Name: Ein Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Modell mit Split Corneal Buttons (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Erfahren Sie die Langzeitkultur kornealer Endothelzellen mit Split-Corneal-Buttons aus porcinen Augen. Diese Methode reduziert den Zellverlust erheblich und ermöglicht Kulturen über mindestens 15 Tage für ophthalmologische Forschung.

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Die Erstellung des vorgestellten Forschungsmodells wurde von KMU-innovativ (FKZ: 13GW0037F) des Bundesministeriums für Bildung und Forschung Deutschland unterstützt.

Dieses Protokoll folgt den ethischen Richtlinien unserer Institution. Gemäß den Statuten des Ethikprüfungsausschusses unserer Institution musste vor den Experimenten keine ethische Genehmigung eingeholt werden, da alle Schweinehornhäuschen vom örtlichen Schlachthof bezogen wurden.
1. Orgelkultur
<ol><li>Bereiten Sie Schweineaugen vor.<ol>
<li>Vom örtlichen Schlachthof erhalten Sie Schweineaugen, die kurz nach dem Mortem, aber vor der thermischen Behandlung entfernt wurden. Transportieren Sie die Augen zum Labor und verarbeiten Sie sie innerhalb weniger Stunden. Während des Transports die Augen vor der Verarbeitung bei Raumtemperatur (ca. 21 °C) halten.</li>
		<li>Entfernen Sie alle orbitalen Adnexe (Augenmuskeln, Bindehaut, Fettgewebe) vor der Desinfektion mit Augenschere und colibrien Zangen. Alle Augen mit offensichtlichen Traumata, äußeren Schäden (z. B. Messerschnitt) oder sichtbaren Hornhauttrübungen trennen und entsorgen.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 5% Jod-PBS-Lösung (1:20) in einer sterilen Tasse vor, indem Sie 3 ml 7,5% Povidonjod zu 57 ml einer Phosphatgepufferten Salinelösung (PBS) hinzufügen. Bereiten Sie auch eine separate sterile Tasse mit 60 ml reinen PBS vor. HINWEIS: Die Gesamtmenge der verwendeten Jod-PBS-Lösung und die Größe der Tasse hängt von der Anzahl der zu sezierenden Hornhäuten ab. Fünf bis sechs Augen benötigen etwa 60 ml der 5%-Jod-PBS-Lösung, um richtig desinfiziert zu werden.</li>
		<li>Legen Sie fünf bis sechs Augen in die 5%-Jod-PBS-Lösung für insgesamt 5 min, um die Augenoberfläche richtig zu desinfizieren. Jede Minute vorsichtig umrühren, um sicherzustellen, dass die Augenoberfläche vollständig untergetaucht und vollständig in der Jodlösung desinfiziert wird.</li>
		<li>Nach 5 min die desinfizierten Augen auf den vorbereiteten Becher mit reinem PBS gefüllt übertragen. Erneut vorsichtig rühren, um sicherzustellen, dass die Jod-PBS-Lösung von der Augenoberfläche weggespült wird. HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt auf einer sauberen Bank aus, um eine Kontamination der desinfizierten Augen zu verhindern.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie Zellkulturplatten vor. HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte auf einer sauberen Bank mit konstantem laminaren Luftstrom aus.<ol>
<li>Tau2 ml fetales Wadenserum (FCS). Füllen Sie eine Spritze (5 ml) mit dem FCS mit einer stumpfen Kanüle. Entleeren Sie die Spritze durch einen Spritzenfilter (0,22 m), um eine mögliche bakterielle Kontamination des FCS in 80 ml dextranfreies Kulturmedium I (mindestens wesentliches Medium [MEM] mit Earle-Salzen, Penicillin/Streptomycin, L-Glutamin [200 mM], zu verhindern, Amphotericin B [250 g/ml], Hepespuffer [1 M] [50x], NaHCO3und destilliertes Wasser). Rühren Sie die Mischung, um eine gleichmäßige Substratverteilung zu gewährleisten.</li>
		<li>Füllen Sie jeden Brunnen einer 12 Brunnenzellkulturplatte mit 3 ml der Substratmischung.</li>
	</ol></li>
	<li>Durchführen von Sezierungen und Inkubationen. HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt auf einer sauberen Bank aus. Berühren Sie das Hornhautendothel nicht mit irgendwelchen Instrumenten.<ol>
<li>Übertragen Sie eine Glühbirne aus der Tasse mit PBS in den Augenzwiebelhalter mit der Hornhaut nach oben und legen Sie sie unter ein ophthalmologisches Operationsmikroskop. Verwenden Sie eine Spritze gefüllt mit 0,9% NaCl, um leicht etwas Absaugung auf das Auge über die Augenzwiebelhalter, um das Auge in Position für die Zerlegung zu fixieren.</li>
		<li>Verwenden Sie ein Trephin (ca. 7,5 mm), das ein standardisiertes Inlay enthält, das sicherstellt, dass die Trephintiefe 300 m nicht überschreitet, um oberflächlich in die zentrale Hornhaut zu schneiden (Abbildung 1A).</li>
		<li>Verwenden Sie colibrifarbene Zangen und ein Einwegsskalpell mit einer dreieckigen Klinge, um den teilweise gebäusbten Teil der Hornhaut horizontal durch die Stroma zu schneiden und zu entfernen. Entsorgen Sie den abgetrennten Hornhautteil, der aus dem Hornhautepithel, der Bogenmannschicht und einem Teil des Stroma besteht. HINWEIS: Halten Sie die horizontale Schnittrichtung strikt aufrecht, um eine gleichmäßige Dicke des verbleibenden Stroma zu erhalten.</li>
		<li>Oberflächlich eine 10-0 Naht (10-0 Polyamid 6) in den Stroma legen, um das Endothel während der Experimente von der stromalen Seite unterscheiden zu können (Abbildung 1B). Verhindern Sie das Eindringen des Hornhautendothel. Entsorgen Sie die Glühbirne, wenn das Endothel durchdrungen ist. HINWEIS: Das Eindringen des Hornhautendotheles mit der Nahtnadel wird sichtbar sein, da Flüssigkeit aus der vorderen Augenkammer durch den Nahtkanal austritt.</li>
		<li>Verwenden Sie das Trephin ohne Inlay, um den trephinierten Schnitt bis zur erliegenden vorderen Augenkammer in die volle Tiefe zu bringen (Abbildung 1C). Ein deutlicher Rückgang des Widerstands und flüssigkeitsaustritt aus der vorderen Augenkammer kann nach vollständiger Penetration der Hornhaut wahrgenommen werden. HINWEIS: Verwenden Sie ein Hockeymesser, wenn der gespaltene Hornhautknopf nach der Trephination auf einer Seite des geteilten Hornhautknopfes befestigt bleibt.</li>
		<li>Übertragen Sie den erhaltenen geteilten Hornhautknopf, der nun aus einem Teil der Stroma (Abbildung 2), der Descemet-Membran und dem Hornhautendothel besteht, in das Kulturmedium (Kulturmedium I + FCS, siehe Abschnitt 1.2) in die 12 Brunnenzellkulturplatte mit dem getaggte Seite nach unten, so dass das Hornhautendothel nach oben gerichtet ist. HINWEIS: Wenn die Endothelseite nach unten gerichtet ist, kann das Endothel beschädigt werden.</li>
		<li>Weisen Sie jedem geteilten Hornhautknopf eine individuelle Zahl zur Identifizierung während der Follow-ups zu und beschriften Sie die Brunnen auf der Zellkulturplatte entsprechend.</li>
		<li>Inkubieren Sie die gefüllten Zellkulturplatten in einem Inkubator unter Standardbedingungen bei einer Temperatur von 37 °C, 5%CO2 und einer relativen Luftfeuchte von 95%. Ändern Sie das Kulturmedium (Kulturmedium I + FCS) an Tag 8, wenn eine Inkubationszeit von 7 Tagen überschritten wird. HINWEIS: Das Inkubationsverfahren mit geteilten Hornhautknöpfen wurde für bis zu 15 Tage validiert.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60171/60171fig1.jpg"> Abbildung 1: Zerlegung der Schweinehornhaut, um gespaltene Hornhautknöpfe zu erhalten. (A) Nach der Trephination der Hornhaut mit einem Trephin mit einer Inlay, um in eine Tiefe von 300 m zu schneiden und das Epithel und Teile des Stromalgewebes zu entfernen, (B) wird eine Naht oberflächlich in die Stroma gelegt, ohne dass die Hornhaut Endothel zur späteren Identifizierung der stromalen Seite. (C) Auf die vollständige Trephination der verbleibenden Hornhaut folgt (D) die Entfernung des erhaltenen gespaltenen Hornhautknopfes aus der Augenzwiebel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60171/60171fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
2. Mikroskopie und Untersuchung des Endothel
<ol><li>Führen Sie eine ungefärbte Untersuchung durch. HINWEIS: Die unbefleckte Untersuchung kann mehrmals durchgeführt werden (z. B. bei wöchentlichen Follow-ups an Tag 1, 8 und 15). Die unbefleckte Zählung erlaubt jedoch nur die Beurteilung der Endothelzelldichte, nicht morphologische Parameter.<ol>
<li>Füllen Sie 3 ml hypotonische ausgewogene Salzlösung (hBSS, siehe Zusammensetzung in Tabelle der Materialien) in jedem Brunnen einer 12 Brunnenzellkulturplatte. Legen Sie vorsichtig einen einzelnen gespaltenen Hornhautknopf in hBSS, um schwellungen der hornhauten Endothelzellen zu induzieren und die Sichtbarkeit der Zellen für die Zellzählung zu verbessern. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Endothelseite in Richtung des Mikroskops ausgerichtet ist. Wenn ein invertiertes Phasenkontrastmikroskop verwendet wird, muss die endotheliale Seite nach unten gerichtet sein. Während an Ort und Stelle, die Kulturplatte sollte nicht bewegt werden, um Endothelzellschäden zu verhindern.</li>
		<li>Lassen Sie die Zellen für 1-2 min anschwellen, bevor Sie ein Bild des Endothels mit der Kamera am Mikroskop befestigt. Nehmen Sie mindestens drei Fotos von mindestens drei verschiedenen Bereichen auf, um einen repräsentativen Eindruck vom tatsächlichen Zustand des Hornhautendothel zu erhalten. Fügen Sie einen Maßstabsbalken mit einer Maßstabslänge von 100 m für eine spätere Analyse der kornealen Endothelzelldichte und morphologischen Parameter hinzu.</li>
		<li>Um osmotische Schäden zu vermeiden, entfernen Sie den geteilten Hornhautknopf nach maximal 5 min aus dem hBSS und übertragen Sie ihn wieder in das Kulturmedium3.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie eine gefärbte Untersuchung durch. HINWEIS: Die Färbung beendet die Experimente, da die verwendeten Färbesubstanzen zytotoxisch sind. Daher darf die Färbung nur am Ende des Beobachtungszeitraums zur Beurteilung morphologischer Parameter (Reformationsfiguren, Rosettenbildungen, Alizarinrot-Gefärbte Zellen) durchgeführt werden.<ol>
<li>Bereiten Sie eine 0,25% Trypan-Blau-Lösung und 0,2% Alizarin rote S-Lösung für das Färbeverfahren vor.<ol>
<li>Für die 0,25% Trypan-Blaulösung die 0,4% Trypan-Blaulösung mit einer 0,9% NaCl-Lösung verdünnen. HINWEIS: Um beispielsweise 20 ml einer 0,25% Trypan-Blaulösung zu erhalten, verdünnen Sie 12,5 ml der 0,4% Trypan-Blaulösung mit 7,5 ml der 0,9%-NaCl-Lösung. Die Trypanblaulösung kann mehrere Wochen oder Monate bei Raumtemperatur gelagert werden.</li>
			<li>Um eine 0,2% Alizarin rote S-Lösung zu erhalten, lösen Sie 100 mg des Alizarin-Roten S-Pulvers in 50 ml einer 0,9%igen NaCl-Lösung unter ständigem Rühren und Erhitzen auf 50 °C auf einer Magnetrührplatte mit Heizfunktion auf. Um mögliche Ausscheidungen zu entfernen, filtern Sie die erhaltene Lösung. Stellen Sie den pH-Wert der Alizarin-Rot-S-Lösung auf pH 4.2 ein, indem Sie Natriumhydroxid oder Salzsäure entsprechend zusetzen. HINWEIS: Stellen Sie vor jeder Anwendung der Alizarin-Rot-S-Lösung sicher, dass der pH-Wert auf 4.2 korrigiert wird und dass sich keine Ausfällungen in der Lösung befinden. Die Lösung kann bei Raumtemperatur gelagert werden. Bewahren Sie die Lösung nicht länger als 4 Wochen auf.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Legen Sie die geteilten Hornhautknöpfe in Petrischalen mit der endotheliaalen Seite nach oben, um die Endothelzellen zu färben. Verwenden Sie eine Pipette, um die 0,25% Trypan-Blaulösung Tropfen für Tropfen auf das Hornhautendothel für 90 s langsam zu tropfen. HINWEIS: Trypan blue ermöglicht die Identifizierung beschädigter Hornhautzellen mit einer durchlässigen Membran, da sie ihre Kerne färbt.</li>
		<li>Spülen Sie den gespaltenen Hornhautknopf 3x in 0,9% NaCl vorsichtig in einem kleinen Glasbecher ab. Verwenden Sie erneut eine Pipette, um die 0,2% Alizarin rote S-Lösung Tropfen für Tropfen auf das Hornhautendothel für 90 s langsam zu tropfen. HINWEIS: Alizarin rot S färbt die Membran des Descemet, die hilft, Zellränder in unbeschädigten hornhauten Endothelzellen hervorzuheben und zerstörte Zellen hervorzuheben, wenn die zugrunde liegende Descemet-Membran sichtbar wird. Außerdem ermöglicht es die einfache Identifizierung größerer zerstörter Gebiete.</li>
		<li>Zur Untersuchung des gefärbten Hornhautendothel folgen Sie den Schritten, die für die unbefleckte Zählung in Abschnitt 2.1 erklärt werden.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analyse der kornealen Endothelzelldichte und morphologischer Parameter
<ol><li>Projektzählquadrate auf den Bildern mit einer Grafikbearbeitungssoftware (Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Öffnen Sie die Software und öffnen Sie ein Bild des Hornhautendothel, indem Sie Datei | Öffnen | Wählen Sie.</li>
		<li>Projizieren Sie ein Quadrat mit einer maßstabsgetreuen Seitenlänge von 100 m auf das Bild. HINWEIS: Die folgenden Schritte von Abschnitt 3.1.2 können ignoriert werden, wenn die Anzeigesoftware das Projizieren von Quadraten auf das Bild ermöglicht. Die Seitenlänge des Quadrats hängt von der Auflösung der mit der Kamera des Mikroskops aufgenommenen Bilder ab und kann mit dem Skalenbalken berechnet werden.<ol>
<li>Schneiden Sie die Skalenleiste aus dem mit dem Mikroskop aufgenommenen Foto zu: Wählen Sie das rechteckige Marquee-Werkzeug auf der Werkzeugleiste aus oder drücken Sie M, um dann die Maßstabsleiste einzugrenzen, und wählen Sie dann Bearbeiten | Zuschneiden oder drücken Sie Strg + X.</li>
			<li>Klicken Sie auf Datei | Neu (oder drücken Sie Strg + N). Wählen Sie im kommenden Fenster die Zwischenablage in der Dropdown-Liste Dokumenttyp aus. Die Anzahl der angezeigten Pixel ist die Seitenlänge des Zählquadrats. Beachten Sie die entsprechenden Pixel für die anderen Bilder und klicken Sie auf OK.</li>
			<li>Datei auswählen | Neu (oder Strg + N). Fügen Sie breite und lange (in Pixel) des Zählquadrats im kommenden Fenster entsprechend der Länge der Maßstabsleiste ein. Wählen Sie die Hintergrundfarbe Weiß, und drücken Sie dann OK.</li>
			<li>Klicken Sie auf Auswählen | Wählen Sie alle (oder Strg + A). Bearbeiten auswählen | Kopieren (oder Strg + C).</li>
			<li>Wählen Sie das Bild des Hornhautendothel, das in Schritt 3.1.1 geöffnet wurde. Bearbeiten auswählen | Fügen Sie (oder Strg + V) ein, um das Quadrat auf dem Foto des Hornhautendothels einzufügen.</li>
			<li>Wählen Sie die Ebene des Quadrats aus, und passen Sie die Transparenz an. Layer auswählen | Layer-Stil | Mischoptionen | Opazität auf 30 % einstellen | OK.</li>
			<li>Speichern Sie das Bild mit dem projizierten Quadrat mit einer maßstabsgetreuen Seitenlänge von 100 m. Wiederholen Sie dies mit den anderen Bildern, die für die Analyse benötigt werden.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bewerten Sie die Endothelzelldichte und die morphologischen Parameter.<ol>
<li>Öffnen Sie die Bilder mit den projizierten Quadraten in ImageJ (Version 1.50i) und verwenden Sie das CellCounter PlugIn, um die Zellen innerhalb des Quadrats zu zählen. Öffnen Sie ImageJ, wählen Sie Datei | Öffnen (oder Strg + O) | Wählen Sie Bild. HINWEIS: ImageJ und das CellCounter PlugIn stehen freeware zum Online-Download zur Verfügung.</li>
		<li>Plugins auswählen | Cell_Counter | Zelle Zähler | Initialisierenvon . Zählen Sie die Endothelzellen und zeichnen Sie das Ergebnis auf. Zählen Sie auf zwei Seiten des Quadrats die Zellen, die durch den Rand des Quadrats geschnitten werden. Zählen Sie die geschnittenen Zellen nicht auf den beiden anderen Seiten.</li>
		<li>Analysieren Sie mindestens sechs Quadrate pro Hornhaut aus verschiedenen Bereichen (z. B. drei Bilder, zwei Quadrate pro Bild) und bestimmen Sie die durchschnittliche korneale Endothelzelldichte pro Quadrat (100 m2). Extrapolieren Sie die Endothelzelldichte pro 100 m2 bis 1 mm2 durch Multiplikation mit 100.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Für die Beurteilung morphologischer Veränderungen zählen Reformationszahlen (gemeinsames Treffen von 4 Zellen/Zellrändern statt drei), Rosettenformationen (charakteristisches rosetteförmiges Aussehen, fünf oder mehr radial angeordnete Zellen, die eine zerstörte Zelle umgeben ) oder alizarin rote Bereiche (zerstörte Zellen) in den projizierten Quadraten. HINWEIS: Alternativ kann es sinnvoll sein, größere Quadrate (z. B. 200 x 200 m2) für die morphologische Analyse in gut erhaltenen Proben zu verwenden, um repräsentativere Ergebnisse zu erzielen.</li>
</ol>

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<li>Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sandøe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3Rs+principle+-+mind+the+ethical+gap%21%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX+Proceedings%2C+1%2F12%2C+Proceedings+of+WC8%22%5BJournal%5D)">The 3Rs principle - mind the ethical gap!</a> ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. , 333-336 (2012).</li>
<li>Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+parameters+of+the+porcine+eyeball%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The parameters of the porcine eyeball.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249 (4), 475-482 (2011).</li>
<li>Kim, M. K., Hara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+corneal+xenotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Current status of corneal xenotransplantation.</a> International Journal of Surgery. 23 (Pt B), 255-260 (2015).</li>
<li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Proliferative+Capacity+of+Genetically-Engineered+Pig+and+Human%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human.</a> Ophthalmic Research. 49 (3), 127-138 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Herstellung von Schweinesplit-Hornhautknöpfen, die ein standardisiertes und kostengünstiges ex vivo korneales endotheliales Organkulturmodell für Forschungszwecke darstellt6. Porcin Split Hornhautknöpfe zeigten eine Abnahme der Endothelzelldichte vergleichbar mit Endothelzellverlusten, die in menschlichen Spenderhornhäuten beobachtet wurden, die in Augenbänken über einen Zeitraum von zwei Wochen kultiviert wurden6,<sup cla...

Hornhauttransplantationsverfahren gehören zu den am häufigsten durchgeführten Transplantationen weltweit1. Da es einen schweren Mangel an menschlichen Spender Hornhäuten gibt, ist experimentelle Forschung zur Bekämpfung von Hornhautendothelzellen in menschlichen Hornhäuten schwierig,1durchzuführen. Die Einführung von Bewässerungslösungen und anderen im Auge verwendeten Substanzen, ophthalmologischen viskoelastischen Geräten sowie chirurgischen Instrumenten und Techniken (z. B. Phakoemulsifikationsinstrumente und -techniken, Ultraschallenergie) valide und umfangreiche Untersuchungen über ihre Auswirkungen auf das Hornhautendothel vor der klinischen Anwendung.
Für die Forschung gibt es nur wenige Alternativen zu menschlichen Spenderhornhäuten. Tierforschungsmodelle sind sehr wertvoll, aber gleichzeitig sehr ressourcenverbrauchend und zunehmend ethisch hinterfragt. Ein großer Nachteil der In-vitro-Zellkulturen ist ihre begrenzte Übersetzung in das menschliche Auge. Die Ergebnisse aus Zellkulturen können unpassend zu In-vivo-Bedingungen sein, da Zellen einen endotheliaalen mesenchymalen Übergang (EMT) durchlaufen können, was zu einer fibroblastenähnlichen Morphologie führt, die durch den Verlust der Zellpolarität und Veränderungen der Zellform und des Gens verursacht wird. Ausdruck2.
Während frühere Ex-vivo-Modelle Anbauzeiten von bis zu 120 h meldeten, wurde vor kurzem eine neuartige Zubereitungstechnik eingeführt, um ein Porenhorn-Endothel-Organkulturmodell zu etablieren, indem frische Schweinehornhäasen für mindestens 15 Tage kultiviert wurden3 ,4,5,6. Wenn das Hornhautepithel und Teile des Stroma vor der Kultivierung aus der Hornhaut entfernt werden (insgesamt ca. 300 m), wird die Schwellung des Stroma in gespaltenen Hornhautknöpfen reduziert, was zu einem geringeren Endothelzellverlust und einem gepflegten Endothel Zellschicht nach bis zu 15 Tagen, während nicht-gespaltene Hornhautknöpfe einen signifikanten Endothelzellverlust aufgrund ungleichmäßiger stromaler Schwellungen und der Bildung von Descemets Falten aufweisen. Augenbänke verwenden in der Regel osmotische Entschwellende Mittel wie Dextran, um die Schwellung von Hornhäuten vor der Transplantation zu reduzieren. Jedoch, Diese Agenten wurden gezeigt, dass erhöhte Endothelzellverlust7,8,9induzieren.
Dieser Artikel zielt darauf ab, dieses standardisierte Ex-vivo-Forschungsmodell in einem detaillierten Schritt-für-Schritt-Protokoll zu visualisieren, um zukünftigen Forschern die Durchführung von Forschungen am Hornhautendothel mit gespaltenen Hornhautknöpfen zu ermöglichen. Dieses Modell stellt eine einfache Methode dar, um Substanzen und Techniken zu testen, die im Auge verwendet werden, wie ophthalmologische viskoelastische Geräte, Bewässerungslösungen und Ultraschallenergie oder andere Verfahren, bei denen das Hornhautendothel von Interesse ist.

<table><tbody><tr><td>Subject</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pig</td><td>eyes local abbatoir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Substances</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alizarin red S</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Culture Medium 1, #F9016</td><td>Biochrom GmbH, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS (1x)</td><td>Gibco, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Biochrom GmbH, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure (HCl)-Lösung</td><td>aus eigener Herstellung</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypotone ausgewogene Salzlösung</td><td>aus eigener Herstellung</td><td></td><td>pro 1 L H2O: NaCl 4,9 g; KCl 0,75 g; CaCl x H2O 0,49 g; MgCl2 x H2O 0,3 g; Natriumacetat x 3 H2O 3,9 g; Natriumcitrat x 2 H2O 1,7 g</td></tr><tr><td>Povidon-Jod 7,5%, Braunol</td><td>B. Braun Melsungen AG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl) 0,9</td>%<td>B. Braun Melsungen AG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)-Lösung</td><td>eigene Herstellung</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau 0,4%</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td><stark>Materialien & Materialien Instrumente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accu-jet pro</td><td>Brand GmbH, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Becherglas 50 mL</td><td>Schott AG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blunt Kanüle inkl. Filter (5 & micro; m) 18G</td><td>Becton Dickinson, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturplatte (12 Well)</td><td>Corning Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colibri Pinzette</td><td>Geuder AG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hornhautschere</td><td>Geuder AG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Pipette</td><td>Eppendorf AG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Augenlampenhalter</td><td>L. Klein, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Augenschere</td><td>Geuder AG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Faltfilter & 185 mm</td><td>Whatman, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hockeymesser</td><td>Geuder AG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laborglasflasche mit Verschluss 100 mL</td><td>Schott AG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetrührstab</td><td>Carl Roth GmbH & Co. KG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MillexGV Filter (5 & Mikro; m)</td><td>Merck Millopore Ltd., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nadelhalter</td><td>Geuder AG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>VWR International, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen</td><td>Sarstedt AG & Co., Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skalpell (zum Einmalgebrauch), dreieckige Klinge</td><td>Aesculap AG & Co. KG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipette 10 mL</td><td>Sarstedt AG & Co., Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipette 5 mL</td><td>Sarstedt AG & Co., Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile Becher</td><td>Greiner Bio-One, &Ouml; sterreich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile Handschuhe</td><td>Paul Hartmann AG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriles OP-Tuch</td><td>Paul Hartmann AG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nahtschere</td><td>Geuder AG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naht Ethilon 10-0 Polyamid 6</td><td>Ethicon Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spritze (5 mL)</td><td>Becton Dickinson, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trepan & Oslash; 7,5 mm</td><td>eigene Fertigung</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bindezange</td><td>Geuder AG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wiegepapier</td><td>neoLab Migge GmbH, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment & Equipment & Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Binokulares Operationsmikroskop</td><td>Carl Zeiss AG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera montiert am</td><td>Mikroskop Olympus, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellSens Entry (Software)</td><td>Olympus, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaltlichtquelle</td><td>Schott AG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Heraeus GmbH, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverses Phasenkontrastmikroskop</td><td>Olympus GmbH, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetrührer mit Heizfunktion</td><td>IKA-Werke GmbH & Co. KG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-Meter pHenomenal</td><td>VWR International, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS2</td><td>Adobe Systems, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präzisionsmaßstab</td><td>Ohaus Europe GmbH, Schweiz</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein porcine corneal endothelial organ culture modell mit split corneal buttons

A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons

Experimentelle Forschung an hornhauten Endothelzellen ist mit mehreren Schwierigkeiten verbunden. Menschliche Spenderhornhäuten sind knapp und selten für experimentelle Untersuchungen verfügbar, da sie normalerweise für eine Transplantation benötigt werden. Endothelzellkulturen übersetzen sich oft nicht gut in In-vivo-Situationen. Aufgrund der biostrukturellen Eigenschaften nichtmenschlicher Hornhäuten führt eine stromale Schwellung während der Kultivierung zu einem erheblichen Korneal-Endothelzellverlust, der die Kultivierung über einen längeren Zeitraum erschwert. Entschwellende Mittel wie Dextran werden verwendet, um dieser Reaktion entgegenzuwirken. Jedoch, Sie verursachen auch signifikanteen Endothelzellverlust. Daher wurde ein Ex-vivo-Organkulturmodell ohne Entschwellende Mittel etabliert. Schweineaugen aus einem örtlichen Schlachthof wurden verwendet, um gespaltene Hornhautknöpfe zuzubereiten. Nach partieller Hornhauttrephination wurden die äußeren Schichten der Hornhaut (Epithel, Bogenmannschicht, Teile der Stroma) entfernt. Dies reduziert signifikant den verlustfreien Hornhautzellverlust, der durch massive stromale Schwellungen und Descemets Membranfaltung über längere Kultivierungsperioden verursacht wird, und verbessert die allgemeine Erhaltung der Endothelzellschicht. Auf die anschließende vollständige Hornhauttrephination folgte die Entfernung des gespaltenen Hornhautknopfes aus der verbleibenden Augenzwiebel und der Kultivierung. Die Endothelzelldichte wurde in Folgezeiten von bis zu 15 Tagen nach der Zubereitung (d. h. tage 1, 8, 15) mittels Lichtmikroskopie bewertet. Die verwendete Zubereitungstechnik ermöglicht eine bessere Konservierung der Endothelzellschicht, die durch eine geringere stromale Gewebeschwellung ermöglicht wird, was zu langsamen und linearen Abnahmeraten in gespaltenen Hornhautknöpfen führt, die mit menschlichen Spenderhornhäuten vergleichbar sind. Da dieses standardisierte organotypisch kultivierte Forschungsmodell erstmals einen stabilen Anbau für mindestens zwei Wochen ermöglicht, ist es eine wertvolle Alternative zu menschlichen Spenderhornhäuten für zukünftige Untersuchungen verschiedener externer Faktoren in Bezug auf ihre Wirkungen auf das Hornhautendothel.

Die vorgestellte Seziertechnik impliziert eine teilweise Entfernung von Stromgewebe, was zu einer dünneren Hornhautprobe und damit zu einer geringeren stromalen Schwellung führt (Abbildung 1 und Abbildung 2). Weniger stromale Schwellungen induziert weniger Scher- und Prisenkräfte, die einen negativen Einfluss auf das Hornhautendothel haben, wodurch niedrigere Endothelzellverlustraten6verursacht werden. Ges...

Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Herstellung und Kultivierung von Schweinespaltenhornknöpfen vorgestellt. Da dieses organotypisch kultivierte Organkulturmodell innerhalb von 15 Tagen Zellsterblichkeitsraten zeigt, vergleichbar mit menschlichen Spenderhornhäuten, stellt es das erste Modell dar, das eine langfristige Kultivierung nichtmenschlicher Hornhäuten ohne Zugabe von giftigem Dextran ermöglicht.

Ein Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Modell mit Split Corneal Buttons

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for ...

Dieses Protokoll stellt das erste Forschungsmodell vor, das eine organotypische langfristige Kultivierung von hornförmigen Endothelzellen ermöglicht, die mit der Herstellung von gespaltenen Hornhautknöpfen erreicht werden. Durch teilweises Entfernen der äußeren Hornhautschichten wird der Verlust der Endothelzellverlorenen signifikant reduziert, so dass horneale Endothelzellen für mindestens 15 Tage kultiviert werden können. Daher ist dieses Modell wertvoll für die Untersuchung der Auswirkungen bestimmter Substanzen oder Techniken von Interesse wie Bewässerungslösungen oder ophthalmologische viskoelastische Geräte auf das Hornhautendothel.Nach Erhalt von Schweineaugen, die kurz nach dem Tod entfernt wurden, verwenden Sie Augenschere und Colibri Zangen, um alle Orbitaladnexe zu entfernen. Legen Sie fünf bis sechs Augen in fünf Prozent Jod-PBS-Lösung für insgesamt fünf Minuten, um die Augenoberflächen richtig zu desinfizieren, mit sorgfältigem Rühren einmal pro Minute, um sicherzustellen, dass die Oberflächen vollständig untergetaucht sind, um eine vollständige Desinfektion zu erreichen. Nach fünf Minuten die desinfizierten Augen auf eine Tasse reines PBS übertragen und vorsichtig rüh

a-porcine-corneal-endothelial-organ-culture-model-using-split-corneal

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

In diesem Video zeigen wir ein Verfahren zur chirurgischen Isolierung des Hornhautknopfes, um ein ex vivo Schweinehornhautmodell zu generieren. Das Modell ist aufgrund seiner Ähnlichkeit mit dem menschlichen Auge hilfreich für histologische, pathologische und pharmakologische Studien.

Isolierung des Hornhautknopfes: Ein chirurgischer Eingriff zur Gewinnung eines Hornhautknopfes aus dem Auge des Schweins

Dieses Video beschreibt ein Protokoll zur Einrichtung eines ex vivo-Modells für bakterielle Keratitis unter Verwendung eines Hornhautknopfes, der aus dem Schweineauge präpariert wurde. Geimpfte Bakterien durchlaufen die Einschnitte in das Hornhautepithel, um in das darunter liegende Stroma einzudringen und eine Infektion im Hornhautgewebe zu etablieren, die die In-vivo-Infektion nachahmt.

Schweine-Ex-vivo-Hornhautmodell der bakteriellen Keratitis: Eine Technik zur Etablierung einer bakteriellen Infektion in Hornhautepithelzellen

In diesem Video demonstrieren wir die Kultivierungsmethode eines hornhauttragenden vorderen Augenabschnitts aus einem Schweineauge. Dieses Kultursystem dient als experimentelles Modell zur Untersuchung von Augenverletzungen.

Kultivierung des vorderen Augenabschnitts: Eine Methode zur Kultivierung des hornhauttragenden vorderen Augenabschnitts des Schweineauges

Dieses Video zeigt ein nicht-invasives lasergestütztes Verfahren zur selektiven Schädigung der Hornhaut-Endothelzellen im Schweineauge. Das entwickelte ex vivo-Modell der Schädigung von Endothelzellen kann zur Untersuchung von Erkrankungen des Hornhautendothels verwendet werden.

Lasergestützte selektive Ablation von Hornhaut-Endothelzellen von Schweinen: Eine Technik zur Induktion einer fokussierten Schädigung der Hornhaut von Schweinen für ex vivo-Studien

Eine Primärkultur von Rinder Endothelzellen wurde verwendet, um den Mechanismus der Cornea-Endothelzellen-mesenchymale Transition zu untersuchen. Weiterhin wurde eine Ratte Hornhautendothel cryoinjury Modell kornealen Endothel-mesenchymale Transition in vivo zu demonstrieren.

In vitro und in vivo Modelle Corneal Endothelial-mesenchymale Transition zu studieren

Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige dreidimensionale in-vitro- Modell, wo Stromazellen Hornhautzellen und differenzierten neuronalen Zellen zusammen kultiviert werden, bei der Untersuchung und das Verständnis der Wechselwirkungen der beiden Zelltypen zu unterstützen.

Hornhautgewebe Engineering: Eine In-vitro- Modell der Stromazellen Nerv Interaktionen der menschlichen Hornhaut

Ein Protokoll für eine Ex Vivo Hornhaut Orgel Kulturmodells nützlich für Wundheilung Studien beschrieben wird. Dieses Modellsystem kann verwendet werden, um die Auswirkungen von Agenten, regenerative Heilung zu fördern oder Medikamententoxizität in einer organisierten mehrzelligen 3D-Umgebung.

Ex Vivo Wundheilung Hornhaut Orgel Kulturmodells für Studien

Hier stellen wir ein Protokoll zur Ablösung von hornhauten Endothelzellen (CEC) von Descemets Membran (DM) unter Verwendung eines Neodym:YAG (Nd:YAG) Lasers als Ex-vivo-Krankheitsmodell für bullöse Keratopathie (BK) vor.

Entwicklung eines nichtinvasiven, laserunterstützten Versuchsmodells des cornealen Endotheliaalzellverlustes

Dieser Artikel beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Einrichtung eines Ex-vivo-Schweinemodells der bakteriellen Keratitis. Pseudomonas aeruginosa wird als prototypischer Organismus verwendet. Dieses innovative Modell imitiert in vivo-Infektionen, da die bakterielle Proliferation von der Fähigkeit des Bakteriums abhängt, Hornhautgewebe zu schädigen.

Etablierung eines Porcine Ex Vivo Cornea Modells zur Untersuchung von medikamentösen Behandlungen gegen bakterielle Keratitis

Wir beschreiben die Verwendung einer Schweinehornhaut, um die antivirale Wirksamkeit experimenteller Medikamente zu testen.

Porcine Hornhautgewebe Explant, um die Wirksamkeit von Herpes Simplex Virus-1 Antiviralen zu untersuchen

Die ex vivo-Organkultur der Schweinehornhaut und die epitheliale Wundheilung bieten ein wirtschaftliches, ethisches, reproduzierbares und quantitatives Mittel zur Prüfung der Augentoxizität von Chemikalien. Sie helfen auch bei der Aufklärung von Mechanismen, die der Regulation der Epithelisierung und Gewebereparatur zugrunde liegen, sowie bei der Bewertung von Therapeutika zur Behandlung von diabetischer Keratopathie und verzögerter Wundheilung.

Bewertung der therapeutischen und chemischen Toxizität anhand von organgezüchteten Schweinehornhäuten und der Heilung von Epithelwunden

Erfahren Sie die Langzeitkultur kornealer Endothelzellen mit Split-Corneal-Buttons aus porcinen Augen. Diese Methode reduziert den Zellverlust erheblich und ermöglicht Kulturen über mindestens 15 Tage für ophthalmologische Forschung.

Ein Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Modell mit Split Corneal Buttons

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