurde. Am Ende der Verarbeitung alle Spritzen entfernen, alle Klemmen schließen, den Salinebeutel lösen und das Gerät nach lokalen Protokollen entsorgen. Wenn das gesamte verarbeitete Gewebe gesammelt wurde, übertragen Sie das mikrofragmentierte Fettgewebe in einen sterilen Behälter und fügen Sie dem Behälter ein gleiches Volumen an Verdauungsmedium hinzu.

Legen Sie den versiegelten Behälter in ein 37 Grad Celsius schüttelendes Wasserbad, das 45 Minuten lang auf 120 Umdrehungen pro Minute eingestellt ist, wodurch die Verdauung mit einem gleichen Volumen an Blockierlösung am Ende der Inkubation gestoppt wird. Sequentiell die Probe filtern, zunächst durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb, gefolgt von Filtration durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb und Zentrifuge die gefilterte Suspension für fünf Minuten bei 200 mal g. Wir setzen das Pellet in ca. 5 Milliliter Erythrozytenlysepuffer für 15 Minuten bei Raumtemperatur aus.

Stoppen Sie die Lyse mit einem gleichen Volumen der Blockierlösung und filtern Sie die Lösung durch ein 40 Mikrometer Zellsieb. Dann sammeln Sie die mikrofragmentierten Fettgewebezellen durch Zentrifugation und wir setzen das Pellet in frischer Blocklösung mit Mehl-Mischung zum Zählen aus. Nach Dissoziation und Antikörperfärbung können mikrofragmentierte Fettzellen zur Zellanalyse und/oder Sortierung zum Durchflusszytometer gebracht werden.

Die mechanische Dissoziation manueller Lipo-Aspirationen führt zur Herstellung von mikrofragmentiertem Fettgewebe, das aus einem Aggregat von Adipozyten besteht, die ein mikrovaskuläres Netzwerk umhüllen. Die Immunfluoreszenzanalyse von Gelatine, die in kryokoniertes mikrofragmentiertes Fettgewebe eingebettet ist, hebt die Struktur hervor und zeigt das Gefäßnetzwerk, das durch den Endothelzellmarker Ulex Europaeus Agglutinin 1-Rezeptor gekennzeichnet ist und hauptsächlich aus kleinen kapillarartigen Gefäßen besteht. Insbesondere pericyte, die neuron-gliale Antigen 2 oder Thrombozyten-abgeleiteten Wachstumsfaktor-Rezeptor Beta exemiten, sind normal verteilt, Ensheathing Endothelzellen.

Durch den Ausschluss von CD31-positiven endotheliale und CD45-positiven hämatopoetischen Zellen kann das Vorhandensein von CD146-positiven CD34-negativen Pericyten und CD146-negativen und CD34-positiven adventlichen Zellen innerhalb des MAT identifiziert werden. Manuelle Lipo-Aspiration ist ein kritischer Teil des Verfahrens und muss unter sterilen Bedingungen nicht mehr als 16 Stunden nach der Abdominoplastik durchgeführt werden. Mikrofragmentiertes Fettgewebe kann durch immunhistochemische Färbung, In-vitro-Kultur oder Sekrelomanalyse weiterverarbeitet werden, um einen tieferen Einblick in die Fettgewebebiologie zu erhalten.

Diese Technik ermöglicht das Studium verschiedener Gewebe in ihrer natürlichen, nativen, dreidimensionalen Anordnung als eine Art kleine Organoide, die klein genug sind, um in Mäuse ngetinnen oder in der Langzeitkultur gehalten zu werden. Und wir nutzen dieses System hauptsächlich, um die verschiedenen organspezifischen Mikroumgebungen experimentell anzusprechen. Unsere Fettgewebespender sind nicht als Träger übertragbarer Infektionen bekannt.

In Ermangelung eines weiteren Screenings sollten jedoch alle menschlichen Gewebe als potenziell kontaminiert betrachtet und entsprechend behandelt werden.