Name: Gekapselte Zelltechnologie für die Lieferung von Biologika an das Mausauge (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Erfahren Sie die Mikroverkapselung mit Alginat zur gezielten Abgabe von Biologika an das Mausauge. Diese Methode ermöglicht die langfristige Freisetzung therapeutischer Zellen bei minimaler Immunreaktion.

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Die Studie wurde teilweise durch Stipendien unterstützt, die B. R. von den National Institutes of Health (R01EY019320), dem Department of Veterans Affairs (RX000444 und BX003050) und dem South Carolina SmartState Endowment gewährt wurden.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der ARVO-Erklärung für den Einsatz von Tieren in der Augenheil- und Sehforschung durchgeführt und vom Medical University of South Carolina Animal Care and Use Committee unter der Protokoll-ID 00399 genehmigt.
1. Zellkultur
<ol><li>Generieren Sie menschliche retinale Pigmentepithelzellen (ARPE-19) Zelllinie stabil das Gen der Wahl nach veröffentlichtenProtokollen 14,15.</li>
	<li>Pflegen Sie Zellen in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt durch 10% fetales Rinderserum (FBS).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5%CO2.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Medium alle 2 bis 3 Tage.</li>
	<li>Durchfluss der Zellen nach Erreichen 70%–80% Zusammenfluss mit Standard-Gewebekultur Verfahren.</li>
</ol>2. Zellverkapselung
<ol><li>Natriumalginat mit deionisiertem (DI) Wasser für eine Endkonzentration von 2% w/v mischen und durch Filtration mit einem 0,2 m sterilen Spritzenfilter reinigen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Zellen, die mit der Alginatlösung gemischt werden sollen, durch Trypsinisieren, Zentrifugieren und Waschen mit 10 mM HEPES gepufferter Salinelösung (pH = 7,4) vor. Mit einem Hämozytometer die Zellen zählen und die endgültige Zellkonzentration in Alginatlösung auf 1 x 106 einstellen. HINWEIS: Der Verkapselungsprozess sollte in einer sterilisierten Haube ausgeführt werden.</li>
	<li>In eine 3 ml Spritze mit Alginat und Zellen gemisch mit 3 ml 300 L L eintragen und an einer Spritzenpumpe befestigen. Die Lösung wird durch eine 30 G stumpfe Spitzennadel in ein steriles Gelierbad gepumpt, das in einem sterilen 50 ml Becher unter der Spritzenspitze bei 7 mm für eine Nadel zum Bad Sprühabstand gelegt wird.</li>
	<li>Das Gelierbad enthält ein Volumen von 40 ml 10 mM HEPES gepufferter Saline mit 100 mM Calciumchlorid (CaCl2) und 0,5% w/v Poly-L-Ornithin (PLO). Die PLO ist eine sekundäre Polymerbeschichtung, die je nach Denkanschutz ausgelassen oder verändert werden kann.</li>
	<li>Stellen Sie die Spannung und die Durchflussrate ein und halten Sie beide konstant während des Verkapselungsprozesses bei 60 mm/h Durchflussrate und 6,0 kV Anfangsspannung, um Mikrokapseln mit einer Größe von 150 m zu erzeugen.</li>
	<li>Schließen Sie den Clip des Anodendrahtes (rot) einer Hochspannungsgenerator-Nadelspitze an die Nadel an die Nadel an und schließen Sie den Erdungsclip (schwarz) an den Kupferdraht an, der auf halbem Weg in das Gelierbad getaucht ist. Eine Charge des Alginat+ Zellgemischs (1 ml) benötigt ca. 30 min, um die gekapselten Zellen (ca. 25.000 Mikrokapseln) vorzubereiten.</li>
	<li>Waschen Sie die gebildeten Mikrokapseln, die Zellen enthalten, zweimal mit Waschlösung (10 mM HEPES gepufferte Saline mit 1,5 mM CaCl2, pH = 7,4). Verwenden Sie PBS nicht zum Waschen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die gekapselten Zellen mit 10% FBS-ergänzten DMEM-Medien in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5%CO2. HINWEIS: Verkapselungsprozessinstrumente sind in Abbildung 1dargestellt.</li>
</ol>3. Bestätigung, dass die Kapselung die Zelllebensfähigkeit nicht beeinträchtigt
<ol><li>Nach der Inkubation der gekapselten Zellen für 24 h in den Medien, bereiten Sie eine kleine Probe von 500 l (30 Mikrokapseln) für die Färbung.</li>
	<li>Waschen Sie die Mikrokapseln 2x mit Waschlösung (10 mM HEPES gepufferte Saline mit 1,5 mM CaCl2) und färben Sie sie für die Lebensfähigkeit mit einem Lebend/Toten-Assay-Kit.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Färbemischung aus Calcein AM (Acetoxymethyl) und Ethidium homodimer-1 bei Endkonzentrationen von 2 m bzw. 4 m vor.</li>
	<li>2 ml der Färbemischung in die gekapselten Zellen geben und 30–45 min im Dunkeln bei Raumtemperatur (RT) brüten.</li>
	<li>Mit sorgfältiger Aspiration die Färbelösung ansaugen und die Mikrokapseln 2x mit der Waschlösung waschen. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskopsystem, um die gekapselten Zellen zu beobachten und abzubilden. HINWEIS: Die Dokumentation der Verkapselung ist in Abbildung 2dargestellt.</li>
</ol>4. Bestätigung, dass Kapseln die geeignete Größe für die Lieferung und Lieferung der biologischen
<ol><li>Intravitreale Injektionen in einem Mausauge werden in der Regel mit einer 27 G stumpfen Spitzennadel (Innendurchmesser von 210 m) durchgeführt, die an einer 2,5-L-Hamilton-Spritze befestigt ist.</li>
	<li>Generieren Sie Kapseln im Bereich von 100 bis 200 m, verdünnen Sie sie in serumfreien Medien und ziehen Sie sie vorsichtig in die Hamilton-Spritze. PBS ist kein geeignetes Fahrzeug, da sich Alginatkapseln in PBS auflösen.</li>
	<li>Ausstoßen Sie langsam 1 L Tropfen mit Kapseln auf ein Mikroskopschlitten und bestimmen ihre Integrität mit einem aufrechten Hellfeldmikroskop.</li>
	<li>Passen Sie die Kapselgröße (siehe Schritt 2.3) an, indem Sie Spannung und Durchfluss entsprechend anpassen. Kleinere Mikrokapseln werden nichtlinear hergestellt, indem die Spannung erhöht und die Durchflussrate leicht abnimmt8. In unseren Händen erwiesen sich Kapseln mit einem Durchmesser von 150 m als am besten geeignet. Die Anpassung der Kapselgröße hängt auch davon ab, die Alginatkonzentration konstant zu halten und gleichzeitig die anderen Parameter zu ändern.</li>
	<li>Bewahren Sie einen separaten Satz von Zellen in Kapseln der entsprechenden Größe in serumfreiem Medium auf, um die Sekretionsmenge des gewünschten Biologikums zu bestimmen. Verwenden Sie empfindliche ELISAs oder Western Blotting, um die Konzentration der Biologika im Überstand zu bestimmen.</li>
	<li>Bestimmen Sie die erforderliche Menge an Kapseln, die auf der Grundlage der bekannten PK/PD (Pharmakokinetik/Pharmakodynamik) des Therapeuten injiziert werden müssen. In unseren Händen erwiesen sich 10 Kapseln pro Mausauge als am wirksamsten.</li>
</ol>5. Kapsellieferung in Mouse Vitreous
<ol><li>Führen Sie intravitreale Injektionen mit einem Sezierendes Mikroskop durch. Siehe Abbildung 3 für chirurgische Einrichtung und Materialien, die während des Eingriffs verwendet werden. Ein detailliertes Protokoll für intravitreöse Injektionen kann an anderer Stelle gefunden werden16.</li>
	<li>Anästhesisieren Sie Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Xylazin und Ketamin (20 mg/kg und 80 mg/kg) oder anderen bevorzugten Anästhetika, die vom Tierpflege- und Verwendungsausschuss der jeweiligen Institution zugelassen wurden. Stellen Sie die entsprechende Tiefe der Anästhesie mit einer Zehenzange17sicher.</li>
	<li>Delatetiere die Maus-Pupillen mit Phenylephrin-HCL (2,5%) und Atropinsulfat (1%) um eine gute Sichtbarkeit der Glaskammer zu ermöglichen und ein Schmierauge Augengel auf die Augen aufzutragen, um sie während des Eingriffs hydratisiert zu halten.</li>
	<li>Punktieren Sie die Sklera am Limbus mit einer 26 G Nadel als Führungsloch, stellen Sie sicher, dass sich die Nadel in einem 45°-Winkel mit Dem Auge und Tisch befindet und 2) die abgeschrägte Spitze nach oben zeigt, um eine Punktion der Linse zu vermeiden.</li>
	<li>Injizieren Sie die Kapseln vorsichtig mit einer 27 G stumpfen Spitzennadel, die bei sichtweiser Inspektion an einer Hamilton-Spritze in einem 45°-Winkel befestigt ist, und vermeiden Sie es, die Linse mit der Nadel zu berühren. Eine Verletzung der Linse führt zur Kataraktbildung. Die Kapseln sollten im Glaskörper mit dem Sezieren des Mikroskops sichtbar sein (Abbildung 4A).</li>
	<li>Nach dem Zurückziehen der Nadel, behandeln Sie die Injektionsstelle mit antibiotischen Salben Neomycin und Polymyxin B Sulfate zusätzlich zu Dexamethason ophthalmologische Antibiotika Salbe.</li>
	<li>Anwendung goniotaire hypromellose demulcent ophthalmologische Lösung (2.5%) beiden Augen, um zu verhindern, dass die Hornhäuten während der Erholungsphase austrocknen.</li>
	<li>Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen bei 37°C gehalten und überwachen, bis vollständig wach.</li>
	<li>Eine erfolgreiche Injektion von gekapselten ARPE-19-Zellen sollte das Vorhandensein intakter Kapseln in der Glaskörperkammer der Maus mit nur geringen Mengen an Schmutz bei der Abbildung des Auges durch optische Kohärenztomographie oder andere Methoden offenbaren (Abbildung 4B).</li>
	<li>Das injizierte Mausauge ist nach einigen Tagen der Genesung aufgrund der Operation nun bereit für das experimentelle Paradigma. HINWEIS: Die chirurgische Einrichtung und Dokumentation von Kapseln im Auge sind in Abbildung 3 bzw. Abbildung 4dargestellt.</li>
</ol>

<ol><li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+systems%3A+entering+the+mainstream%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Drug delivery systems: entering the mainstream.</a> Science. 303 (5665), 1818-1822 (2004).</li>
<li>Tonnesen, H. H., Karlsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+in+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Development+and+Industrial+Pharmacy%22%5BJournal%5D)">Alginate in drug delivery systems.</a> Drug Development and Industrial Pharmacy. 28 (6), 621-630 (2002).</li>
<li>Vilos, C., Velasquez, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+strategies+based+on+polymeric+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Therapeutic strategies based on polymeric microparticles.</a> Journal of Biomedical Biotechnology. 672760, (2012).</li>
<li>Gasperini, L., Mano, J. F., Reis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+polymers+for+the+microencapsulation+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Natural polymers for the microencapsulation of cells.</a> Journal of the Royal Society Interface. 11 (100), 20140817(2014).</li>
<li>Gasper, D. P. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGasper%2C+DPR+%22Novel+strategy+to+produce+a+drug+delivery+system+for+skin+regeneration.+Uma+nova+estrat%C3%A9gia+para+produzir+um+dispositivo+para+entrega+de+f%C3%A1rmacos+que+ser%C3%A1+usado+na+regenera%C3%A7%C3%A3o+da+pele%22">Novel strategy to produce a drug delivery system for skin regeneration. Uma nova estratégia para produzir um dispositivo para entrega de fármacos que será usado na regeneração da pele</a>. , (2012).</li>
<li>Huang, S., Fu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+derived+materials-based+cell+and+drug+delivery+systems+in+skin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Naturally derived materials-based cell and drug delivery systems in skin regeneration.</a> Journal of Controlled Release. 142 (2), 149-159 (2010).</li>
<li>Nograles, N., Abdullah, S., Shamsudin, M. N., Billa, N., Rosli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+characterization+of+pDNA-loaded+alginate+microspheres+for+oral+administration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Formation and characterization of pDNA-loaded alginate microspheres for oral administration in mice.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (2), 133-140 (2012).</li>
<li>Moore, K., Amos, J., Davis, J., Gourdie, R., Potts, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+polymeric+microcapsules+containing+a+low+molecular+weight+peptide+for+controlled+release%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Characterization of polymeric microcapsules containing a low molecular weight peptide for controlled release.</a> Microscopy and Microanalysis. 19 (1), 213-226 (2013).</li>
<li>Xu, Y., Skotak, M., Hanna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospray+encapsulation+of+water-soluble+protein+with+polylactide.+I.+Effects+of+formulations+and+process+on+morphology+and+particle+size%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microencapsulation%22%5BJournal%5D)">Electrospray encapsulation of water-soluble protein with polylactide. I. Effects of formulations and process on morphology and particle size.</a> Journal of Microencapsulation. 23 (1), 69-78 (2006).</li>
<li>Gryshkov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+engineering+of+high+voltage+alginate+encapsulation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering%3A+C%22%5BJournal%5D)">Process engineering of high voltage alginate encapsulation of mesenchymal stem cells.</a> Materials Science and Engineering: C. 36, 77-83 (2014).</li>
<li>Thanos, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+secretion+of+ciliary+neurotrophic+factor+to+the+vitreous%2C+using+the+encapsulated+cell+therapy-based+NT-501+intraocular+device%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Sustained secretion of ciliary neurotrophic factor to the vitreous, using the encapsulated cell therapy-based NT-501 intraocular device.</a> Tissue Engineering. (11-12), 1617-1622 (2004).</li>
<li>Kauper, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-year+intraocular+delivery+of+ciliary+neurotrophic+factor+by+encapsulated+cell+technology+implants+in+patients+with+chronic+retinal+degenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Two-year intraocular delivery of ciliary neurotrophic factor by encapsulated cell technology implants in patients with chronic retinal degenerative diseases.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (12), 7484-7491 (2012).</li>
<li>Kauper, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term%2C+sustained+intraocular+delivery+of+a+VEGF+antagonist+using+encapsulated+cell+technology+implant+for+the+treatment+of+choroidal+neovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Long term, sustained intraocular delivery of a VEGF antagonist using encapsulated cell technology implant for the treatment of choroidal neovascular diseases.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 455(2012).</li>
<li>Annamalai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+Cell+Technology-Based+Delivery+of+a+Complement+Inhibitor+Reduces+Choroidal+Neovascularization+in+a+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Visual+Science+Technology%22%5BJournal%5D)">Encapsulated Cell Technology-Based Delivery of a Complement Inhibitor Reduces Choroidal Neovascularization in a Mouse Model.</a> Translational Visual Science Technology. 7 (2), 3(2018).</li>
<li>Alge, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+Pigment+Epithelium+Is+Protected+Against+Apoptosis+by+%CE%B1B-Crystallin%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Retinal Pigment Epithelium Is Protected Against Apoptosis by αB-Crystallin.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (11), 3575-3582 (2002).</li>
<li>Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreous+injection+for+establishing+ocular+diseases+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intravitreous injection for establishing ocular diseases model.</a> Journal of Visualized Experiments. (8), 313(2007).</li>
<li>Jove Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab+Animal+Research.+Anesthesia+Induction+and+Maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Holz, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+Safety+of+Lampalizumab+for+Geographic+Atrophy+Due+to+Age-Related+Macular+Degeneration%3A+Chroma+and+Spectri+Phase+3+Randomized+Clinical+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Efficacy and Safety of Lampalizumab for Geographic Atrophy Due to Age-Related Macular Degeneration: Chroma and Spectri Phase 3 Randomized Clinical Trials.</a> JAMA Ophthalmology. 136 (6), 666-677 (2018).</li>
<li>Kassa, E., Ciulla, T. A., Hussain, R. M., Dugel, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+inhibition+as+a+therapeutic+strategy+in+retinal+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+in+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Complement inhibition as a therapeutic strategy in retinal disorders.</a> Expert Opinion in Biological Therapy. 19 (4), 335-342 (2019).</li>
<li>Cashman, S. M., Ramo, K., Kumar-Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Non+Membrane-Targeted+Human+Soluble+CD59+Attenuates+Choroidal+Neovascularization+in+a+Model+of+Age+Related+Macular+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Non Membrane-Targeted Human Soluble CD59 Attenuates Choroidal Neovascularization in a Model of Age Related Macular Degeneration.</a> PLoS ONE. 6 (4), e19078(2011).</li>
<li>Vincent, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+combination+PDGF+%2F+VEGF-antagonist+ECT+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Generation of combination PDGF / VEGF-antagonist ECT devices.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54, 3290(2013).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+neurotrophic+factor+delivered+by+encapsulated+cell+intraocular+implants+for+treatment+of+geographic+atrophy+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for treatment of geographic atrophy in age-related macular degeneration.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (15), 6241-6245 (2011).</li>
<li>Chew, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+neurotrophic+factor+for+macular+telangiectasia+type+2%3A+results+from+a+phase+1+safety+trial%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ciliary neurotrophic factor for macular telangiectasia type 2: results from a phase 1 safety trial.</a> American Journal of Ophthalmology. 159 (4), 659-666 (2015).</li>
<li>Birch, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+trial+of+ciliary+neurotrophic+factor+delivered+by+encapsulated+cell+intraocular+implants+for+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Randomized trial of ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for retinitis pigmentosa.</a> American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 283-292 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Diese Zellverkapselungstechnik ist relativ schnell und einfach durchzuführen. bestimmte Punkte müssen jedoch im Auge behalten werden, um genaue nachgelagerte Ergebnisse zu erhalten. Zellen sollten in kulturin einer Petrischale vor der Verkapselung gehalten und bei richtiger Konfluenz gehalten werden. Die Verkapselung sollte, wenn möglich, in einer richtigen Lüftungshaube mit geregeltem Luftstrom erfolgen. Zu stark von einem Luftstrom kann die Kapselbildung beeinflussen, vor allem in Langzeitexperimenten. Sterile Utensili...

Zellbasierte Therapien stellen revolutionäre biologische Techniken dar, die in der Medizin weit verbreitet sind. Kürzlich wurden sie erfolgreich bei der Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, Augenerkrankungen und Krebs angewendet. Zelltherapien decken ein breites Spektrum von Bereichen ab, vom Zellersatz bis zur Medikamentenabgabe, und dieses Protokoll konzentriert sich auf Letzteres. Biologisch abbaubare Alginat-Mikrokapseln (MC) haben Wirksamkeit als Abgabesystem gezeigt, und sie werden immer weit verbreitet im biomedizinischen Bereich verwendet. Alginat wurde in der Mikroverkapselung aufgrund seines einfachen Gelierprozesses, der biologischen Abbaubarkeit, der ausgezeichneten Biokompatibilität und der Stabilität unter in vivo Bedingungen1,2,3,4verwendet.
Das Elektrospray-Verfahren wurde als Mikroverkapselungstechnik erfolgreich eingesetzt, um Peptide und Proteine mit Alginat (Basispolymer) und Poly-l-Ornithin (Sekundärbeschichtungspolymer) zu verkapseln. Beide Polymere sind natürlich erweise wiedergefunden und für ihre Biokompatibilitätverwendet 5,6,7. Die Hauptherausforderung bei zellbasierten Therapien ist jedoch die Unterdrückung des Wirtsimmunsystems, um Nebenwirkungen zu vermeiden, die durch immunsuppressive Medikamente verursacht werden. Die Durchlässigkeit von Alginat-Mikrokapseln gilt als geeignete Eigenschaft für die Zellverkapselung, die die Diffusion von Nährstoffen, Abfällen und therapeutischen Faktoren in und aus Zellen ermöglicht, während sie vom Wirt Immunantwort8,9,10maskiert werden.
Im Auge wurden verkapselte Zellen in klinischen Studien zur konstanten Abgabe von Biologika (d. h. Wachstumsfaktoren11,12 und Wachstumsfaktor-Antagonisten13) zur Behandlung von Retinitis pigmentosa oder altersbedingter Makuladegeneration eingesetzt. Andere Ziele wie Komplementhemmer14 werden derzeit ebenfalls in präklinischen Umgebungen untersucht.

<table><tbody><tr><td>3 mL Spritze</td><td>BD</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>30 G 1" stumpfe Nadel</td><td>SAI Infusionstechnologie</td><td>B30-100</td><td></td></tr><tr><td>Alginsäure Natriumsalz, aus Braunalgen</td><td>Sigma</td><td>A0682</td><td></td></tr><tr><td>Atropinsulfat Ophthalmolische Lösung (1%)</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-215-15</td><td>zur Pupillenerweiterung</td></tr><tr><td>BD 1 mL Spritze 26 G x 3/8 (0,45 mm x 10 mm)</td><td>Becton, Dickinson und Das Unternehmen</td><td>DG518105 500029609 REF 309625</td><td>zur Erzeugung des Führungslochs</td></tr><tr><td>Calciumchlorid, wasserfrei, granulat</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>GenTeal Tears</td><td>Alcon</td><td>NDC 0078-0429-47</td><td>zur Befeuchtung der Augen während der Anästhesie</td></tr><tr><td>Goniotaire: Hypromellose (2,5%) Ophthalmolic Demulcent Solution (steril)</td><td>Altaire Pharmaceuticals Inc.</td><td>NDC 59390-182-13</td><td>zur Befeuchtung der Augen während der Anästhesie</td></tr><tr><td>Hamilton Nadel-/Spritzenspitze: 27 G, Small Hub RN NDL, Custum Länge (12 mm), Point Style 3, 6/PK</td><td>Hamilton</td><td>7803-01</td><td>für die intravitreale Verabreichung von Kapseln</td></tr><tr><td>Hamilton Spritze: 2,5 & Mikro; L, Modell 62 RN SYR, NDL Separat erhältlich</td><td>Hamilton</td><td>7632-01</td><td>für die intravitreale Verabreichung von Kapseln</td></tr><tr><td>HEPES-Puffer, 1 M</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP299100</td><td></td></tr><tr><td>Hochspannungsgenerator</td><td>ESD EMV-Technologie</td><td>ES813-D20</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viabilitäts-/Zytotoxizitätskit</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>L-Ornithinhydrochlorid, 99%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12111</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin- und Polymyxin-B-Sulfate und Dexamethason-Augensalbe</td><td>SANDOZ</td><td>NDC 61314-631-36</td><td>Antibiotikum zur Vorbeugung von Infektionen nach intravitrealer</td></tr><tr><td>Injektion Phenolephrinhydrochlorid Ophthalmolische Lösung (2,5%)</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-201-15</td><td>zur Pupillenerweiterung</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma</td><td>S-5886</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Spritze Filter, 0,2 &mu; m</td><td>VWR</td><td>28143-312</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>GRASEBY</td><td>MS16A</td><td></td></tr></tbody></table>

gekapselte zelltechnologie für die lieferung von biologika an das mausauge

Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye

Viele aktuelle Therapeutika in Der Entwicklung für Erkrankungen der hinteren Pol des Auges sind Biologika. Diese Medikamente müssen häufig verabreicht werden, in der Regel über intravitreale Injektionen. Verkapselte Zellen, die das Biologische der Wahl exzessiver exzessiver exzessierend sind, werden zu einem Werkzeug für die lokale Proteinproduktion und -freisetzung (z. B. durch langfristige Medikamentenabgabe). Darüber hinaus verwenden Verkapselungssysteme durchlässige Materialien, die die Diffusion von Nährstoffen, Abfällen und therapeutischen Faktoren in und aus Zellen ermöglichen. Dies geschieht, während die Zellen aus dem Wirt Immunantwort maskiert, Vermeidung der Notwendigkeit der Unterdrückung des Wirts-Immunsystem. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Alginat als Polymer in der Mikroverkapselung gekoppelt mit dem Elektrospray-Verfahren als Mikroverkapselungstechnik. ARPE-19-Zellen, eine spontan entstehende humane RPE-Zelllinie, wurde aufgrund ihrer Lebensdauer in Langzeit-Zelltherapieexperimenten eingesetzt und wird hier zur Verkapselung und Abgabe der Kapseln an Mausaugen eingesetzt. Das Manuskript fasst die Schritte zur Zellmikroverkapselung, Qualitätskontrolle und Augenzustellung zusammen.

ARPE-19-Zellen sind eine spontan verewigte menschliche RPE-Zelllinie, die nachweislich bei der Implantation von Kapseln in das Auge verkapselt und langfristig überleben kann. Die Werkzeuge für die Alginatverkapselung sind in Abbildung 1dargestellt. In dieser Studie wurde gezeigt, dass bei der Verkapselung in Alginat die Zellen in Alginatkapseln durch Hellfeld-Bildgebung bestätigt wurden (Abbildung 2A). An den Zellen in den Kapseln wurden livetote Tests durchgefü...

Hier wird ein Protokoll zur Verwendung von Alginat als Polymer bei der Mikroverkapselung von verewigten Zellen zur langfristigen Lieferung von Biologika an Nagetieraugen vorgestellt.

Gekapselte Zelltechnologie für die Lieferung von Biologika an das Mausauge

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, ...

Diese Technik ist eine zuverlässige Möglichkeit, Inhalte wie Medikamente, Proteine oder Zellen an bestimmte Orte in Geweben oder Tieren zu liefern. Sie können die Lieferung verfolgen und die Veröffentlichung des Inhalts so abstimmen, dass sie zu dem von Ihnen geplanten Experiment passt. Es kann verwendet werden, um zahlreiche Krankheiten von der Wundheilung bis hin zu Augen- und Herzerkrankungen zu behandeln.Der Hauptvorteil dieser Methode ist die Fähigkeit, therapeutische Zellen mit Alginat-Mikrokapseln an die Zielstellen zu liefern, ohne Immunreaktionen zu verursachen und eine nachhaltige Lieferung von frischen abgesonderten Therapeutika für einen längeren Zeitraum aufrechtzuerhalten. Beginnen Sie mit der Kultivierung von Retinalen epithelzellen nach Manuskriptanweisungen. Durchkommen sie die Zellen, wenn sie 70 bis 80% Konfluenz erreichen, mit Standard-Gewebekulturverfahren.Um die Zellen zu verkapseln, mischen Sie Natriumalginat mit entionisiertem Wasser für eine Endkonzentration von 2% Volumen zu Volumen und reinigen Sie das Gemisch durch Filtration mit einem 0,2 Mikrometer sterilen Spritzenfilter. Versuchen, zentrifugieren und waschen Sie die Zellen mit 10 Millimolar HEPES gepufferte Saline-Lösung. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen und die endgültige Zellkonzentration auf eine Million pro Milliliter Alginatlösung einzustellen.300 Mikroliter Aliquots des Alginat- und Zellengemischs in eine Drei-Milliliter-Spritze geben und an einer Spritzenpumpe befestigen. Bereiten Sie ein Gelierbad nach Manuskriptanweisungen vor und legen Sie es in einem sterilen 50-Milliliter-Becher unter der Spritzenspitze an einer Sieben-Millimeter-Nadel, um den Sprühabstand zu besaugen. Stellen Sie die Spannung auf acht Kilovolt und die Durchflussrate auf 30 Millimeter pro Stunde ein, um Mikrokapseln zu erzeugen, die etwa 150 Mikrometer groß sind.Schließen Sie den schwarzen Erdungsclip mit dem Kupferdraht an, der auf halbem Weg in das Gelierbad getaucht ist, und verbinden Sie den Clip des roten Anodendrahtes mit der Nadel. Es dauert etwa 30 Minuten, um gekapselte Zellen aus jeder Milliliter-Charge des Alginat- und Zellgemischs vorzubereiten. Wenn sie gebildet sind, waschen Sie die Mikrokapseln zweimal mit Waschlösung und inkubieren Sie sie mit 10%FBS ergänztdmEM Medien in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5%CO2.Nach einer 24-stündigen Inkubation eine 500-Mikroliter-Probe von Mikrokapseln zur Färbung vorbereiten, indem Sie sie zweimal in Waschlösung waschen. Verwenden Sie ein LIVE/DEAD Assay-Kit, um sie für die Lebensfähigkeit zu beflecken. Um sicherzustellen, dass die Mikrokapseln entsprechend dimensioniert sind, verdünnen Sie sie in serumfreien Medien.Saugen Sie sie vorsichtig mit einer 2,5 Mikroliter Hamilton Spritze. Werfen Sie langsam einen Mikroliter tropfen auf ein Mikroskop-Dia und bestimmen Sie die Integrität der Mikrokapseln mit einem aufrechten Brightfield Mikroskop. Wenden Sie bei einer entsprechend anästhesierten Maus Augenschmiermittel auf, um die Feuchtigkeit des Auges aufrechtzuerhalten, und verwenden Sie eine 26 Gauge 3/8 Zoll abgeschrägte Spritzennadel, um eine anfängliche Augenpunktion direkt unter dem Limbus zu etablieren.Achten Sie darauf, sich dem Auge aus nasaler Richtung in einem 45-Grad-Winkel zu nähern und die abgeschrägte Spitze nach oben zu halten, um eine Perforation der Linse zu vermeiden. Als nächstes stellen Sie sicher, dass die gesamte Nadelspitze in das Auge für die Führung LochErzeugung eingeführt wird, aber achten Sie darauf, nicht zu weit zu reisen und die zeitliche Netzhaut zu durchstechen. Sobald dies abgeschlossen ist, ziehen Sie die Nadel langsam zurück.Platzieren Sie innerhalb des Mikromanipulators eine 27 Gauge stumpfe Spitze 2,5 Mikroliter Hamilton Spritze, die mit Kapsellösung gefüllt wurde, und säumen Sie die Nadel mit dem ersten Führungsloch. Halten Sie den Kopf des Tieres in einer stabilen Position und manövrieren Sie die Nadel absichtlich in Richtung des Auges. Um eine korrekte Nadelposition innerhalb des Glaskörpers zu gewährleisten, legen Sie die Spritze ein, bis die Nadelspitze hinter der Linse visualisiert werden kann.Dann injizieren Sie die Kapsellösung langsam im Laufe von 25 bis 30 Sekunden. Und nach Fertigstellung, nach und nach ziehen Sie die stumpfe Spitzenspritze, um Verletzungen des Auges zu minimieren. Passen Sie bei Bedarf die Kapselgröße an, indem Sie die Spannung und die Durchflussrate entsprechend den Manuskriptrichtungen anpassen.Die Verkapselung der Zellen in Alginat wurde mit Brightfield-Bildgebung bestätigt und ein LIVE/DEAD-Test zeigte, dass 90% der Zellen nach der Verkapselung lebensfähig waren. Die langfristige Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch das Auflösen der Kapseln in Natriumcitrat und Replating sichergestellt. Die intravitreale Injektion wurde im Rahmen einer visuellen Inspektion durchgeführt, die die Visualisierung von Kapseln im Glaskörper ermöglichte.Verwenden Sie beim Versuch dieses Verfahrens PBS nicht für Waschschritte, da PBS gebildete Alginat-Mikrokapseln auflöst. Nach seiner Entwicklung wird unser Labor als Abgabesystem zur Behandlung von Formen von Herzinsuffizienz und Bluthochdruck eingesetzt. Diese Technik gilt als vielversprechendes Werkzeug für die zukünftige Behandlung verschiedener herz-kreislauf- und neurologischer Erkrankungen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Ein Verfahren ist für die menschliche Retinoblastom Tumoren in Mäusen zu propagieren. Tumorzellen sind direkt in die Augen immungeschwächten Mäusen injiziert. Sekundäre Tumoren wurden erfolgreich etabliert mit beiden Zellen direkt aus humanen Tumoren und kultiviert tumorspheres geerntet.

Aufbau und Verbreitung der Menschenrechte Retinoblastoma Tumore in immundefizienten Mäuse

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

Eine Methode für die Einbeziehung von Plasmid-DNA in murinen Zellen der Netzhaut zum Zwecke der Durchführung entweder gewinnen oder Verlust der Funktion...

In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

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Subretinalen Injektion von Vektoren für die Gentherapie und Stammzellen in die Maus Eye

Dieses Video beschreibt eine Methode zur Generierung eines Mausmodells, das bakterielle Endophthalmitis – eine intraokulare Infektion, die aus einer bakteriellen Invasion in die Glaskörperhöhle des Auges resultiert – durch intravitreale Injektion einer bakteriellen Suspension in das Auge nachahmt. Dieses Mausmodell hilft dabei, den Krankheitsmechanismus zu untersuchen und Therapeutika dafür zu evaluieren.

Bakterielle Endophthalmitis Mausmodell: Ein Verfahren zur Erzeugung von bakterieller Endophthalmitis durch intravitreale Injektion von Bakteriensuspension in das Auge einer Maus

Dieses Video zeigt eine konvektionsverstärkte Verabreichungstechnik (CED) für die Verabreichung von Antikörpern in das Gehirn von Mäusen. Der Schädel einer anästhesierten Maus wird freigelegt, und im Zielbereich wird ein Bohrloch für die Antikörperabgabe erzeugt. Ein Stufenkatheter mit Antikörpern wird an der Zielstelle eingeführt, und über eine Infusionspumpe wird ein Druckgradient erzeugt, um Antikörper mit einer kontrollierten Geschwindigkeit zu verabreichen.

Konvektionsverstärkte Verabreichung von Antikörpern in ein Mäusegehirn

Die subretinale Injektion ist eine chirurgische Technik zur effektiven Genabgabe an das retinale Pigmentepithel im Mausauge.  Hier beschreiben wir eine einfache und replizierbare Methode zur subretinalen Injektion von viralen Vektoren in retinales Pigmentepithel bei Versuchsmäusen.

Limbus-Ansatz-Subretinale Injektion von viralen Vektoren für die Gentherapie bei Mäusen Retinapigmentepithel

Hier zeigen wir einen neuartigen Ansatz zur Verwendung von hochauflösenden spectral-Domain optische Kohärenztomographie (HR-SD-OCT) Lieferung der Gen-Therapie-Agenten in den subretinalen Raum zu unterstützen, beurteilen seine areal Abdeckung und Photorezeptor Vitalität zu charakterisieren.

Höchste Auflösung Maus optische Kohärenztomographie, intraokulare Injektion in die retinale Gentherapie Forschung unterstützen

Wir beschreiben hier eine Methode der intravitrealen Injektion und der anschließenden bakteriellen Quantifizierung im Mausmodell der bakteriellen Endophthalmitis. Dieses Protokoll kann erweitert werden, um die Immunantworten des Wirts und die bakterielle und die Genexpression zu messen.

Intravitreale Injektion und Quantifizierung von Infektionsparametern in einem Mausmodell der bakteriellen Endophthalmitis

Wir stellen ein Protokoll für den Einsatz der faseroptischen konfokalen Lasermikroendoskopie (CLM) vor, um die räumlich-zeitliche Verteilung von Liposomen im Auge nach subkonjunktivaler Injektion nicht-invasiv zu untersuchen.

Räumlich-zeitliche In-vivo-Bildgebung von okulären Wirkstoffabgabesystemen mittels faseroptischer konfokaler Lasermikroendoskopie

Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für die Präparation von post-kryokonservierten hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen und die subretinale Verabreichung dieser Zellen in rd10-Mäusen .

Subretinale Verabreichung von Photorezeptor-Vorläuferzellen aus humanen embryonalen Stammzellen in rd10-Mäusen

Erfahren Sie die Mikroverkapselung mit Alginat zur gezielten Abgabe von Biologika an das Mausauge. Diese Methode ermöglicht die langfristige Freisetzung therapeutischer Zellen bei minimaler Immunreaktion.

Gekapselte Zelltechnologie für die Lieferung von Biologika an das Mausauge

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