Generierung von ventrikulären HiPSC-abgeleiteten Cardiomyozyten und hochwertigen Zellpräparaten für die Calciumhandling-Charakterisierung

Reproduzierbarkeit ist bei der Induktion von Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten ein wichtiges Anliegen. Mit diesen Methoden können hochreine und hochwertige Kardiomyozyten aus iPS für ihren Einsatz in Funktionellen Studien erzeugt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es sich um eine einfache, zuverlässige, kostengünstige und äußerst leistungsfähige Methode zur Erlangung gereinigter, hochwertiger Präparate von iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten handelt.

Für die Zellpassierung die Zellen sieben bis zehn Minuten lang mit einem Milliliter PBS ohne Kalzium und Magnesium abspülen, bevor Sie das PBS durch ein Milliliter Passaging-Medium ersetzen. Mit einem Zellheber, kratzen Sie die Zellen vorsichtig von der Unterseite der Brunnen, und verwenden Sie sterile Zwei-Milliliter-Glaspipette, um die abgetrennten Zellen mechanisch zu dissoziieren. Wenn die Zellen in kleine Cluster gehoben haben, wie unter dem Mikroskop sichtbar, fügen Sie Passaging-Medium hinzu, um die Zellen im Verhältnis eins zu sechs zu spalten.

Als nächstes, aspirieren Sie die menschliche embryonale Stammzelle qualifizierte Matrix aus der sechs Brunnenplatte. Fügen Sie dann jeweils einen Milliliter Passaging-Medium und einen Milliliter dissoziierten Zellen zu jedem Brunnen hinzu und lassen Sie die Zellen wachsen, bis sie 70 bis 80 % Konfluenz erreichen, bevor sie eine Herzdifferenzierung beginnen. Mindestens 30 Minuten vor der Trennung der iPSC-CMs, wischen Sie einzelne Glasabdeckungsrutschen mit 70% Ethanol ab und legen Sie die Abdeckung in einzelne Brunnen einer sterilen sechs Brunnenplatte.

Wenn die Abdeckungsrutschen getrocknet sind, fügen Sie eine 250 bis 300 Mikroliter menschliche embryonale Stammzell-qualifizierte Matrixlösung direkt in die Mitte jedes Abdeckungsschlupfes, und legen Sie die sechs Brunnenplatte in die Gewebekulturhaube. Um die metabolisch ausgewählte iPSC-CM zu dissoziieren, fügen Sie einen Milliliter sterilen 0,25%Trypsin mit EDTA zu jedem Brunnen für eine fünfminütige Inkubation bei 35 Grad Celsius hinzu und verwenden Sie eine 1000-Mikroliter-Pipette, um die Zellen mechanisch zu dissoziieren, bis eine Einzelzellsuspension erreicht wurde. Ziehen Sie die Zellen in sterilen 15 Milliliter konischen Rohr, und waschen Sie jeden Brunnen mit zwei Milliliter RPMI 20 Medium pro Brunnen.

Dann fügen Sie die Wässen in das Rohr und Pellet die Zellen durch Zentrifugation. Setzen Sie die Zellen in einem ausreichenden Volumen von Medium, um eine dreimal 10 bis die fünfte Zelle pro 250 Mikroliter der Zellen Konzentration zu erreichen. Verwenden Sie eine 1000 Milliliter Pipettenspitze, um die Zellen zu dissoziieren, bis die Lösung homogen zu sein scheint.

Dann aspirieren Sie 250 Mikroliter Zellen in eine 1000 Mikroliter Pipette Spitze, und geben Sie langsam das gesamte Volumen der Lösung auf eine menschliche embryonale Stammzell qualifizierte Matrix codierten Abdeckung Schlupf. Wenn alle Zellen gesät sind, legen Sie die Platte vorsichtig über Nacht in den Zellkultur-Inkubator. Sanft zwei Milliliter D7 Medium zu jedem Brunnen am nächsten Morgen hinzufügen.

Wenn die ausgewählten iPSC-CMs mindestens drei Monate alt sind, behandeln Sie die Zellen mit zwei Mikroliterfurzen Fura-2 AM für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius und schalten das Kalziumanalysesystem ein. Initiieren Sie den ArcLamp und verbinden Sie die Rohre von der Pumpe an die entsprechenden Ein- und Ausgänge und den elektronischen Draht vom Stimulator an die Kammer. Legen Sie die Kammer auf das System.

Füllen Sie das ProFusion-Rohr, das durch die fluidische einzeilige Heizung mit 37 Grad Celsius erwärmten Tyrodes Lösung läuft, und passen Sie die Kamera- und Framing-Öffnungsabmessungen an, um den Hintergrundbereich zu minimieren. Befestigen Sie den mit iPSC-CMs gesäten Glasdeckel in die Kammer und fügen Sie vorsichtig 500 Mikroliter der Tyrodes Lösung direkt auf den Deckelschlupf. Beginnen Sie mit einer Rate von 1,5 Milliliter pro Minute mit der Verschmelzung der Kammer mit DerrodesLösung und verwenden Sie einen elektrischen Stimulator, um die iPC-CMs mit 1 Hertz Feldstimulation bei 10 Volt alle vier Millisekunden für drei bis fünf Minuten zu beschleunigen.

Wenn der gesamte Farbstoff aus der Kammer gewaschen wurde, stellen Sie das Sichtfenster auf den oberen linken Bereich des Decksschlupfs ein und beginnen Sie mit der Aufnahme. Nachdem Sie einen konsistenten Strom von fünf bis zehn Peaks gesammelt haben, klicken Sie auf Pause, um die Aufnahme vorübergehend zu stoppen und die Mikroskopstufe in einen angrenzenden Bereich für das entgegengesetzte Ende des Abdeckungsschlupfes zu verschieben, bevor Sie die Aufnahme wieder aufnehmen. Nach dem Scannen der Kalziumtransilenz über den gesamten Deckschein in gleicher Weise über einen Zeitraum von 10 Minuten analysieren Sie die Daten mit einer geeigneten Floreszenz-Spurenanalyse-Software nach den Anweisungen des Herstellers.

Dieses Protokoll erzeugt hochreine Kardiomyozyten, die im Laufe der Zeit einen ventrikulären, erwachsenen phänotypartigen Phänotyp in der Kultur erwerben. Wie durch immunfluoreszierende Färbung für die atrialen und ventrikulären MLC2-Isoformen beurteilt, ist die Mehrheit der durch dieses Protokoll erzeugten Zellen am Tag 30 nach der Induktion der Herzdifferenzierung vor Gericht MLC2-Isoform-positiv. Während ventrikuläre MLC2-Isoformen in viel Zahlen gleichzeitig exprimiert werden.

Mit zunehmender Kulturzeit wird ein vollständiger Wechsel zu den MLC2-Isoformen beobachtet. Diese Daten wurden auch durch zytometrische Durchflussquantifizierung des Prozentsatzes der atrialen und ventrikulären MLC2-Marker-exzessiven Zellen bestätigt. Die Calciumamplitude ist bei den iPSC-CMs an Tag 90 signifikant erhöht, ähnlich wie bei erwachsenen Ratten-CMs.

Es ist wichtig zu beachten, dass kontaminierende nicht-kardiale Zellen die funktionelle Reifung der menschlichen iPSC-CMs während der Differenzierung beeinflussen können. Darüber hinaus ist es bei der Aufnahme von Kalziumtransienten in iPSC-CMs notwendig, die Zellen bei 37 Grad Celsius unter konstanter Stimulation für mindestens 200 Sekunden stabilisieren zu lassen und die Aufnahmen auf ein bestimmtes Zeitfenster zu beschränken, um reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten. Denken Sie daran, zu bestätigen, dass die iPSCs eine homogene Morphologie aufweisen und die Zellen bis zu 70 bis 80 % Konfluenz wachsen lassen, bevor sie eine herzhafte Differenzierung einleitete.

Reine Qualität in unreifen iPS-abgeleiteten Kardiomyozyten kann veränderte funktionelle Eigenschaften aufweisen, die nicht den echten Phänotyp widerspiegeln, sondern als der erkrankte Phänotyp missverstanden werden könnten. Daher ist es wichtig, reine und qualitativ hochwertige Kardiomyozyten zu erhalten, um konsistente und reproduzierbare Ergebnisse zu liefern.