Biaxialer Basalton und passive Tests des Murine Reproduktionssystems mit einem Druckmyographen
13. August 2019
Dieses Protokoll nutzte ein kommerziell erhältliches Druckmyographensystem, um Druckmyographentests an der murinen Vagina und dem Gebärmutterhals durchzuführen. Unter Verwendung von Medien mit und ohne Kalzium wurden die Beiträge der glatten Muskelzellen (SMC) Basalton und der passiven extrazellulären Matrix (ECM) für die Organe unter geschätzten physiologischen Bedingungen isoliert.
Dieses Protokoll untersucht die biaxialen mechanischen Eigenschaften der Fortpflanzungsorgane, die den Beitrag der glatten Muskelzellen und der passiven Matrix aufklären. Diese Technik hält die Organgeometrie und die native nsmooth Muskelzelle zu Matrix-Wechselwirkungen aufrecht, die eine Unterwerfung des Organs unter einen physiologischen Bereich von Drücken und axialen Erweiterungen ermöglichen. Die Untersuchung der biaxialen Funktion des Organs unter physiologisch relevanten Lasten kann zu einem besseren Verständnis der Ätiologie von reproduktiven Pathologien helfen.
Die biaxiale Prüfung des Gebärmutterhalses und der Vagina gibt Einblicke in die Bereiche der Gesundheit von Frauen und der Biomechanik. Ähnliche Methoden werden verwendet, um Blutgefäße zu studieren, die Speiseröhre und Dickdarm. Bei der Arbeit mit einem neuen Organ kann es einige Zeit dauern, bis die technischen Details abgeschlossen sind, wie man das Gewebe am besten anschließt oder wie man die unbelastete Länge bestimmt.
Um das Fortpflanzungssystem vom Versuchstier zu sammeln, legen Sie die Maus auf ein saugfähiges Pad unter einem Sezierendes Mikroskop und verwenden Sie abgewinkelte Pinzette und Schere, um die Haut um den Bauch zu heben. Machen Sie einen ersten Schnitt an der Basis des Bauches über dem Schambein flach genug, um nicht die Bauchmuskelwand zu punktieren und den Schnitt überlegen in Richtung des Rippenkäfigs und tief durch die Bauchmuskeln fortzusetzen. Nach dem Entfernen des oberflächlichen Fettes und sorgfältigschneiden der Schamsymphyse, verwenden Sie gerade Pinzette, um die Blase zu greifen, um Spannung zu erzeugen und verwenden Sie stumpfe Sezieren, um das umgebende Gewebe von der Vagina zu trennen.
Dann schneiden Sie die Basis des Fortpflanzungssystems, um das Gewebe aus der Körperhöhle zu entfernen. Nach der Bestimmung der geeigneten Kanüle für das geerntete System, montieren Sie die Zervixseite auf dem Kraftgeberteil der Kanulationsvorrichtung und montieren Sie das gegenüberliegende Ende des Organs auf dem Mikrometerteil des Geräts. Dann ziehen Sie beide Enden mit Nähten.
Um die unbelastete Länge des montierten Gewebes zu finden, dehnen Sie zuerst das Organ, so dass die Wand nicht in Spannung ist. Für die Vagina, beobachten Sie die Rillen an der Vaginalwand. Für den Gebärmutterhals, schneiden Sie direkt unter den Tintenpunkten über und unter der zentralen Gebärmutterhalsmarkierung.
Verwenden Sie Sättel, um die Länge des Systems von der Naht bis zur Naht zu messen und den Druck des Myographensystems in einem Millimeter Quecksilberschritten von null auf 10 Millimeter Quecksilber zu erhöhen. Der Druck, bei dem das Organ nicht mehr zusammenbricht, kann als größter Sprung im Außendurchmesser bei einem gegebenen Druck bestimmt werden. Nach der Aufzeichnung des Drucks und des Außendurchmessers, beachten Sie diese Daten als der erste Punkt, wobei das Organ nicht reduziert wird und Null die Kraft.
Um die experimentelle in vivo-Stretch zu finden, passen Sie das Organ auf die geschätzte in vivo Länge an, während Sie den unbelasteten Druck haben, und klicken Sie auf Start, um die Druck-gegen-Kraft-Werte für die Druckwerte vom unbelasteten Druck bis zum maximalen Druck zu bewerten. Klicken Sie dann auf Beenden und Speichern der Datei. Für die Vorkonditionierung des Druckdurchmessers stellen Sie den Druck auf null Millimeter Quecksilber, die Länge auf die experimentelle in vivo-Länge und den Gradienten auf 1,5 Millimeter Quecksilber pro Sekunde ein.
Führen Sie eine Sequenz aus, die den Druck von null Millimeter Quecksilber auf den maximalen Druck plus den entladenen Druck nimmt, 30 Sekunden halten und mit einer zusätzlichen Haltedauer von 30 Sekunden auf null Millimeter Quecksilber zurückführen. Nachdem Sie diese Sequenz für insgesamt fünf Zyklen wiederholt haben, klicken Sie auf Beenden und Speichern der Datei. Geben Sie für die Vorkonditionierung der Kraftlänge 1/3 des maximalen Drucks plus den unbelasteten Druck sowohl für den Ein- als auch den Auslassdruck ein und passen Sie das Organ auf minus 2% der in vivo-Länge an.
Klicken Sie auf Start und passen Sie die Länge auf plus 2% in vivo Länge und zurück auf minus 2% bei einer Rate von 10 Mikrometern pro Sekunde an. Wiederholen Sie die axiale Erweiterung für insgesamt fünf Zyklen, bevor Sie auf Stopp klicken und die Datei speichern. Für Die Prüfung des Druckdurchmessers der In-vivo-Länge klicken Sie auf Start und passen Sie das Organ auf die In-vivo-Länge an, stellen Sie den Druck auf null Millimeter Quecksilber ein und stellen Sie den Gradienten auf 1,5 Millimeter Quecksilber pro Sekunde ein.
Erhöhen Sie den Druck von null Millimeter Quecksilber auf den maximalen Druck, bevor Sie den Druck mit einer Haltedauer von 20 Sekunden wieder auf null Millimeter Quecksilber senken. Wiederholen Sie dann den Test für fünf Zyklen, bevor Sie das System anhalten und die Daten speichern. Stellen Sie für die Kraftlängenprüfung von 1/3 des Maximaldrucks plus des unbelasteten Drucks den Druck auf 1/3 des maximalen Drucks plus des entladenen Drucks ein und stellen Sie das Organ auf minus 2% der In-vivo-Länge ein.
Nach dem Klicken auf Start dehnen Sie das Organ auf plus 2% der In-vivo-Länge und zurück auf minus 2% der In-vivo-Länge mit einer Rate von 10 Mikrometern pro Sekunde. Wiederholen Sie dann den Test für insgesamt drei Zyklen, bevor Sie das System anhalten und die Daten speichern. Entfernen Sie nach dem letzten Test das KRB-Prüfmedium und waschen Sie das Organ mit kalziumfreiem KRB-Medium.
Nach dem Waschen das Organ mit frischer kalziumfreier KRB-Lösung inkubieren, die mit zwei Millimolaren EGTA für 30 Minuten ergänzt wird, bevor die Behandlungslösung durch frisches kalziumfreies KRB ersetzt wird. Nach Abschluss der Basaltonprüfung, für Druckdurchmesser Vorkonditionierung, klicken Sie auf Start und stellen Sie den Druck auf null Millimeter Quecksilber, die Länge als geschätzte in vivo Länge und den Gradienten auf 1,5 Millimeter Quecksilber pro Sekunde. Beginnen Sie mit dem Ausführen einer Sequenz, die den Druck von null Millimeter Quecksilber auf den maximalen Druck und zurück auf null Millimeter Quecksilber nimmt.
Wiederholen Sie diesen Vorgang durch fünf Zyklen mit einer Haltedauer von 30 Sekunden. Passen Sie das Organ für die Vorkonditionierung der Kraftlänge auf die In-vivo-Länge an und geben Sie den entladenen Druck für beide Drücke manuell ein. Klicken Sie auf Start und stellen Sie den Gradienten auf 1,5 Millimeter Quecksilber und den Druck auf 1/3 des Maximums ein.
Dehnen Sie das Organ bis zu plus 2% und zurück auf minus 2%stretch bei 10 Mikrometer pro Sekunde und wiederholen Sie den Zyklus für insgesamt fünf Mal. Bei Druckdurchmessertests, bei denen das Organ bei minus 2% der experimentell ermittelten in vivo-Länge und dem Druck bei null Millimeter Quecksilber liegt, klicken Sie auf Start und erhöhen den Druck von null Millimeter Quecksilber auf den maximalen Druck und zurück auf null Millimeter Quecksilber. Halten Sie den NullMillimeter Quecksilberschritt 20 Sekunden lang gedrückt und wiederholen Sie den Zyklus fünfmal.
Stellen Sie für die Kraftlängenprüfung den Druck auf einen Nenndruck ein und stellen Sie das Organ auf minus 2 % der In-vivo-Länge ein. Dehnen Sie das Organ bis zu plus 2% der In-vivo-Länge und zurück auf minus 2% der In-vivo-Länge mit einer Rate von 10 Mikrometern pro Sekunde. Speichern Sie nach insgesamt drei Zyklen die Daten und wiederholen Sie die Kraftlängenprüfung für 1/3 des maximalen Drucks, 2/3 des maximalen Drucks und beim maximalen Druck.
Für eine erfolgreiche Analyse der mechanischen Eigenschaften der weiblichen Fortpflanzungsorgane ist es unerlässlich, die Gebärmutterhörner ohne Defekte in die Vagina zu pflanzen. Je nach Organtyp variiert die Kanülengröße. Die Kanulation muss so durchgeführt werden, dass sich das Organ während des Experiments nicht bewegen kann, aber ohne die Wand des Organs während des Eingriffs zu beschädigen.
Das Druck-Myographensystem kann verwendet werden, um verschiedene Aspekte des Organs zu überwachen, da es mechanischen Tests unterzogen wird und das Ultraschallsystem verwendet werden kann, um die Dicke der Organe im unbelasteten Zustand mit und ohne Basalton zu messen. Nach mechanischer Prüfung kann der Tangentenmodul i für die Umkreisungs- und Axialrichtung berechnet werden. Sowohl Basaltontests als auch passive Tests ergeben wichtige mechanische Eigenschaften des Fortpflanzungstraktes mit und ohne den kontraktilen Beitrag glatter Muskelzellen.
Die Skalierung zwischen den Organen erfordert einige Anpassungen der Protokolle, da der Gebärmutterhals und die Vagina unterschiedliche Belastungen in vivo erfahren. Es ist der Schlüssel, um die Sezierung schnell durchzuführen, um die Lebensfähigkeit der glatten Muskelzellen zu erhalten, aber sorgfältig, um das gewünschte Organ nicht zu punktieren. Öffnungswinkelexperimente, die die Restbelastung des Organs messen, können nach mechanischen Prüfverfahren sowie verschiedenen histologischen und biochemischen Assays durchgeführt werden.
Nach der Entwicklung und Untersuchung des glatten Muskelzell-Basalbeitrags ermöglicht diese Technik auch die Bewertung der glatten Muskel-Maximal-Kontraktil-Reaktion des Fortpflanzungssystems unter physiologisch relevanten Belastungen.
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Übersicht
Dieses Protokoll untersucht die biaxialen mechanischen Eigenschaften der Fortpflanzungsorgane unter besonderer Berücksichtigung der Beiträge glatter Muskelzellen und der passiven extrazellulären Matrix. Die Methode erhält die Organgeometrie und die nativen Wechselwirkungen, sodass Tests unter physiologisch relevanten Bedingungen möglich sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biomechanik
- Gesundheit der Frau
- Reproduktionsphysiologie
Hintergrund
- Das Verständnis der mechanischen Eigenschaften der Fortpflanzungsorgane ist entscheidend für die Gesundheit von Frauen.
- Die Untersuchung des Beitrags glatter Muskelzellen kann Aufschluss über Fortpflanzungsstörungen geben.
- Biaxiale Prüfmethoden werden häufig in verschiedenen biologischen Studien angewandt.
- Technische Details sind für genaue Messungen bei der Erforschung neuer Organe unerlässlich.
Zweck der Studie
- Aufklärung der mechanischen Eigenschaften des Gebärmutterhalses und der Vagina.
- Isolierung der Effekte glatter Muskelzellen und der extrazellulären Matrix.
- Verbesserung des Verständnisses der Funktion reproduktiver Organe unter physiologischen Bedingungen.
Verwendete Methoden
- Druckmyographietests an murinem Vagina und Zervix.
- Verwendung von Medien mit und ohne Calcium zur Beurteilung der Beiträge.
- Beibehaltung der Organgeometrie während der Untersuchung.
- Anwendung physiologischer Drucke und axialer Dehnungen.
Hauptergebnisse
- Einblicke in das mechanische Verhalten von Fortpflanzungsorganen.
- Identifizierung der Rollen von glatten Muskelzellen und extrazellulärer Matrix.
- Mögliche Implikationen für das Verständnis reproduktiver Pathologien.
- Vergleich mit ähnlichen Methoden in Studien anderer Organe.
Schlussfolgerungen
- Biaxiale Tests liefern wertvolle Erkenntnisse für die Frauengesundheit.
- Das Verständnis der Organmechanik kann klinische Ansätze bei reproduktiven Problemen unterstützen.
- Weitere Verbesserungen der Techniken sind für neue Organstudien erforderlich.
Häufig gestellte Fragen
Praktische Bedeutung für die Industrie
Die Bewertung der biaxialen mechanischen Eigenschaften von Fortpflanzungsorganen ermöglicht eine mechanistische Entlastung bei der Zielvalidierung im Bereich der Frauengesundheit, indem die Beiträge von glattem Muskelgewebe und extrazellulärer Matrix isoliert werden. Dieser Ansatz stärkt das Vorhersagevertrauen in präklinischen Modellen, indem er den Grundton und die passiven mechanischen Eigenschaften unter physiologisch relevanten Belastungen quantifiziert. Die Methodik unterstützt die translationale Abstimmung von Biomarkern bei Beckenbodenerkrankungen und zervikaler Insuffizienz durch reproduzierbare, quantitative biomechanische Phänotypisierung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem die basale Tonusentwicklung gemessen wird, also die partielle Konstriktion glatter Muskelzellen ohne hormonale und neuronale Stimulierung.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen, indem die kontraktile Zellaktivität von der passiven Matrixmechanik entkoppelt wird, mithilfe kalziumfreier und mit EGTA angereicherter Medien.
- Predictiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem ECM-getriebene Veränderungen im Phänotyp glatter Muskelzellen identifiziert werden, die mit dem Verlust kontraktiler Kraft bei reproduktiven Erkrankungen korrelieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Workflows vor, indem die unbelastete Länge und die In-vivo-Dehnungsparameter mittels Montage am Druck-Myographen bestimmt werden.
- Quantitative Ausgaben: Erzeugt Druck-Durchmesser- und Kraft-Längen-Messungen, die eine Standardisierung und Reproduzierbarkeit in mechanischen Phänotypisierungsassays ermöglichen.
- Plattformnutzung: Ermöglicht die skalierbare Bewertung von Substanzeffekten auf das Gewebemechanikverhalten durch Vorbelastungszyklen und schrittweise Druck- bzw. Längenanpassungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Klinische Relevanz: Modelliert pathophysiologische Veränderungen der extrazellulären Matrix, die mit einem Beckenorganprolaps und einer vorzeitigen Zervixumgestaltung assoziiert sind, durch Analyse der Zusammensetzung von Kollagen und Elastin.
- Translationale Kontinuität: Verbindet experimentelle Erkenntnisse mit präklinischer Validierung, indem mikrostrukturelle Steifigkeitsveränderungen mit Phänotypwechseln der glatten Muskulatur und kontraktiler Dysfunktion verknüpft werden.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Entwicklungsprojekten, indem quantifiziert wird, wie Veränderungen der ECM-Steifigkeit die Aktivität der glatten Muskulatur und die mechanische Integrität auf Organebene beeinflussen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in die Entdeckungsbiologie durch die Hypothesenprüfung von Wechselwirkungen zwischen glattem Muskelgewebe und der Matrix, in die Untersuchung mittels standardisierter mechanischer Phänotypisierung und in die translationsmedizinische Forschung, indem sie eine biomarkerbasierte präklinische Kontinuität für gesundheitsrelevante Indikationen bei Frauen ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Aufklärung von Signalwegen, indem untersucht wird, wie sich die biochemische Umgebung und mechanische Dehnung unter basisphysiologischen Bedingungen auf die kontraktilen Eigenschaften von glatten Muskelzellen auswirken.
- Screening: Gewährleistet die Bereitschaft für Assays durch eine Vorbehandlung des Gewebes mit einem Druck-Durchmesser-Gradienten von 1,5 mmHg/s sowie durch Kraft-Längen-Zyklen mit einer Geschwindigkeit von 10 µm/s, um die Gewebeantwort zu stabilisieren.
- Analytik: Ermöglicht die Berechnung der Tangentenmodule in zirkumferentieller und axialer Richtung und damit den quantitativen Vergleich passiver mechanischer Eigenschaften und aktiver kontraktiler Anteile unter verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Schließt an die präklinische Validierung an, indem untersucht wird, wie Veränderungen der ECM-Mikrostruktur den Phänotyp und die Kraftentwicklung glatter Muskelzellen in krankheitsrelevanten Modellen beeinflussen.
- Unternehmenübergreifende Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur biomechanischen Phänotypisierung, die auf vaskuläre, gastrointestinale und reproduktive Organsysteme unter physiologischer biaxialer Belastung anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten, indem die basale Tonusaktivität der glatten Muskulatur mithilfe kalziummodulierter Medien von passiven Beiträgen der extrazellulären Matrix (ECM) isoliert wird.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung durch die Bestimmung der entlasteten Länge anhand von Rillen in der Vaginalwand oder mittels Tintenpunkten am Gebärmutterhals sowie durch die Detektion des Druck-Null-Kollapspunkts.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem eine frühzeitige Risikominimierung für Zielstrukturen ermöglicht wird, die bei biomechanisch bedingten reproduktiven Erkrankungen eine Rolle spielen.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem quantifiziert wird, wie Veränderungen in der Zusammensetzung der ECM (Kollagen I/III/V, Elastin, GAGs) die Organsteifigkeit und die zelluläre Mechanotransduktion beeinflussen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Gewebedissektion, Kanülierung und Nahttechniken, um die Organarchitektur und -lebensfähigkeit zu erhalten.
- Setzt ein Druck-Myographie-Gerät voraus, das eine biaxiale Steuerung des Drucks (0–10 mmHg) und der axialen Länge (±2 % in vivo) ermöglicht.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg hinsichtlich der Protokolle zur Bestimmung der unbelasteten Länge sowie der Vorbelastungszyklen (5× Druck-Durchmesser, 5× Kraft-Länge), um reproduzierbare Ausgangswerte zu erzielen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen für organspezifische Skalierung aufgrund unterschiedlicher in-vivo-Belastungen zwischen Zervix und Vagina.
- Eingeschränkt durch die begrenzte Gewebeviabilität, die eine schnelle Dissektion erfordert, um die Funktion der glatten Muskelzellen zu bewahren und gleichzeitig eine Wandbeschädigung während der Kanülierung zu vermeiden.
